Bloque 6 Virus (2015)

Apunte Español
Universidad Universidad de Lleida (UdL)
Grado Ciencias Biomédicas - 2º curso
Asignatura Microbiologia
Año del apunte 2015
Páginas 48
Fecha de subida 08/04/2016
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2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV MICROBIOLOGÍA BLOQUE 6. VIRUS Por definición, un virus es la suma de tres propiedades: - Se trata de ENTIDADES SUBMICROSCÓPICAS.
- NO TIENEN ENTIDAD CELULAR (no son células realmente) ya que carecen de estructura celular: no consisten en una membrana plasmática que engloba estructuras y que puede estar, a su vez, compartimentada o no.
- Son PARÁSITOS INTRACELULARES ESTRICTOS ya que debido a su simplicidad celular no pueden multiplicarse y necesitan infectar células para ello.
Diferencias entre bacterias y virus Se ven reflejadas en el siguiente cuadro: Los virus son necesariamente parásitos intracelulares estrictos y la mayoría de las bacterias no lo son (hay muy pocas bacterias parásitas intracelulares). Las bacterias cuentan con una organización celular (son células), mientras que los virus, no. Además, las bacterias sufren un proceso de división binaria para multiplicarse y los virus no se dividen por partición.
Las bacterias tienen al mismo tiempo DNA y RNA, pero los virus solo contienen uno de los dos tipos de ácidos nucleicos. Por otro lado, mientras que las bacterias sí que cuentan con un mecanismo productor de ATP, los virus no y deben utilizar el ATP producido por la célula parasitada.
Además, aunque podemos encontrar bacterias que presenten resistencias a antibióticos, siempre podremos encontrar algún antibiótico que funcione para cada bacteria. En cambio, ningún antibiótico efectivo como inhibidor del crecimiento bacteriano es efectivo contra los virus. En el caso de los virus, es necesario recurrir de los antivirales.
Ahora bien, no todos los virus son más pequeños que las bacterias, ya que podemos encontrar virus (Granulovirus), con un diámetro de aprox. 120-300nm y 300.500nm de largo, de mayor tamaño que las bacterias más pequeñas (micoplasmas, Rickettsias) de unos 200nm de diámetro. Por tanto, la medida pequeña no es definitoria de los virus frente a las bacterias.
EL CICLO MULTIPLICATIVO DE LOS VIRUS A grandes rasgos, podemos dividir el ciclo multiplicativo de los virus en dos etapas: la fase extracelular y la fase intracelular.
La fase extracelular, como su propio nombre indica, se caracteriza por lo localización extracelular del virus. Después se produce la infección de la célula huésped, comenzando la fase intracelular del ciclo que consta de dos procesos: 1 Microbiología - Replicación del ácido nucleico - Síntesis de proteínas víricas A partir de los ácidos nucleicos y de las proteínas recién sintetizadas, se produce el ensamblamiento de los viriones o nuevos virus.
Es importante destacar que se pueden clasificar los virus en función del tipo celular que infectan ya que infectan específicamente tipos de células concretos. Así, podemos encontrar: - Virus vegetales, que infectan células vegetales - Virus animales, que infectan células animales - Virus bacterianos, también conocidos como bacteriófagos o fagos, que infectan bacterias.
Otras entidades infecciosas no celulares Así pues podemos deducir que los virus no son las únicas entidades infecciosas no celulares. Las siguientes entidades también responden a esa definición y tienen características muy similares: VIROIDES: se trata de moléculas de RNA circular de cadena bastante corta (200-400 nt) con estructura secundaria asociadas a ciertas enfermedades de plantas.
VIRUSOIDES: son moléculas de tipo viroide pero de mayor tamaño (aprox- 1000 nt) dependientes de los virus para su multiplicación (satélites). Es decir, para podemos infectar a las células y multiplicarse, debe producirse la coinfección. También presentan estructura secundaria.
PRIONES: son agentes infecciosos consistentes en una sola molécula de proteína sin ácido nucleico acompañante. La proteína es infecciosa, por lo que, de alguna manera tendrá que tener capacidad replicativa en la célula.
RETROTRANSPOSONES: son elementos móviles similares a retrovirus que se replican a través de un intermediario de RNA. Cuando se desplazan de una localización a otra experimentan un cambio estructural: pasan de su forma DNA, que se transcribe a una sola cadena de RNA que, a continuación se convierte en el intermediario de RNA-DNA. De este intermediario se obtiene un DNA de doble cadena.
Estructura básica de las partículas víricas Los virus se encuentran constituidos básicamente por PROTEÍNAS y ÁCIDOS NUCLEICOS. Estos elementos conforman las estructura conocida como NUCLEOCÁPSIDA, que consiste en el ácido nucleico protegido por una cubierta proteica llamada CÁPSIDA. Por tanto, la función celular de la nucleocápsida es albergar a la molécula de ácido nucleico durante la fase extracelular, es decir, tiene un papel protector.
Cada una de las subunidades proteicas que constituyen la cápsida es un CAPSÓMERO. Un capsómero puede ser una sola cadena polipeptídica o bien un grupo de ellas.
En este momento es preciso definir el concepto de VIRIÓN. Una virión es cada una de las partículas víricas entendidas como unidades físicas. Prácticamente, son lo mismo que un virus aunque se suele emplear este término para referirnos a la unidad vírica, mientras que el concepto de virus es más amplio.
Podemos encontrar dos tipos básicos de viriones: - Virus desnudos: consisten únicamente en una nucleocápsida sin envuelta membranosa.
- Virus con envuelta: son aquellos que presentan una nucleocápsida cubierta por una envuelta membranosa. Por tanto, tienen una estructura más compleja.
2 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Entre la envuelta y la nucleocápsida podemos encontrar una espacio que recibe el nombre de MATRIZ y que puede contener proteínas.
La ENVUELTA MEMBRANOSA no es únicamente una membrana lipídica, sino que en ella podemos encontrar proteínas víricas insertadas, que juegan un papel importante en la multiplicación del virus y en el proceso de infección.
Medida de los viriones En la siguiente imagen podemos encontrar esquemas a escala de diferentes virus.
Dentro de estos podemos destacar el virus de la viruela, un virus ya erradicado que llama la atención por su gran tamaño: 200-300nm (se encuentra al límite de lo visible con el microscopio óptico). El virus más pequeño es el bacteriófago, que miden alrededor de 10nm (aprox. la medida del ribosoma). Por tanto, entre los virus más pequeños y los más grades hay una diferencia de x30.
Podemos encontrar diferentes tipos de virus en función de la estructura de su cápsida: Virus con cápsidas helicoidales o virus filamentosos.
Virus con cápsidas icosaédricas Virus complejos 3 Microbiología Virus con cápsida helicoidal o virus filamentosos La estructura de la cápsida de estos virus consiste en un cilindro con un agujero en el centro que contiene la molécula de ácido nucleico. Los capsómeros se disponen helicoidalmente formando el filamento cilíndrico, en cuyo interior se encuentra la molécula de ácido nucleico interaccionando con los capsómeros o capsonas (el ácido nucleico queda fijado al interior de la pared del cilindro). Esta interacción se produce mediante interacciones electrostáticas debido a que el ácido nucleico presenta carga negativa y la/s proteína/s del capsómero, carga positiva, ya que contiene aminoácidos básicos como lisina, glicina e histidina.
Esta estructura es característica de: Muchos virus vegetales (sin envoltura) Bastantes virus animales, que acostumbran a tener envoltura.
Bastantes bacteriófagos que no tienen envuelta (ya que infectan a células con estructura rígida debido a la pared bacteriana).
Un ejemplo de virus filamentoso es el virus del mosaico del tabaco que fue el primer virus en cristalizarse (hay virus que pueden cristalizarse formando estructuras geométricas). Se puede analizar al microscopio electrónico y, como podemos ver en la imagen, presenta un filamento rígido en cuyo interior se encuentra el ácido nucleico.
Otro ejemplo de este tipo de virus es el virus de la gripe, un virus animal con nucleocápsida filamentosa NO rígida dentro de una envuelta membranosa.
Contiene un filamento flexible que se dobla sobre sí mismo.
Virus con cápsidas icosaédricas Un icosaedro es aquella estructura geométrica formada por 20 caras, siendo esta forma más simple de formar una estructura geométrica con una sola o muy pocas proteínas diferentes y con una menor relación superficie/volumen. La baja relación superficie/volumen permite un mayor ahorro energético (hasta cierto punto) ya que se necesitan menos proteínas para formar una cápsida con un gran volumen .
En la interior de esta estructura, por tanto, entra una mayor cantidad de ácido nucleico, lo que conlleva un mayor número de genes. El hecho de contener más genes permite que estos virus presenten funciones propias, por lo que no dependen de la célula huésped.
Además para formar la cápsida solo sería necesario un tipo de proteína para las caras y otro tipo de proteína diferente para las aristas. El caso más simple consiste en un icosaedro formado por 60 subunidades idénticas (20 caras x 30 subunidades/cara).
4 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV En muchos casos, los capsómeros están formados por varias subunidades o protómeros. Como vemos en el ejemplo de la imagen, los capsómeros de los vértices están formados por 5 protómeros y se llaman pentámeros, mientras que los capsómeros de caras y aristas se llaman hexámeros, ya que están formadas por 6 protómeros. Por tanto, en este caso la cápsida está formada por varios genes diferentes.
A partir de esta estructura tan simple se pueden ir añadiendo estructuras adicionales. Es decir, podemos encontrar otros virus icosaédricos con estructuras más complejas, como el adenovirus. A partir de cada vértice del adenovirus salen unas espículas implicadas en la interacción con los receptores celulares (no todos los virus las tienen).
Esta estructura longitudinal es un tipo de proteína que forma un filamento y al final presenta una estructura globular. Estas espículas son importantes ya que, a través de ellas, el virus interacciona con el receptor celular de una célula. Por tanto, estas proteínas marcan la especificidad del virus. Además, la localización de estas proteínas es exterior por lo que se trata de proteínas muy antigénicas (más fácilmente reconocibles por el sistema inmune). Por lo tanto, estas proteínas serán las neutralizadas por los anticuerpos desarrollados por el sistema inmune, que evitarán que se produzca la interacción con los receptores celulares.
Virus con envuelta membranosa Se trata de aquellos virus que tienen una envuelta membranosa sobre la nucleocápsida. La envuelta es una membrana fluida en la que hay proteínas insertadas.
Como ejemplo de virus con envuelta tenemos el virus de la gripe que, como ya se ha explicado anteriormente, es un virus con cápsida helicoidal muy flexible. Entre la nucleocápsida y la envuelta encontramos la matriz, donde se localizan proteínas (normalmente, 1 o 2 tipos).
Por tanto, los virus con envuelta tienen proteínas en tres localizaciones diferentes: las proteínas de la nucleocápsida (que interaccionan con los ácidos nucleicos por interacciones electrostáticas), las proteínas de la matriz (entre la nucleocápsida y la envuelta) y las proteínas que se encuentran insertadas en la envuelta que bien forman canales de trasporte de iones y otras moléculas de pequeño tamaño o bien son proteínas que participan en la infección de la célula.
Las proteínas de la envuelta tienen un dominio transmembrana y un dominio intramembranoso aunque, la mayor parte de la cadena se corresponde con un dominio externo más o menos globular que sobresale hacia el exterior.
Volviendo al ejemplo del virus de la gripe, podemos destacar dos proteínas que se encuentran insertadas en la envuelta: - Hemoglutinina - Neuraminidasa 5 Microbiología Otro ejemplo a destacar es el virus de la varicela herpes Zoster, que podemos observar en la siguiente imagen. Podemos ver la nucleocápsida, la envuelta membranosa y un anillo de protuberancias que se corresponde con la parte externa de las proteínas insertadas en la envuelta.
Algunos virus de animales proliferan dentro de las células y en posible que únicamente la envuelta salga al medio extracelular. Es decir, que salga al exterior de la célula la envuelta vacía, sin nucleocápsida, ni material genético; un virus defectivo que, en este caso, recibe el nombre de VIRUS FANTASMA.
La destrucción de la nucleocápsida y la consiguiente descapsidación del virión, es consecuencia de un cambio en las condiciones físico-químicas. Para que el interior del virión se acidifique se produce la entrada de protones a través de los canales de la envuelta nombrados anteriormente. Cuando aumenta la acidez en su interior, el virión se desestructura y la molécula de ácido nucleico queda libre.
Procedencia de la envuelta membranosa procede de la membrana citoplasmática de la célula huésped que, previamente, ha sido La envuelta membranosa infectada por el virus y es consecuencia del mecanismo de liberación desde la célula infectada. Esto lo vemos representado en el siguiente esquema: podemos ver la membrana de la célula infectada en el interior de la cual el virus se está multiplicando. En el interior de la célula se sintetizan las proteínas del virus que salen de la célula mediante la vía secretora como si fueran proteínas integrales de la célula. Una vez son secretadas, las proteínas se insertan en la membrana citoplasmática de la célula huésped. El proceso de inserción de las proteínas presenta un efecto secundario ya que las proteínas integrales de la membrana de la propia célula son desplazadas hacia los laterales por las proteínas del virus.
El citoesqueleto, junto con otras proteínas, provocan que la membrana se curve. El resultado es un proceso de gemación que termina con la formación de una partícula constituida por una trozo de membrana citoplasmáticas que tiene insertadas las proteínas del virus y contiene la nucleocápsida con el material genético del virus.
En principio, la célula no pierde su integridad física aunque, cuando salen muchos viriones a la vez, la célula no puede lisarse.
Virus complejos Se trata de virus con cápsidas de estructura compleja que no se adaptan a ninguna de las estructuras anteriores. Como ejemplo de estos virus tenemos: - Poxvirus Los más representativos de estos son el virus de la viruela y el virus de la vacuna, que son los más grandes y complejos conocidos.
6 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Estas proteínas tienen una nucleocápsida formada por proteínas que contiene el material genético sobre la cual hay una membrana interna y también una membrana externa. Por tanto, estos virus tienen una doble membrana.
Además, presentan una estructura conocida como cuerpos elípticos o laterales.
- Bacteriofagos En este caso se trata de bacteriófagos de medida elevada, bastantes complejos estructuralmente.
- Geminivirus Se trata de patógenos de plantas que consisten en dos estructuras icosaédricas unidas que comparten una cara. Dentro de cada icosaedro hay una molécula de ácido nucleico diferente (hacen falta los dos icosaedros para tener el material genético al completo).
- Baculovirus Son virus de insectos, que tienen cierta utilidad en el control de plagas de insectos. También se utilizan como vectores de expresión de proteínas en células animales. Constan de varias nucleocápsidas idénticas (2 o 3), independientes entre ellas, es decir, cada nucleocápsida es autónoma desde el punto de vista genético. Envolviendo a las nucleocápsidas encontramos una estructura poliédrica de tipo isosaedro formada por la proteína polihedrina.
7 Microbiología LOS GENOMAS VÍRICOS Los genomas víricos pueden ser de composición y una estructura más variadas que los de los organismos celulares. Las propiedades a considerar son las siguientes: - Tipo de ácido nucleico: DNA o RNA - Presencia de proteínas unidas covalentemente a los extremos 5' y/o 3', que tienen un papel protector y son característicos de los virus animales.
- Ácido nucleico de cadena simple o doble - En el caso de genoma de cadena simple (sobre todo RNA), si este es de tipo + o de tipo -.
Llamamos + a la cadena simple de RNA que es directamente la cadena decodificadora o mensajera. En cambio, si tenemos la cadena complementaria, hablamos de la cadena -.
- Molécula circular o lineal - Si el genoma está o no segmentado, es decir, si está o no en una única molécula.
- Si el genoma es o no discontinuo, es decir, si tienen un trozo de cadena simple y un trozo de cadena doble.
Son el tipo de ácido nucleico, el tipo de cadena (simple o doble) y si es de tipo + o -, las propiedades esenciales para la definición de las familias de virus, junto con las estructura de la cápsida y presencia o no de envuelta.
En la imagen podemos ver un esquema de la clasificación de virus animales. Un virus de RNA de cadena simple RT hace referencia a un retrovirus que, durante su ciclo recombinativo realiza la transcripción reversa es decir, sintetiza una molécula de DNA a partir de una molécula de RNA.
La medida de los genomas víricos abarca desde genomas tan pequeños como 1.7 kb (característicos de los ciclovirus) hasta genomas tan grandes como 800 kb (mimivirus). Existe una correlación entre la medida de la cápsida, el tamaño del genoma y la autonomía funcional del virus. Cuanto mayor es el genoma, el virus tendrá una mayor autonomía.
La SOLAPACIÓN GÉNICA es muy típica de los virus. Consiste en que un mismo par de bases forma parte de dos pautas de lectura diferentes, es decir, 1 gen o ORF en cada cadena. La finalidad de la solapación es el ahorro de información genética, lo que conlleva un ahorro de energía. Como ejemplo del solapamiento tenemos el virus SV-40 (virus tumoral en monos) que solamente tiene 5 genes que codifican para 5 proteínas víricas 8 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Por otro lado, como ejemplo de virus con un extenso genoma tenemos el virus de la vacuna (un poxvirus) que tienen 139 k que incluyen 185 secuencias codificadoras de proteínas en genes muy empaquetados con algunos solapamientos.
Algunos virus contiene más de una copia del genoma empaquetada dentro de las misma cápsida. Por ejemplo el virus del SIDA, que contiene dos copias de RNA unidas por el extremo 5' (el virus tiene dos genomas idénticos). Es decir, en estos casos es como si los virus fueran diploides (aunque no son diploides).
La finalidad de esto es que si aparece una mutación que afecte solamente no tenga ninguna repercusión sobre el virus, ya que tiene otra copia del gen intacta. Por tanto, el virus resulta más estable al disponer de dos copias de cada gen.
Hay virus que tienen el genoma segmentado, es decir, dividido en dos o más fragmentos que se encuentran dentro de la misma cápsida. Por ejemplo, el virus de la gripe, que tiene el genoma dividido en 8 fragmentos, cada uno de los cuales es diferente.
Las ventajas de la segmentación son que hay menor probabilidad de fragmentación física en segmentos pequeños (ya que el RNA de cadena simple es más fácil de romper que el DNA de doble cadena) y que existe la posibilidad de recombinación de fragmentos durante el proceso infeccioso. Si por ejemplo, una célula es coinfectada simultáneamente por dos virus de la gripe con características entéricas diferentes (uno de los genes presenta una mutación que hace que una de las proteínas sea algo diferente) ambos genomas se replicarán y formarán nuevos viriones. Si no son capaces de discriminar, podemos encontrarnos ante una situación de recombinación genética entre fragmentos. La posibilidad de recombinación les dota de una característica evolutiva.
Este es el motivo por el que la vacuna de la gripe es anual.
El principal inconveniente es que es necesario una mecanismo para asegurar la correcta introducción de todos los fragmentos dentro de una misma cápsida, ya que el virus solo es infectivo si presenta los 8 fragmentos (ya que tienen genes diferentes).
MUTANTES VÍRICOS Los genomas víricos pueden mutar, haciendo que cambie la secuencia codificante, que podrá dar lugar a otra proteína funcional ligeramente diferente de la original. Esto nos lleva a la introducción de tres conceptos: - Cepa: hace referencia a cada uno de los aislamientos de un mismo virus, por ejemplo en diferentes localizaciones geográficas o en diferentes enfermos.
9 Microbiología - Tipo: cada uno de los diferentes serotipos de un mismo virus, en función de las características antigénicas de las proteínas de su superficie.
- Variante: un virus con fenotipo diferente al de la cepa salvaje pero en el que no se conocen las bases genéticas de la divergencia.
Una cepa salvaje puede mutar de forma espontánea para dar lugar a una cepa mutante y la frecuencia con la que esto ocurre puede variar si se trata de DNA o de RNA. La frecuencia de mutación difiere porque estas mutaciones se producen por errores de la polimerasa durante el proceso replicativo y las RNA polimerasas son mucho menos fieles que la DNA polimerasa.
Esto no se debe a que la RNA polimerasa se equivoque más sino a que la DNA polimerasa tiene función correctora  detectan la introducción de bases erróneas.
Esto conlleva una elevada diversidad genética de virus RNA debidas a las mutaciones puntuales introducidas por las propias polimerasas víricas. La elevada diversidad lleva a una mayor capacidad evolutiva de los virus (sobre todo los del RNA).
Cabe destacar que el virus del SIDA, por ejemplo, puede evolucionar dentro del propio individuo, lo que tiene una gran relevancia a hora de desarrollar vacunas.
Diferentes tipos de mutantes víricos generados por mutaciones espontáneas o mutaciones inducidas por mutágenos: - Mutantes resistentes a fármacos antivirales  normalmente aparecen cuando una función bioquímica del virus queda alterada por la mutación.
- Mutantes con virulencia alterada. Estos mutantes pueden surgir tras una mutación en una proteína de superficie del virus responsable de la interacción con el receptor, lo que puede conllevar un aumento o una disminución de la virulencia.
- Mutantes en especificidad de huésped. Son las proteínas de superficie del virus las que interaccionan con la célula huésped y, por tanto, son las responsables de la especifidad.
- Mutantes en genes esenciales. Si la mutación cae en un gen esencial, la inactividad de la proteína afectada desencadenará en la inviabilidad del virus.
Si queremos estudiar qué gen vírico resulta esencial para la viabilidad será necesario el uso de mutantes condicionales. Estos mutantes solo son viables a unas condiciones concretas (sensibles al calor, sensibles al frío, mutantes supresores, …), es decir, el virus es viable en unas condiciones concretas mientras que en otras distintas no lo es.
INTERACCIONES GENÉTICAS entre virus Se pueden producir dos tipos de interacciones genéticas entre virus: - Recombinación entre cepas. Se encuentra favorecida, como ya se ha comentado, en el caso de genomas con RNA segmentado. Si imaginamos dos cepas de un mismo virus con el genoma segmentado en trozos (en el esquema el genoma de cada cepa tiene un color distinto). Si estas dos cepas coinfectan una misma célula, ambas se multiplicarán y formarán nuevos viriones. Cada nuevo virión recibirá el material genético recién replicado y si en un virión acaba entrando material genético de ambas cepas (muy similares ya que se trata del mismo virus), podrá haber recombinación. En consecuencia, habrá diferencias genéticas entre la generación filial y la parental. De esta manera aparecen características víricas nuevas.
10 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV - Complementación de virus defectivos Un virus defectivo es un virus mutante en una función esencial que no puede llevar a cabo un ciclo multiplicativo completo. La mutación se manifiesta fenotípicamente y tiene efectos dramáticos independientemente de las condiciones ambientales ya que no se pueden multiplicar.
En principio este virus no podrá mantenerse en la naturaleza aunque esto no es necesariamente así. En caso de coinfección (de una partícula vírica completa y una partícula vírica defectiva) el virus no mutado (que tiene el gen normal) le suministra al virus mutado las funciones que este no tiene.
Así, hablamos del mutante como virus defectivo y del no mutado como cooperador.
INTERACCIONES FENOTÍPICAS entre virus: combinación de fenotipos Como resultado de la coinfección de dos cepas del mismo virus o de dos virus muy similares es que las partículas víricas híbridas formadas pueden acabar expresando antígenos de la otra cepa .
Esto puede acarrear un cambio de la especifidad del huésped o del tipo de células afectadas.
En la imagen podemos ver un esquema de este fenómeno. Tenemos dos cepas de un mismo virus, la cepa A y la cepa B. La diferencia entre ambas cepas es una mutación que afecta a la proteína mayoritaria de la cápsida. Por tanto, ambos virus codifican para proteínas antigénicas diferentes. En caso de coinfección de una misma célula ambos genomas se replicarán y se sintetizarán las proteínas de la cápsida de ambas cepas. Como ambos tipos de viriones se ensamblan al mismo tiempo, es altamente probable que se obtengan viriones con cápsidas mixtas. Es decir, se formarán nuevos viriones que en la cápsida tengan proteínas de ambas cepas  antígenos de ambos orígenes.
Si las proteínas de la cápsida de ambas cepas tienen especifidades diferentes, al producirse estos viriones mixtos, habrá cambiado su especifidad respecto a la célula original (podrán infectar a los dos tipos de células que podían infectar las dos cepas originales)  aumenta el rango de especificidad.
11 Microbiología Tras una segunda infección de alguno de estos virus mixtos, como su material genético no está mezclado (es íntegro de una u otra cepa), los viriones resultantes de esta nueva infección tendrán todas las proteínas de la cápsida de la misma cepa (la cepa del material genético).
Virus satélites Se trata de moléculas de RNA de pequeño tamaño enteramente dependientes de la presencia de otro virus (colaborador) para su multiplicación.
A diferencia de los virus defectivos, el genoma del virus satélite es completamente diferente al del virus colaborador.
Estos satélites infectan principalmente a plantas, pero también los hay asociados a bacteriófagos y a virus de animales..
En principal ejemplo es el caso del virus de la hepatitis delta (D) que se asocia con el virus de la hepatitis B intensificando sus síntomas (el virus D no causa patología por sí solo). El genoma del virus delta está en forma de RNA de cadena simple con estructura secundaria que evolutivamente procede del mismo ancestro común que los viroides.
El virus D no tiene cápsida, por lo que en caso de coinfección, el virus B se la proporciona.
12 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV CULTIVO DE VIRUS Como se trata de parásitos estrictos (los virus no son autónomos) será necesario cultivar las células infectadas por el virus para multiplicarlos. Es decir, no es posible multiplicar un virus en un sistema sin células. Obtener una gran población de virus nos permitirá analizarlo mejor (realizar un mejor análisis bioquímico o genético del virus).
En el caso de los virus que infectan animales, tenemos tres estrategias para cultivar en el laboratorio: 1. Infección en vivo: se inyectan los virus sobre animales susceptibles (en caso de bacterias y plantas también se hace).
2. Membranas de embriones de pollo (6-9 días). La membrana corioalantoidea del embrión de pollo se trata de una membrana constituida por células poco diferenciadas (con múltiples receptores antigénicos) lo que implica que pueden ser infectadas por muchos tipos de virus. Es decir, la especificidad es muy baja.
Normalmente, se inyecta una suspensión del virus sobre esta membrana corioalantoidea de forma que los virus infectan a las células y se multiplican dentro de ellas. Finalmente, se produce la extracción de los nuevos viriones (se obtiene una cantidad de virus mayor a la inicial).
Al cabo de unos días se pueden observar en la membrana corioalantoidea una serie de focos de lesión que se corresponden con la primera célula infectada. A partir de esta primera célula se da una zona de células necróticas (o lisiadas en muchos casos) cada una de las cuales ha sido infectada por una partícula vírica.
3. Cultivo de células. Es el mecanismo más frecuente y utilizado. Se trata de células animales de un determinado origen (fibroblastos, células tumorales, …) con un grado de diferenciación bajo que permite la infección de muchos virus diferentes. Dos tipos: - Cultivos primarios: cultivo de células que proviene directamente de un determinado tejido u órgano y que se pueden mantener durante cierto tiempo si se les suministran los nutrientes adecuados.
- Líneas continuas (es lo más frecuente). Son clones de células que se obtienen en su momento de un tejido tumoral y que se pueden mantener de manera indefinida. Además se pueden ir propagando periódicamente. Si son células poco diferenciadas o desdiferenciadas (como las células tumorales) expresarán muchos receptores en su superficie  pueden ser infectadas por muchos virus diferentes.
Análisis de virus Una vez ha finalizado el proceso de cultivo, obtenemos una mezcla de partículas víricas y restos celulares. Para hacer un análisis bioquímico y molecular de los ácidos nucleicos o bien una electroforesis, una cromatografía o secuenciación de las proteínas, es preciso purificar primero el virus. Es decir, hay que separar el virus de la subestructura celular liberada durante la lisis de la célula (ribosomas, membrana, …). Esto se puede hacer de dos formas: - Centrifugación diferencial: se separan de las estructuras celulares en función de tamaño o peso.
1) Separación de virus y subestructuras celulares de las moléculas solubles. A partir de la suspensión original en la que se encuentran los virus se utiliza la centrifugación a elevada 13 Microbiología velocidad (100.000g) durante un largo periodo de tiempo (1-3 horas). Así, se envían al fondo del tubo prácticamente todas las estructuras subcelulares grandes y pequeñas y en el sobrenadante quedarán las moléculas solubles (lípidos solubles y azúcares).
2) Se suspende este sedimento en un buffer en solución y se centrifuga a baja velocidad (8000-10000) durante poco tiempo (10-20 min). En estas condiciones solo sedimentarán las partículas grandes (restos voluminosos de membranas, núcleos, …) mientras que las partículas pequeñas quedan arriba. Si el virus que se quiere purificar es pequeño quedará en el sobrenadante.
3) Por último se centrifuga e elevada velocidad durante 1-3 horas para obtener el virus.
Por tanto, jugando con las velocidades y los tiempos de centrifugado se pueden separar las partículas víricas del resto de partículas de mayor e incluso de menor tamaño.
- Centrifugación con gradiente de densidad: las estructuras se separan en función de su densidad ya que la densidad del virus es diferente de la densidad de la mayoría de subestructuras celulares.
En la siguiente gráfica el eje de las X indica el coeficiente de sedimentación (S). Como podemos ver, la centrifugación es proporcional a la medida, por lo que un coeficiente de sedimentación alto indica que la partícula en cuestión es grande.
La estructura tridimensional de la partícula también influye en el coeficiente de sedimentación ya que las estructuras globulares tienen una S distinta a las estructuras fibrilares.
En el eje de las Y se representa la densidad (g/ml). La densidad de la mayoría de los virus ronda los 1,5g/ml. Sin embargo, otras estructuras como por ejemplo los ribosomas tienen una densidad algo mayor.
Se ponen en el tubo de centrifugado una serie de capas de soluciones de sacarosa de concentraciones que van desde un 20% (menos denso) hasta un 50% (más denso) creando un gradiente de densidad.
Sobre esto, se pone la suspensión obtenida con los virus y los restos celulares. Si se centrifuga durante un tiempo determinado cada partícula desciende hasta la capa que corresponde a su densidad (a la capa de sacarosa con densidad igual a la de la partícula).
Como los virus pueden coincidir en densidad y medida con otras partículas se juega con los dos factores.
Primero se lleva a cabo una centrifugación diferencial y después se centrifuga en gradiente de densidad para obtener la suspensión pura del virus.
14 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Visualización de las partículas víricas Para observar los virus y analizar su estructura y su forma se emplean técnicas de microscopía electrónica ya que no es posible visualizar los virus mediante microscopía óptica. Como las virus son partículas individualizadas no se pueden realizar cortes (como sí se hace en biología celular) pero se pueden utilizar otras técnicas diferentes a las que conocemos de microscopía electrónica de transmisión. Es posible emplear la microscopía electrónica de transmisión pero tras haber teñido los virus. Tenemos dos opciones para teñir los virus (que no se pueden teñir con colorante normal): 1 - Microscopía electrónica de transmisión con tinción negativa. Consiste en teñir los virus con metales pesados, como acetato de uranilo o fosfotungstato donde el uranilo y el tungstato son átomos de gran tamaño que no dejan pasar los electrones.
La suspensión de virus se pone en presencia de estos metales y estos átomos pesados se colocan recubriendo el virus formando una fina capa alrededor. Al visualizar se observan los virus oscuros.
2 - Microscopía electrónica de transmisión con sombreado.
Se colocan los virus sobre el soporte del microscopio electrónico y se les incide con vapor de metales pesados (como acetato de uranilo) lateralmente (no perpendicularmente). Como se hace la tinción in situ, se provoca un sombreado pero habrá una zona en la que no habrá metales pesados que nos permite observar la sombra de la partícula. Al visualizar al microscopio, los electrones pasarán por la zona que no ha sido cubierta por los metales pesados y se aprecia la sombra de la partícula que nos aportará información sobre las características geométricas del virus. Si hablamos de un virus complejo habrá que repetir este proceso desde varios ángulos.
Cuantificación de las partículas víricas En primer lugar, habría que determinar si queremos conocer la cantidad total de virus o la cantidad de virus que son infecciosos ya que, sobre todo en caso de virus animales, puede ocurrir que haya virus ghost que carezcan de material genético dentro de la membrana.
Métodos físicos: sirven para determinar la cantidad de partículas totales aunque no podremos saber si son infectivas o no.
1. Enumeración de partículas totales por microscopía electrónica . Se coge una suspensión de virus y se tiñen de alguna manera y se coloca un volumen de esta suspensión en el soporte del microscopio para observarlo y contar. Una vez se cuenta el número de virus en ese volumen, se establece una media para el volumen total. Es poco informativo ya que, para conocer la concentración vírica sería necesario conocer el volumen que se coloca en el soporte del microscopio (y es muy difícil saberlo).
Es necesario utilizar bolas de látex como patrón de medida similar a la de los virus. Tenemos una concentración desconocida de virus y una concentración conocida de bolas de látex y mezclamos volúmenes iguales de ambas soluciones. Observamos mediante microscopía electrónica y contamos cuántos virus y cuántas bolas de látex hay. Como la concentración de bolas de látex es conocida, es puede establecer una proporción entre las bolas y los virus que nos permita conocer la concentración vírica.
15 Microbiología 2. Hemaglutinación pasiva. En muchos virus, sobre todo en aquellos que tienen envuelta, algunas proteínas de la envuelta tienen la capacidad de aglutinar hematíes. Esto se debe a que el virus interacciona con las proteínas de la superficie del hematíe. Como un solo virus es capaz de interaccionar con varios hematíes a la vez, el resultado es la formación de grandes agregados de hematíes y partículas víricas. Como estos agregados son muy voluminosos, suelen descender al fondo del tubo en medo líquido. A este proceso se le denomina aglutinación de hematíes o hemaglutinación y se dice que es pasiva porque el eritrocito no ha tenido ninguna actividad directa sino que se trata de un fenómeno físico que tiene lugar en el Eppendorf.
Si ponemos la misma cantidad de hematíes, la cantidad de hemaglutinación dependerá de la cantidad de virus que haya en la suspensión. Partimos de una muestra con una concentración de virus desconocida y hacemos diferentes diluciones (1/2, 1/4, 1/8, …). Se añade a cada tubo la misma cantidad de hematíes y comprobamos hasta qué dilución hay suficientes virus como para que sean capaces de aglutinar los hematíes. Podemos detectar cuál es la máxima dilución que permite detectar todavía la hemaglutinación (los pocillos quedan rojos). Si la concentración de virus es baja, bastará con diluir poco para que ya no se puedan ver los efectos de la hemaglutinación. Si la concentración original es alta, habrá que diluir mucho más.
El título del virus es el inverso de la máxima dilución que permite ver la hemaglutinación . Si esta dilución es, por ejemplo, de 1/2, el título es de 2.
Se trata de un método semicuantitativo ya que obtenemos un valor de título, no una concentración de virus. A partir de estos datos nos será posible hacer una comparación entre muestras obtenidas de varios pacientes, por ejemplo (información comaparativa).
Métodos biológicos: permiten contar las partículas víricas infectivas.
1. Recuento de lesiones en tejidos animales (embriones) o vegetales. En el caso de tejidos animales, podemos inocular un determinado volumen de virus sobre las células. Cada partícula vírica infectará una célula y la destruirá y la infección se propagará a las células vecinas  aparecerá una zona necrótica. Contando el número de lesiones, se pueden conocer el número de partículas víricas y podremos conocer la concentración.
En los vegetales ocurre igual. En la hoja de la imagen podemos ver pequeñas lesiones que se corresponden a la infección del virus.
2. Cultivos en placas celulares (medición de partículas infecciosas). Se lleva a cabo en el laboratorio.
A partir de la suspensión de partículas víricas se realizan diferentes diluciones. Se coge un volumen de cada una de las diluciones y se añade a un cultivo de células que se encuentran creciendo in vitro (en monocapa). Una partícula vírica infecta a una célula y, a partir de aquí, la infección se va propagando a las células vecinas. Al final tenemos en la placa una zona de no crecimiento o placa de lisis.
16 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Si se cuenta el número de placas de lisis (cada una de las cuales se debe a una infección inicial) podemos conocer la concentración vírica inicial.
Los virus infectivos se definen como pfu o unidades formadoras de placas de lisis (plate forming unit).
Hay casos de virus animales que no lisan las células. En estos casos no será posible ver a simple vista la placa de lisis y para ello será necesario realizar una tinción vital (solo se tiñen las células vivas) para distinguir aquellas células vivas de las muertas (que son las que han sido infectadas por los virus).
BACTERIOFAGOS Se trata de los virus que infectan bacterias. Para su clasificación se tienen en cuenta los siguientes criterios: - Características del ácido nucleico: DNA o RNA, cadena simple o doble (Podemos encontrar cuatro tipos).
- Morfología de la cápsida: icosaédrica, compleja, … La mayoría de los bacteriófagos suelen ser DNA de doble cadena. En cuanto a la morfología, encontramos fagos icosaédricos sin cola, fagos con cola contráctiles, con colas no contráctiles y filamentosos.
Hay que destacar que NO encontramos fagos con envuelta membranosa ya que las bacterias tienen una pared sobre la membrana lo que implica que no pueda producirse el proceso de evaginación.
Ciclo lítico de un bacteriófago La mayoría de las veces, la bacteria infectada por el fago muere por lisis. El ciclo lítico del virus se divide en las siguientes etapas: 1) Adsorción: en primer lugar el virus debe interaccionar con el receptor de membrana de la bacteria.
2) Penetración. Las bacterias tienen una pared rígida por lo que solo penetrará en el interior el ácido nucleico del virus.
3) Síntesis de ácidos nucleicos 4) Montaje y ensamblaje de los nuevos viriones 5) Liberación por lisis de la bacteria.
17 Microbiología Curva de multiplicación en un paso (one step growth) La cinética de replicación de un bacteriófago durante la infección se puede representar en una gráfica como la de la imagen en la que se representa la cantidad de virus en función del tiempo. El bacteriófago infecta a la bacteria a tiempo 0. A partir de este momento comienza un periodo de tiempo en el que el número de partículas víricas no aumenta.
Durante este tiempo, conocido como periodo de eclipse, el virus se está replicando en el interior de la bacteria.
Por tanto, el periodo de eclipse (15-20 min) es el tiempo que transcurre entre el momento de la infección y la formación de nuevos viriones. Durante este periodo las partículas con identidad vírica desaparecen (solo hay material genético). El periodo de latencia (30 minutos) es el periodo que transcurre desde que se da la infección hasta que las partículas formadas salen de la bacteria por lisis. Por tanto, la fase de latencia se incluye dentro del periodo de eclipse.
Por cada virus que infecta se forman x virus nuevos. A esto se le llama tamaño de explosión (burst size). Podemos decir que, más o menos, se forman alrededor de 100 virus por cada virus infectante.
Ciclo lítico de un bacteriófago de estructura compleja: el virus T4 (DNA de doble cadena) 1) Adsorción Las proteínas "tall fibers" del virus interaccionan con los receptores de la superficie bacteriana. Los bacteriófagos utilizan como receptores componentes de la superficie bacteriana importantes para la viabilidad de las bacterias como el lipopolisacárido, las porinas, permeasas, ácidos teitoicos, … Cada virus utiliza una estructura específica.
El virus T4 es un virus de cápsida icosaédrica elongada que tiene como especificidad infectar a la bacteria Eschericha Coli y utiliza como receptores los lipopolisacáridos.
2) Penetración Se trata de un proceso complicado debido a la rigidez de la pared bacteriana. La estructura del T4 es compleja ya que tiene una cola retráctil que, tras la interacción del virus con los receptores, actúa como jeringa. La contracción de la cola provoca que la molécula de ácido nucleico salga disparada al 18 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV interior del citoplasma. Para que esto ocurra, el virus tiene en su cápsida una enzima que actúa como lisozima cuya diana es la pared bacteriana. La lisozima degrada el peptidoglicano (rompe los enlaces entre NAM y NAG) produciendo agujeros en él por los que entra el ácido nucleico. Además, esta enzima también induce una reestructuración de las proteínas de la bacteria que acaban formando un poro de paso. Este es un proceso muy rápido.
3) Síntesis del ácido nucleico y de las proteínas Se trata del paso más complejo. En primer lugar, antes de que comience la síntesis de proteínas víricas, se produce la replicación.
Aproximadamente, tras 15-20 minutos se empiezan a formar nuevos viriones (periodos de eclipse) y, alrededor del minuto 25 las bacterias liberan los nuevos viriones (periodo de latencia).
Por cada bacteria infectada, en el caso del bacteriófago T4 se pueden liberar 100 nuevos viriones infectivos (medida de explosión).
En el caso del T4, se suelen expresar 3 tipos de genes (early, middle y late) secuencial y controladamente. Primero se expresan los genes early que, gracias a los mecanismos de síntesis ribosomal de la célula huésped, da lugar a las proteínas early. Después ocurre lo mismo con los genes middle y, por último, con los genes late.
Los genes del T4 están agrupados en función del tiempo en el que se expresan: - Los genes early o tempranos codifican para nucleasas, DNA polimerasas, factores (necesarios para la replicación de ácidos nucleicos).
- Los genes middle o medianos codifican para las primeras proteínas estructurales.
- Los genes late o tardanos codifican para proteínas estructurales como las de la cápsida, el tallo, … 19 Microbiología El bacteriófago es capaz de regular esta expresión temporalizada.
En la imagen podemos ver la estructura de la RNA polimerasa bacteriana, más simple que la eucariota. Consta de 5+1 subunidades. La estructura básica de la polimerasa es la enzima core, formada por 2 subunidades α, 2β y una subunidad ω (omega). Sobre esta estructura básica se pueden unir diferentes subunidades como σ (sigma) que es variable (puede haber más de una variante dentro de la misma célula). El tipo de subunidad σ marca la especificidad de la polimerasa por el promotor (en función de ésta reconocerá un promotor concreto).
Cuando el fago infecta a la bacteria, el virus tiene que empezar a expresar los genes early, pero, como no cuenta con toda la maquinaria que necesita, tendrá que utilizar la maquinaria de la célula huésped (como la RNA polimerasa bacteriana).
Entre los genes early hay uno que codifica para la enzima ADP-ribosilasa que ribosila (añade grupos ADP-ribosa) a las subunidades α de la RNA polimerasa bacteriana. Así, la RNA polimerasa cambia de especificidad y reconoce a los promotores de los genes middle.
Aunque la mayoría de los genes middle codifica para proteínas de la cápsida, hay uno que codifica para una subunidad σ que sustituirá a la subunidad σ bacteriana y provocará el desplazamiento de la RNA polimerasa hasta los promotores de los genes late del virus.
4) Ensamblamiento y liberación de los bacteriófagos Se trata de un proceso secuencial en el que tienen gran importancias las proteínas scaffold (proteínas de andamio), presentes en el ensamblaje de proteínas que desaparecen siempre una vez las proteínas están ya montadas. Es decir, pueden actuar como chaperonas permitiendo un ensamblaje adecuado.
Una vez se han formado todos los componentes se forman los viriones de forma secuencial en tres procesos paralelos: - Ensamblaje de las proteínas de las fibras - Ensamblaje de las proteínas del tallo - Ensamblaje de la cabeza icosaédrica. Durante este proceso se reconoce y engloba una molécula de ácido nucleico en la cápsida. El empaquetamiento del DNA implica introducir unos 500µm de DNA en una cavidad de 0,1mm de diámetro.
El DNA del virus (recién sintetizado) está formado por diferentes genomas completos e iguales unidos físicamente en tándem (concatémeros). En el momento de introducir un genoma dentro de la cápsida de cada nuevo virión, el extremo de este genoma es reconocido por una proteína de la cápsida que induce la entrada del genoma dentro de ella hasta que no entre más.
20 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV En este momento actúa una endonucleasa dejando otro extremo libre y entonces el genoma irá entrando en otra cápsida. Por tanto, la encapsidación es regulada en función del tamaño.
Dentro de cada virión entra el 102% del genoma, de modo que todos tendrán los mismos genes y un 2% del genoma repetido. Al introducirse este 2%, el lugar del inicio y el final del genoma en cada virión variará.
Los nuevos viriones constan de enzimas que intervienen y facilitan la liberación. El T4 sintetiza una endolisina encargada de la degradación del peptidoglicano y una holina, que es una fosfolipasa que hace agujeros en la membrana bacteriana.
Por tanto, estas enzimas alteran la estructura de la membrana plasmática y de la pared bacteriana permitiendo que salgan los nuevos viriones.
Ensamblaje de la cabeza icosaédrica Ensamblaje de las proteínas del tallo Ensamblaje de las proteínas de las fibras Lisogenia: bacteriófago lambda Hay algunos virus que, en lugar de llevar a cabo un ciclo lítico, realizan un ciclo lisogénico. Llegados a este punto, es necesario definir algunos conceptos: - Lisogénia: Proceso en el cual una vez que el virus ha infectado a la bacteria, integra su genoma en el genoma bacteriano y se replica como parte de esta. NO produce lisis.
- Ciclo lisogénico: Ciclo que implica el establecimiento del estado lisogénico por parte del virus y que puede revertir al ciclo lítico.
- Fago atenuado: Tipo de fago que puede establecer un ciclo lisogénico como alternativa al ciclo lítico.
- Bacteria lisogénica: Bacteria en la cual se ha integrado el genoma del fago.
- Profago: Genoma del fago integrado en el genoma bacteriano.
- Inducción: Paso del ciclo lisogénico al lítico. Puede darse por estímulos exógenos como radiaciones UV.
21 Microbiología Fago lambda Se trata del fago atenuado más estudiado que utiliza como bacteria huésped a la Escherichia Coli. Estructuralmente es un fago con cápsida icoseádrica con cola no contráctil.
El interior de la cápsida contiene DNA bicatenario lineal con extremos cohesivos (conocidos como región cos). Las regiones cos consisten en una secuencia de cadena simple de 12 bases.
Ambos extremos son complementarios, por lo que son cohesivos y entre ellos se encuentra el genoma del virus donde caben aproximadamente 40 genes agrupados por función.
El fago lambda utiliza como receptor una proteína de transporte de maltosa de la membrana externa de la E. Coli. Una vez se ha inyectado el DNA en el interior de la bacteria, se circulariza gracias a los extremos cohesivos.
Dependiendo de las condiciones del medio el virus entrará en ciclo lisogénico (cuando el medio sea pobre en nutrientes) o en ciclo lítico (en caso de que el medio sea rico en nutrientes).
En el siguiente esquema vemos representado el genoma del fago lambda circularizado. Podemos ver cómo los genes early se encuentran agrupados y también lo están los middle y los late.
Que el virus entre el ciclo lítico o lisogénico se regula por competencia entre los genes:  Si se expresan más los genes cro, N y Q el virus entrará en ciclo lítico.
 Si se expresan más los genes cI, cII y cIII el virus entrará en ciclo lisogénico. Es el cI el gen principal para el comienzo del ciclo lisogénico ya que codifica para una proteína represora que reprime los genes implicados en la replicación y síntesis de las proteínas de la cápsida, que son esenciales para el ciclo lítico.
Además, el genoma del fago lambda tiene una región de aproximadamente 10 kb que no es esencial para ninguno de los dos ciclos. Por tanto, esta región puede ser eliminada por ingeniería genética y sustituirla por DNA heterólogo con otros genes que nos puedan interesar. Así, podemos usar el fago lambda como vector de clonación.
22 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV lisogénica, se produce por la vía recombinación homóloga la integración cromosómica Si continúa del genoma del fago en un lugar fijo del cromosoma E. Coli.
Para que se produzca este paso se necesita la enzima integrasa del fago.
La región att (attachment o región de integración) del cromosoma del fago presenta cierta homología con la región BB' de la bacteria E. Coli localizada entre dos oprerones (galactosa y biotina).
Una endonucleasa (corta la región PP' vírica) y una ligasa participan en la integración del genoma obteniéndose como resultado PB' y P'B.
De este modo, quedará un gen vírico integrado entre los operones (profago). Este profago puede ser estable pero de forma espontánea puede liberarse, proceso conocido como liberación o activación del profago catalizado por endonucleasa y favorecida por determinados factores (mutágenos químicos, radiaciones…). Para que el profago sea estable se requiere una síntesis constante de una proteína que reprima los genes líticos (genes de replicación) mencionados anteriormente.
Por tanto, la lisogenia es un estado reversible. La luz UV, mutágenos químicos… inducen la acción proteasa de RecA de E.Coli que reconoce al represor expresado por el gen cI y lo degrada, induciendo el ciclo lítico.
La transducción especializada de los genes bacterianos tiene una gran importancia, ya que a veces el proceso de desintegración del genoma vírico es anormal y no se da en el lugar exacto. De este modo, puede incluir uno de los operones de la bacteria junto con el genoma vírico. Por tanto, cuando este virus infecte otras bacterias y se inserte en su genoma, le dará también unos genes bacterianos. Hay que tener en cuenta que el virus será infectivo siempre y cuando lleve su genoma.
Conversión lisogénica o fágica Consiste en el cambio de las propiedades fenotípicas de las bacterias una vez son lisogenizada por un profago. A continuación tenemos algunos ejemplos: - Las cepas lisogenizadas son inmunes a la superinfección por otros viriones del mismo tipo , es decir, una bacteria infectada por el fago lambda no puede volver a ser infectada de nuevo por lambda ya que se producen cambios en la estructura de los receptores de superficie. El virus codifica para ciertos cambios estructurales, sobre todo a nivel de receptores de superficie lo que produce que estos receptores sufran cambios  inmunidad de superinfección.
- Las cepas lisogénicas infectadas producen diversas toxinas bacterianas .
Toxina diftérica (Corynebacterium diphteriae, fago β).
Toxina botulínica (Clostridium botulinum, fago C1).
Enterotoxinas de Staphilococcus aureus (diversos fagos).
- Otros factores de virulencia producidos por cepas bacterianas lisogenizadas : Superóxido dismutasa por E.coli O157: Es un serotipo muy infeccioso. La SOD detoxifica los radicales superóxidos. Los fagocitos producen elevadas cantidades de ROS y por ello (entre otras cosas) son resistentes.
23 Microbiología Hialuronidasa por Streptococcus pyogenes: Enzima que degrada el ácido hialurónico, componente de la matriz extracelular. De este modo, esta bacteria será más invasiva en los tejidos.
Estreptodornasa por Streptococcus pyogenes.
Adhesina por Vibrio cholerae: Para que esta bacteria colonice la mucosa intestinal, primero tiene que expresar moléculas capaces de interaccionar con el epitelio intestinal, las adhesinas.
De esta manera, los fagos tienen un papel importante en la síntesis de factores de virulencia bacterianos y su transmisión horizontal.
VIRUS DE ANIMALES Se trata de los virus que infectan células animales y presentan una gran variedad morfológica y genética.
En función de los siguientes criterios se establece su clasificación en familias: - Tipo de ácido nucleico: RNA o DNA - Número/tipo de cadenas: simple o doble, dsRNA codificante o ssRNA no codificante.
- Morfología de la cápsida: icosaédrica o helicoidal - Presencia de envoltura membranosa.
Esquema general de la multiplicación de los virus de animales 1.- Adsorción 2.- Penetración y descapsidación 3.- Replicación de ácidos nucleicos 4.- Síntesis de proteínas 5.- Ensamblaje de nucleocápsidas 6.- Liberación Además, las cinéticas de las infecciones animales guardan cierta similitud con las de los fagos ya que también nos permiten aplicar los conceptos de fase de eclipse, periodo de latencia y medida de explosión.
- La fase de eclipse y el periodo de latencia son más largos que en los fagos (en los que dura 1 hora como máximo). Por ejemplo, en el virus de la rabia dura de 3 a 4 horas mientras que en el poraximovirus esta fase dura de 5 a 10 horas.
- La medida de explosión es más grande: por ejemplo, la del retrovirus es de 1000 y la del virus de la rabia de 100000, mientras que en el caso de los fagos es de 100.
24 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV - Se producen muchos nuevos viriones pero muchos de ellos son defectivos ya que, o bien no tienen material genético o no carecen de envuelta o les falta alguna de la proteína de la cápsida.
Ciclo mutliplicativo 1) Adsorción La especifidad de los virus viene determinada por los receptores específicos de la superficie celular ya que interaccionan con algunos componentes superficiales del virus. Algunas de estas moléculas de la superficie celular son las siguientes: - Proteínas Por ejemplo los poliovirus interaccionan con las ICAM (moléculas de adhesión intracelular de la familia de las Ig). Determinados tejidos expresan una mayor cantidad de estas ICAM lo que los hace más susceptibles a ser infectados por el poliovirus (estos tejidos son por ejemplo nasofaringe, intestino y médula espinal cuya infección causa parálisis).
Otro ejemplo son las proteínas CD4 expresadas por los linfocitos T4 que son utilizadas por el VIH (que solo infecta a los linfocitos CD4+).
- Cadenas polisacarídicas de glucoproteínas. Por ejemplo, el virus de la gripe utiliza glicoproteínas como el ácido siálico.
2) Penentración y descapsidación Una vez se ha establecido la relación entre el virus y su receptor se produce la penetración y, posteriormente, la descapsidación. Hay tres opciones: - Penetración y descapsidación simultáneas. Es un proceso poco frecuente y muy rápido. El virión interacciona con los receptores de superficie y el ácido nucleico del virus entra en el interior de la célula. Por tanto, la cápsida queda fuera (descapsidación).
- Fusión de la envuelta del virión con la membrana plasmática Es frecuente en virus con envuelta membranosa. En primer lugar se produce una interacción entre un receptor de la superficie celular y un componente de la envuelta membranosa y se fusionan las dos membranas (la vírica y la plasmática). Así, los componentes de la membrana del virus pasan a formar parte de la membrana celular. Los componentes del virus, dentro de su cápsida, quedan dentro del citoplasma pero, para que se repliquen los ácidos nucleicos es preciso que se degrade la cápsida 25 Microbiología normalmente gracias a las proteasas de la propia célula. Un virus que lleva a cabo este tipo de descapsidación es el virus del SIDA.
- Entrada por endocitosis. Este mecanismos es empleado por virus con y sin envuelta aunque los virus sin envuelta acostumbran a entrar de este manera. Alguno de los componentes de la cápsida o de la envuelta del virus interacciona con los receptores de la célula lo que provoca una alteración del citoesqueleto de la célula y activa la formación de vesículas recubiertas de clatrina.
En los casos de virus con envuelta, toda la partícula vírica es endocitada por lo que tenemos la membrana del propio virus y la membrana de la vesícula. Si hablamos de virus sin envuelta, solo es endocitada la nucleocápsida.
El pH de la vesícula produce cambios estructurales y la salida del virión al citoplasma. En muchos casos, es el propio virus el que promueve los cambios de las condiciones en el interior de la vesícula. Por ejemplo, promueve la entrada de protones, lo que conlleva la acidificación del compartimento membranoso (es lo que ocurre con el virus de la gripe). La acidificación provoca una fusión de la membrana interna y la externa, de manera que la nucleocápsida salga al citoplasma. En otros casos se produce de forma diferente aunque siempre es un cambio físico-químico el que induce la liberación de la nucleocápsida.
Una vez la nucleocápsida está en el citoplasma, se produce la proteólisis de sus proteínas gracias a la enzima proteasa  se libera el material genético.
3) Replicación del DNA, síntesis proteica y ensamblaje de los viriones Se trata del paso más complejo y es realizado de forma diferente por cada grupo de virus (cambia el ácido nucleico, etc.). La replicación del ácido nucleico y la síntesis de proteínas se producen de manera simultánea. Podemos dividir los virus en 7 grupos: Grupo i. Virus con DNA bicatenario Dentro de este grupo podemos encontrar dos subgrupos: Por un lado tenemos el adenovirus, poliomavirus, papilomavirus y herpesvirus. Estos son virus complejos aunque dependen de la DNA o la RNA polimerasa de la célula huésped lo que implica que deben desplazarse al núcleo de esta para la replicación.
El mecanismo de replicación de estos virus es muy similar al de las células animales -replicación semiconservativa. Aunque replicación y síntesis de proteína se dan en paralelo, la replicación se da de manera secuencial.
26 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV El ciclo de estos virus es un ciclo lítico. En primer lugar, el virus penetra dentro de la célula, se libera la nucleocápsida y, posteriormente, la molécula de ácido nucleico. El DNA entra en el núcleo, donde se replica en forma de DNA concatemérico.
La RNA polimerasa (celular) transcribe el DNA a mRNA que es transportado al citoplasma. En el citoplasma, los ribosomas celulares sintetizan las proteínas víricas a partir de estos mRNA. Estas proteínas vuelven al núcleo donde se ensamblan los nuevos viriones que, gracias a las vesículas secretoras, son transportadas hasta la superficie celular.
Este proceso implica la muerte de la célula infectada ya que, el proceso de síntesis de los ácidos nucleicos y proteínas víricas implica la inhibición de las proteínas de la propia célula (hasta que el virus no termina de sintetizar sus proteínas la célula no vuelve a sintetizar las suyas propias).
Esto puede provocar la muerte necrótica de la célula.
Como ya hemos dicho, las proteínas se sintetizan de forma secuencial, pudiendo encontrar tres tipos de proteínas diferentes en función del momento en que se sintetizan: - Proteínas inmediatas: son las primeras que se sintetizan. Suelen ser factores de transcripción del propio virus necesarios para la expresión del resto de genes. Son reguladores positivos.
- Proteínas matineras o early proteins: la mayoría de ellas son protéinas reguladoras implicadas en el proceso de replicación. Dentro de este grupo también podemos encontrar las primeras proteínas estructurales (como las proteínas de la matriz).
- Proteínas tardanas o late proteins: son las últimas en ser sintetizadas. La mayoría son proteínas estructurales.
Como hemos dicho, dentro de los virus con DNA bicatenario hay dos subgrupos. El segundo grupo es en el que se encuentran los poxvirus. Estos son más grandes y muy complejos y codifican para sus propias polimerasas. Por tanto en este caso, la transcripción y la replicación no dependen de los mecanismos celulares, lo que implica que se pueden multiplicar en el citoplasma (el traslado al núcleo no es necesario).
Grupo V. Virus con RNA de cadena simple de tipo (-) Como ejemplo de este grupo de virus tenemos el virus de la gripe, que forma parte de la familia de los ortomixvirus. Estos virus tienen el genoma segmentado - el virus de la gripe tiene 8 segmentos de DNA de diferentes medidas. Como no son autónomos, parte de la replicación de estos virus tiene lugar en el núcleo celular.
El virus de la gripe penetra en la célula por endocitosis mediada por clatrina, proceso durante el cual se forma una vesícula con doble membrana. Gracias a cambios físico-químicos en el interior de la vesícula (acidificación) se produce la descapsidación.
27 Microbiología Para que puedas sintetizarse las proteínas, es necesario que el RNA (-) pase a ser RNA (+) complementario. Esta conversión la sintetiza en el núcleo una RNA polimerasa RNA dependiente. La cadena (+) debe ser procesada: se eliminan los intrones y se introduce el capuchón en el 5' (capping).
Todos estos procesos son catalizados por enzimas de la célula huésped ya que el virus no lo puede hacer de manera autónoma.
Las cadenas procesadas y maduras son transportadas al citoplasma donde, gracias a los ribosomas de la célula, se sintetizan las proteínas víricas. El ensamblaje de los viriones se produce en el citoplasma y en la membrana plasmática.
Grupo VI. Virus con RNA de cadena simple (+) con transcripción reversa Ejemplos de estos virus son el retrovirus VIH (HIV-1 o virus del SIDA de tipo 1), HTLV (virus de la leucemia de células T).
El virus del VIH-1 tiene las siguientes características estructurales: - Consta de dos copias idénticas del genoma (RNA de cadena simple).
- Nucleocápsida con las siguientes proteínas: Proteínas estructurales p27, p17, p9 y p7 (que forman la estructura de la cápsida) Transcriptasa reversa Integrasa Al tener ya incorporadas estas enzimas, no es necesario que la partículas víricas las sinteticen al penetrar en la célula Proteasa - Envuelta membranosa con las proteínas gp120 y gp41 insertadas Mecanismo de multiplicación del VIH En primer lugar, la partícula vírica interacciona con los receptores celulares mediante la proteína gp120. En concreto gp120 interacciona con la proteína CD4 presente en los linfocitos T helper (que son las células afectadas por el VIH).
Tras esta interacción se produce la fusión entre la membrana vírica y la celular gracias a la proteína gp41 (proteína de fusión).
28 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV A continuación se produce la descapsidación y la liberación del genoma del virus. El RNA del virus (de cadena simple) contiene las regiones R y U5 en el extremo izquierdo y las regiones R y U3 en el extremo de la derecha.
Después, en el citoplasma, el RNA de cadena simple se convierte en DNA de doble cadena mediante la enzima transcriptasa reversa. Durante este proceso la enzima sintetiza en primer lugar un intermediario DNA-RNA a partir de cual se sintetiza DNA de doble cadena.
Al final, la molécula de DNA de doble cadena que se acaba de sintetizar tiene ambos extremos iguales (U3 R U5 o región LTR o Long Terminal Repeat).
El objetivo del virus es integrar su DNA en el genoma celular, proceso llevado a cabo por la integrasa del virus (que se encontraba en la cápsida), resistente a las proteasas celulares. La integración se puede producir en cualquier lugar del genoma.
El DNA bicatenario vírico con las regiones LTR penetra en el núcleo celular y se integra en diferentes regiones no fijas del genoma convirtiéndose en provirus. El virus puede mantenerse en forma de provirus durante un tiempo indefinido o puede reactivarse. La reactivación implica que, a partir del genoma del provirus y gracias a factores de transcripción de la célula huésped, se sintetizan moléculas de RNA y proteínas víricas a partir de una región promotora localizada en el LTR de la izquierda. Este promotor es reconocido por la RNA polimerasa.
Las moléculas de mRNA que se sintetizan son transportadas al citosol para formar las proteínas víricas que, como ya se ha explicado, son las proteínas extructurales y de la envuelta, la transcriptasa reversa, la integrasa y la proteasa.
El último paso del proceso de multiplicación es la formación de nuevos viriones, que salen de la célula infectada en un proceso de evaginación.
Este mecanismo es extrapolable a todos los retrovirus.
A continuación, vamos a explicar la importancia de la proteasa en la síntesis de las proteínas víricas En mRNA de un retrovirus tiene CAP 5' y cola poli A entre los que se localizan todos los genes del virus. Dentro de esta región génica podemos distinguir tres regiones que corresponden a los genes básicos que tiene todo retrovirus: - GAG: contiene los genes que codifican para las proteínas de la cápsida y para la proteasa entre otras.
- POL: genes que codifican para proteínas implicadas en la replicación del ácido nucleico.
- ENV: genes que codifican para las proteínas de la envuelta.
A partir de la molécula de mRNA pueden ocurrir dos cosas: 1. El mRNA NO es procesado Los ribosomas lo reconocen en el CAP 5' como un RNA ya maduro. Se sintetiza una proteína polipeptídica a partir de la región GAG, precursora de muchas proteínas maduras. Una proteasa vírica, que reconoce secuencias específicas, corta por cuatro lugares formando cuatro proteínas de la cápsida maduras y una proteasa.
29 Microbiología Una vez se ha terminado de traducir la región GAG, los ribosomas pueden parar en la región de STOP y saltar, con lo que solo se obtendrían las proteínas de GAG, o bien puede saltarse el STOP (entre las regiones GAG y POL) y continuar traduciendo el mRNA hasta el final de la región POL. En este segundo caso, los ribosomas traducen la proteína híbrida GAG-POL hasta que encuentran el siguiente codón de STOP y no se traduce la región ENV.
Esta proteína híbrida madura por la acción de una proteasa, proceso tras el cual se obtienen 7 proteínas: - De la región GAG se obtienen las 4 proteínas de la cápsida y la proteasa.
- Las proteínas de la región POL son la transcriptasa reversa (RT) y la integrasa (IN), que harán que el nuevo virión sea infectivo.
2. El mRNA ES procesado Se obtiene un RNA pequeño como resultado de un procesamiento intrónico en el que se han fusionado las regiones CAP 5' y ENV. De esta manera, se eliminan las regiones GAG y POL que se encuentran entre medias.
Al traducirse este mRNA, se sintetiza una poliproteína que es procesada por la proteasa. Tras este procesamiento se producen las dos proteínas de la envuelta: gp120 y gp41.
Por tanto, la expresión de proteínas del retrovirus implica el procesamiento alternativo de los mRNA y el procesamiento de las proteínas precursoras mediante las proteasas víricas.
Para inhibir la replicación del VIH se pueden emplear antirretrovirales que tengan como diana la retrotranscriptasa. Si se inhibe esta enzima ya no se producirán ni los pasos iniciales ni se integrará el DNA en el genoma de la célula huésped.
También es posible utilizar inhibidores de la proteasa que impiden la maduración de las proteínas y, por tanto, la formación de nuevos viriones.
30 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Resumen del lugar de multiplicación de los virus animales  - Los virus DNA replican el ácido nucleico en el núcleo porque necesitan la DNA polimerasa nuclear para replicar su DNA (excepto los que codifican para su propia DNA polimerasa, que replican en el citoplasma).
- Los virus de RNA replican el ácido nucleico en el citoplasma ya que tienen su propia RNA polimerasa que copia su RNA (excepto como en el caso del virus de la gripe, que necesitan enzimas procesadores de los mRNA víricos del huésped para la adición del CAP, procesamiento intrónico… lo harán en el núcleo).
- Los nuevos viriones se suelen formar en el lugar donde se ha dado la replicación del material genético, es decir, el lugar de ensamblamiento de las nucleocápsidas es paralelo al lugar de síntesis de los ácidos nucleicos (aunque hay excepciones).
4) Liberación Una vez se han formado los nuevos viriones se produce su liberación.
La liberación en los casos de virus SIN envuelta supone en la mayoría de casos la lisis de la célula infectada.
En cambio, en los casos de virus CON envuelta se puede producir un proceso de gemación, que no causa la destrucción inmediata de la célula infectada. Se forma una gema de la que sale el virus pero es posible reformar la membrana citoplasmática por lo que continúa la actividad celular. Por ejemplo, el virus de la gripe.
Muchas veces la célula acaba muriendo ya que deja de sintetizar su propio material genético y sus proteínas.
En el caso del virus de la gripe la liberación se produce de la siguiente forma: En primer lugar, el virus se mueve hacia la superficie. Los filamentos de actina pueden participar activamente en el movimiento citoplasmático de la nucleocápsida.
Las proteínas víricas migran hacia la membrana citoplasmáticas y se produce la exclusión de las proteínas de la célula huésped de la región de membrana emergente . Habrá una zona de la membrana en la que solo habrá proteínas víricas y, es en esta región en la que se produce la gemación del virus.
Se produce una evaginación y los nuevos viriones ya se localizan en el exterior de la célula.
31 Microbiología La membrana citoplasmática recupera su integridad lo que implica que la célula infectada no tiene por qué morir (como la célula no muere puede seguir excretando nuevos viriones por gemación).
Como la célula infectada expresa temporalmente proteínas víricas en su superficie, el sistema inmune puede reconocerlas como extrañas.
Efecto de los virus animales sobre las células infectadas En caso de que se produzca un ciclo normal, es decir, un ciclo lítico, el virus se multiplica y al salir produce la lisis de la célula, directa o indirectamente.
También podemos encontrar virus tumorales u oncogénicos que, en lugar de multiplicarse, producen un cambio en las propiedades de la célula que hacen que se convierta en una célula tumoral.
Hay casos de infección persistente en los que el virus penetra y se multiplica muy lentamente de forma que la liberación de los nuevos virus ocurre de forma progresiva y la célula no muere. Una infección será más o menos persistente en función del tiempo que se mantenga viva la célula infectada. Estas infecciones suelen acabar con la muerte de la célula.
Inmunidad frente a las infecciones víricas El principal mecanismo de defensa del organismo es la respuesta inmunitaria que no es igual a la respuesta que se produce en casos de infecciones bacterianas.
La respuesta inmune se divide en dos ramas: - La rama humoral: el virus (antígeno) es reconocido por receptores de los linfocitos B que maduran en las células plasmáticas que secretan IgE e IgG que reconocen e inactivan el antígeno.
- Rama celular, mediada por linfocitos T que pueden ser citotóxicos (CD8+) o colaboradores (CD4+) Los linfocitos T colaboradores reconocen al antígeno cuando es presentado por células presentadoras de antígeno, como los macrófagos asociados a MHCII. El linfocito T estimula la producción de Ig por parte del linfocito B gracias a las citosinas. Por tanto, la rama humoral y la celular interactúan.
32 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Los linfocitos T citotóxicos reconocen las proteínas víricas expresadas por la célula infectada, que no deberían estar, e inducen un proceso de apoptosis. Son muy importantes en la respuesta contra células tumorales y células infectadas por virus.
Existen tres mecanismos para conferir inmunidad al organismo frente a las infecciones víricas: 1. Anticuerpos neutralizantes: determinados clones de células B reconocen antígenos virales (componentes de la superficie del virión importantes para su infectividad) y secretan anticuerpos específicos para su neutralización.
2. Opsonización: se trata de la potenciación de la fagocitosis del antígeno mediada por inmunoglobulinas. Los receptores de la fracción constante de las Ig ayudan a la interacción entre el fagocito y la partícula vírica  facilitan la fagocitosis. La primera etapa es la neutralización con Ig (defensa inducida) y la segunda es la atracción de macrófagos al foco de infección (defensa constitutiva).
3. Linfocitos T citotóxicos: los antígenos virales expresados en la superficie se complejan con MHC de tipo 1 y el conjunto es reconocido por las células T citotóxicas que liberan dos tipos de moléculas: - Perforinas  producen poros en la membrana, causando la lisis celular (necrosis).
- Granzimas  inducen la muerte por apoptosis Este mecanismo es similar al reconocimiento de las células tumorales por los linfocitos T citotóxicos.
33 Microbiología VARIABILIDAD ANTIGÉNICA Existe una "reacción" de los virus frente al ataque del sistema inmunitario. El sistema inmune reconoce antígenos de superficie para activarse, que normalmente son proteínas de superficie de los virus. Una manera de evitar la activación de la respuesta inmune es la variación antigénica que consiste en la variabilidad progresiva de los antígenos de superficie que determina que la respuesta inmune ya no sea efectiva contra el virus.
Tipos de cambios - Mutaciones puntuales en los genes que codifican para estas proteínas (antígenos). A veces, con solo el cambio de un aminoácido ya es suficiente para evadir las defensas del huésped.
- Cambios por recombinación  se producen cambios más drásticos en las propiedades genéticas y antigénicas del virus, ya que cambia toda una región. Más de un gen puede verse afectado.
34 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Vías de entrada del virus Básicamente, hay vías de entrada comunes a las de las bacterias: - Piel Se trata de una barrera fisiológica relativamente fácil de traspasar. Cuando está intacta los virus no son capaces de atravesarla pero pueden producirse en ella micro o macrodiscontinuidades de forma espontánea (sobre todo las microdiscontinuidades) o no espontánea. El virus del herpes y el papiloma virus entran por esta vía.
- Mucosas Son unas estructuras superficiales más débiles que la piel, ya que tienen menos capas. En ellas también se pueden producir discontinuidades (macro o micro). Principalmente la conjuntiva, tracto genito-urinario. A través de las mucosas entran el virus del herpes, el papilomavirus o el virus del SIDA, los tres por transmisión sexual.
- Tracto oro-digestivo (desde la boca hasta el intestino) Por esta vía entrarán virus que en muchos casos deben atravesar el estómago -de pH muy ácido- por lo que deben ser virus resistentes a condiciones extremas (como el pH) y resistentes a las enzimas del tracto digestivo. Estos virus se encuentran con enzimas como las lipasas, que destruyen lípidos de membrana (no efectividad del virus). Virus de la polio (forma parte de los enterovirus), virus de la hepatitis A o rotavirus (que es uno de los principales causantes de las enteritis víricas agudas o diarreas agudas).
- Tracto respiratorio Normalmente, los virus entran a través de aerosoles inhalados de forma inmediata por la persona y liberados por un portador. Por tanto, la transmisión implica un contacto bastante estrecho, ya que suelen ser virus que no aguantan la vida libre durante mucho tiempo (sensibles a la desecación).
Virus de la gripe, rinovirus (resfriado común), virus del sarampión, virus de la rubeola, virus de la varicela-Herpes Zoster, … Vías de transmisión  Horizontal Es la vía de transmisión más frecuente. El virus pasa de persona a persona, hecho que no excluye la posibilidad de que entre persona y persona haya un vector transmisor, como por ejemplo, otro animal.
La transmisión horizontal se puede producir a través de aerosoles (entrada por vías respiratorias), por vía orofecal (la transmisión no tiene por qué ser inmediata) o por transmisión sexual.
Como ya se ha dicho, puede haber un reservorio animal en el que el virus puede mantenerse durante un periodo variable de tiempo.
35 Microbiología La transmisión mediante reservorio animal puede ser directa o puede ser indirecta - el paso a la persona desde el reservorio implica un insecto que actúa como vector. La transmisión indirecta es más compleja ya que implica tres tipos de individuo diferentes.
 Vertical El virus se transmite de la madre al hijo. Cuando se produce durante el embarazo, el virus debe ser capaz de atravesar la placenta, como el de la rubeola - estos virus pueden provocar abortos.
La transmisión también puede darse durante el parto o bien puede haber una transmisión posterior a través de la lactancia.
Técnicamente, sería posible la transmisión por vía germinal: el óvulo es portador del virus en estado latente por lo que todas las células del embrión están contaminadas. Este modo de transmisión no ha sido comprobado.
Principales enfermedades producidas por virus en humanos (leer) 36 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV CONCEPTOS PREVIOS Enfermedad endémica: frecuencia baja pero estable a los largo de periodos considerables de tiempo. El agente infeccioso está presente de manera constante sin ciclos durante un periodo de tiempo.
Epidemia: aumento repentino y temporal de la frecuencia de una enfermedad sobre el nivel esperado en una población geográficamente limitada (la frecuencia aumenta sobre el nivel basal de forma significativa).
Pandemia: aumento de la frecuencia de una enfermedad en una población grande de una región geográficamente densa.
VIRUS DE LA GRIPE La gripe es una infección respiratoria cuyos síntomas y signos son fiebre moderada o alta, malestar general, mialgia, faringitis y tos no productiva.
Existen tres tipos de virus de la gripe, todos de la familia de los ortomixovirus.
- Virus de la gripe A Produce tanto pandemias (cada 20-25 años) como epidemias de periodicidad anual. La causa de que se produzcan estos episodios es la variabilidad antigénica.
Tiene reservorio animal en aves.
-Virus de la gripe B Este virus solo provoca epidemias. Hasta ahora solo se han descrito casos de infección en humanos; no tiene reservorio animal. Tiene baja o nula variabilidad antigénica.
- Virus de la gripe C Provoca una infección respiratoria leve cuyos síntomas tienen una intensidad mucho menor.
37 Microbiología Se trata de un virus con RNA monocatenario de tipo negativo. Su genoma está segmentado en ocho segmentos de distinto tamaño.
Posee una nucleocápsida envuelta por membrana.
Ésta envuelta membranosa tiene dos proteínas víricas: hemaglutinina y neuraminidasa, esenciales para la infectividad del virus.
- Hemaglutinina (H). Se trata de una proteína que se encuentra en forma de trímero. Esta proteína se inserta en la membrana del virus: tiene un único dominio transmembrana y un extremo muy corto que interacciona con las proteínas de la matriz.
- Neuraminidasa (N). Se encuentra en forma de tetrámero. Tiene un único dominio transmembrana con un extremo que interacciona con la matriz. La otra parte de la proteína "sale" al exterior. Se trata de dominios de tipo globular.
Los extremos de ambas proteínas son las zonas más antigénicas del virus, ya que se trata de proteínas de superficie. Anticuerpos neutralizantes interaccionan con estas zonas, neutralizando la capacidad infectiva del virus y son estos dominios los que están sujetos a variabilidad antigénica.
Le hemaglutinina (en concreto, el extremo de la cadena polipeptídica) interacciona con receptores de superficie. Cuando los anticuerpos reaccionan con ella, ya no puede llevar a cabo esta función.
Por otro lado, la neuraminidasa es una sialidasa, es decir, una enzima que corta los polímeros de ácido siálico o ácido neurámico. Estos polímeros se encuentran en las sialoproteínas, muy abundantes en las secreciones mucosas. El moco constituye un mecanismo de protección de agentes infecciosos, ya que actúa como "pegamento" con ellos; el virus de la gripe licua este moco para evitar pegarse a él, degradando los polímeros de ácido siálico  disminuye la densidad del moco. Así, el virus puede atravesar el moco más fácilmente y puede llegar a la superficie celular.
38 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Por tanto, podemos decir que la hemaglutinina y la neuraminidasa son importantes en estadíos diferentes de la infección.
Modificaciones antigénicas 1) Deriva antigénica: acumulación lenta pero gradual de mutaciones en las regiones antigénicas de la hemaglutinina y la neuraminidasa. Se trata por tanto de un cambio lento.
En las regiones de unión de la hemaglutinina con el receptor de superficie no se producen cambios.
Año a año, las cepas causantes de las epidemias sufren una o dos mutaciones, que hacen que la nueva cepa sea ligeramente distinta a la del año anterior, por lo que los anticuerpos serán algo menos efectivos.
Las vacunas se elaboran con la cepa que causó la epidemia del año anterior, ya que es la más parecida a la nueva cepa.
2) Cambio antigénico: es consecuencia de la recombinación, proceso que se da más fácilmente cuando el genoma está segmentado. Se trata de un cambio más drástico.
Es posible distinguir cada cepa del virus en función de estas dos proteínas (H y N) -H1, H2, H3… N1, N2, N3...
De vez en cuando se produce coinfección de dos cepas distintas; así, se posibilita la recombinación tras la cual resultará un virus con una nueva combinación de H y N  se producirá una nueva pandemia 39 Microbiología cuando esta nueva combinación tenga mayor infectividad. Este proceso de recombinación que aumenta la infectividad se produce cada 20-25 años.
Según la evolución postulada del virus de la gripe A en las sucesivas pandemias, el reservorio original del virus son las aves. En un momento dado, pudo haber coinfección de la forma humana predominante y la forma aviar. Dicha coinfección no pudo producirse ni en humanos ni en aves, ya que el virus humano no puede afectar a las aves y viceversa. Por tanto, hubo un tercer animal implicado que sí puede infectarse de ambos virus, el cerdo. Es por este motivo por el que las pandemias se originan en zonas donde hay una convivencia estrecha entre cerdos, aves y humanos.
VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA HUMANA ADQUIRIDA - VIH Pertenece a la familia de los retrovirus (Retroviridae), en concreto al género Lentivirus  virus de proliferación lenta.
Existen dos tipos de virus: - Tipo I - deriva de virus que afectan a monos. 90% de las infecciones del mundo. Es de este tipo del que se realizan la gran mayoría de los estudios.
- Tipo II - variante derivada del tipo I, limitada a la zona de África.
Estudios de antropología molecular han permitido fijar las mutaciones que han dado lugar al VIH de tipo I a partir del virus de los simios en el S XX.
Se trata de un virus RNA, "diploide", es decir, tiene dos copias del genoma. Alrededor del material genético hay una nucleocápsida formada por cuatro proteínas estructurales (p7, p9, p17 y p27). La nucleocápsida también tiene otras proteínas con función enzimática: transcriptasa reversa, integrasa y proteasa. Al estar incorporadas en la propia cápsida, no es necesario que la partícula vírica las sintetice cuando penetre en la célula.
El virus también consta de envuelta membranosa y matriz.
40 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV El virus tiene dos proteínas de membrana, esenciales para su infectividad: GP41 o proteína fusogénica GP120, responsable de la interacción con el receptor.
La infectividad viene determinada por la interacción de la proteína GP120 con el receptor, que es la proteína CD4, expresada en macrófagos (éstos expresan niveles bajos de la proteína). Por tanto, los macrófagos son la primera célula infectada por el virus. La proteína CD4 es expresada sobre todo en los linfocitos T helper o colaboradores que son los principales afectados por el VIH.
La VIREMIA es el aumento drástico y temporal del número de virus. La viremia inicial del VIH se produce en los macrófagos.
En cuanto a las respuesta inmune, los receptores CD4 de los linfocitos T colaboradores reconocen el antígeno acomplejado con HLA y liberan citocinas para activar la respuesta inmume humoral. Por tanto, se activan los linfocitos B que, gracias a estas citoquinas se transforman en células plasmáticas que secretan Ig específicas para el antígeno.
Como el virus afecta a los linfocitos CD4+ o linfocitos T4 (colaboradores), la infección hace que el número de éstos disminuya significativamente  baja progresivamente la concentración de linfocitos T4 en sangre, lo que disminuye la capacidad del organismo de producir citocinas. Así, disminuirá también la activación de linfocitos B que determina que se conviertan en células plasmáticas capaces de producir Ig.
El SIDA (patología causada por el virus del VIH) se caracteriza por inmunodepresión e infecciones oportunistas.
41 Microbiología Entrada del virus Como ya se ha dicho, la interacción inicial se produce entre la proteína GP120 y el receptor CD4. Pero esta interacción no es tan simple, ya que se trata de una interacción a varias bandas. La proteína GP120 tiene un dominio globular hacia el exterior, que interacción de manera doble: Por un lado, interacciona con CD4 Para estabilizar la unión, interacciona con un correceptor  proteína de membrana del linfocito T colaborador, que suele ser CCR5. Hay determinadas cepas de VIH que, en lugar de emplear CCR5, emplean CXCR4 (es decir, puede haber diversos tipos de correceptor).
 La menor o mayor capacidad del virus de interaccionar con proteínas correceptoras determinará la susceptibilidad de las personas de padecer la enfermedad: hay personas seropositivas que nunca llegan a desarrollar la enfermedad por el lento desarrollo del virus.
Para que tenga lugar la fusión de las membranas es necesaria la proteína GP41 o proteína fusogénica, que facilita por tanto la liberación de la nucleocápsida al citoplasma.
Se liberan moléculas de RNA que deben pasar a DNA gracias a la enzima transcriptasa reversa, aportada por el propio virión.
Eventualmente, en los linfocitos portadores del provirus, éste se activa y se multiplica, "matando" a las células. Se trata de un proceso que tiene lugar de manera lenta a lo largo del tiempo. A medio término, hay una reducción de la cantidad de linfocitos CD4+ y un aumento de la carga vírica. El número de linfocitos continúa disminuyendo hasta que, finalmente, el organismo entra en situación de inmunodepresión.
La CARGA VIRAL es la concentración de moléculas de ácido nucleico (en este caso, RNA) del virus por unidad de volumen. Es posible cuantificarla mediante la técnica de la PCR.
También es posible medir los efectos, es decir, cuantificar la reducción de linfocitos. Se detectan mediante técnicas citométricas la cantidad de linfocitos CD4+ en relación a la cantidad de linfocitos CD8+, que no debería cambiar tras la infección. Cuando esta relación ([CD4+]/[CD8+]) es baja se debe a la reducción de la cantidad de linfocitos CD4+. Otra forma de medirlo es calculando la cantidad de CD4+ por unidad de volumen.
42 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Cuando se mide la cantidad de virus libres en sangre, vemos un aumento masivo de éstos al inicio. Se trata de la viremia inicial, a costa de la infección de macrófagos. Viene acompañada de síntomas similares a los de la gripe.
Después, disminuye la cantidad de virus que se mantiene hasta que se produce la "explosión".
La disminución del número de linfocitos de produce de forma progresiva, sin saltos bruscos.
La fase clínica, es decir, cuando empiezan las primeras manifestaciones de la infección viene determinada por la inmunosupresión, que hace que la persona infectada sea susceptible a infecciones oportunistas.
La fase SIDA se fija cuando el nivel de CD4+ es menor de 200uds./mm3 de sangre. En algunas personas, la caída del número de linfocitos es tan lenta que la fase SIDA no llega nunca.
Para el diagnóstico se realizan tres tipos de pruebas: - Pruebas serológicas, basadas en la relación antígeno-anticuerpo.
La siguiente gráfica muestra dos tipos de anticuerpos, uno de ellos contra GP41 y el otro contra p25, una proteína de la nucleocápsida. Los anticuerpos contra GP41 se mantienen estables durante todo el desarrollo de la infección, mientras que el anticuerpo contra p25 aparece en las fases relativamente iniciales y, tras mantenerse estable durante un periodo de tiempo, vuelve a bajar.
Por tanto, la desaparición de anti-p25 indica que nos encontramos ante fases más avanzadas de la infección ya que este anticuerpo se trata de un marcador precoz.
Mediante las pruebas de ELISA se determinan ambos anticuerpos. Los niveles altos de los dos indican fases iniciales o medias.
Debe realizarse una prueba confirmativa por Western en caso de que ELISA dé positivo.
- Pruebas genómicas, que sirven para determinar la carga viral. Se realiza una RT-PCR con una retrotranscriptasa y una Taq polimerasa. La cantidad de producto de amplificación que se obtiene será proporcional a la cantidad de genoma vírico inicial.
Niveles altos de material genético vírico pueden corresponder a fases iniciales o a fases avanzadas. No suelen diagnosticarse en las fases iniciales ya que la sintomatología se confunde con la de una gripe.
- Pruebas citológicas - se determina la cantidad de CD4+ en relación con la cantidad de CD8+.
También puede ser un marcador del estadío de la enfermedad.
43 Microbiología HERPESVIRUS Se trata de una familia de virus que con bastantes especies diferentes.
Es un virus con DNA de doble cadena lineal, aunque tras la infección el DNA se circulariza (en el interior de la célula).
Tiene un genoma relativamente grande por lo que tienen cierta autonomía funcional.
Se trata de especies de virus infecciosas para distintos animales, vertebrados o invertebrados.
Se caracteriza por la producción de infecciones latentes; puede haber un proceso de multiplicación que no acaba en la eliminación del virus sino en la entrada de éste en un estado de latencia.
Existen 8 tipos de herpesvirus en humanos que pertenecen a 3 familias: α - herpesvirus Se trata de virus neurotrópicos, es decir, infectan a las neuronas. Dentro de esta familia encontramos: - Virus herpes simple tipo 1 (HSV-1)  herpes labial - Virus herpes simple tipo 2 (HSV-2)  herpes genital - Virus varicela/herpes Zóster (VZV) causan como infección primaria la varicela pero, si tras quedar latentes se reactivan y causan una infección secundaria, provocan un herpes.
β - herpesvirus Se trata de virus linfotrópicos, es decir, infectan linfocitos.
- Citomegalovirus humano (HCM) - causan patología sobre todo en inmunodeprimidos.
- Herpesvirus humano tipo 6 (HHV-6) - exantema repentino en niños - Herpesvirus humano tipo 7 (HHV-7) - exantema repentino en niños γ - herpesvirus También son virus linfotrópicos - Epstein Barr (EBV) - monoucleosis, carcinomas - Herpesvirus humano tipo 8 (HHV-8), asociado al sarcoma de Kaposi que se produce preferentemente en personas infectadas con VIH - se trata de una de las causas de muerte del SIDA.
Alternativas entre infección productiva e infección latente - esquema sobre todo aplicable a virus tipo α Cuando el virus infecta a la célula puede seguir dos caminos.
- Infección productiva con destrucción de la célula. En esta infección se manifestarán primero los genes very early -ICP0, después los genes early y finalmente los genes late para producir el material genético y proteínas para aumentar el número de viriones.
- El virus infecta pero no expresa los genes que le permiten replicarse, sino que produce un RNA LAT (no traducido a proteína) que, por un lado inhibe la expresión de los genes necesarios para la replicación y por otro, actúa a nivel del genoma celular inhibiendo la entrada de la célula en apoptosis. Por tanto, es la expresión de esta región LAT la que determina que el virus produzca una infección productiva o quede en estado latente.
En un momento dado, como consecuencia de un cambio en el ecosistema celular o por factores externos, el RNA LAT pierde su capacidad de silenciamiento y el virus se reactiva.
Cuando se produce esta reactivación, se expresan las proteínas very early  ICP0 activa la expresión de otros genes que continúan con la expresión.
44 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Hay varios factores que determinan si se producirá una infección latente o productiva: - Factores celulares (no están bien caracteriazados). Favorecen la infección latente frente a la infección productiva.
- Factores externos - fisiológicos o ambientales (luz solar, estrés, esteroides, metales pesados, …). Tienen un papel determinante en la reactivación.
Virus neurotrópicos La infección inicial de los virus neurotrópicos se produce en las células epiteliales. El virus reconoce receptores de la mucosa labial (HSV-1) o genital (HSV-2). Se produce la fase aguda, caracterizada por la destrucción del epitelio.
Después, los virus infectan los terminales de las neuronas sensoras que inervan dicho epitelio. Desplazándose por el axón, los virus llegan hasta el núcleo: ganglio trigeminal en el herpes labial o ganglio del nervio ciático en el caso del herpes genital. El virus penetra en el núcleo (se descapsida) y no se replica, sino que el genoma se circulariza.
El genoma vírico se mantiene dentro del núcleo de la neurona en forma de minicromosoma - DNA circular, autónomo del DNA celular, asociado a histonas. La expresión de los genes víricos -salvo la expresión de los genes LAT en mRNAs- es inhibida.
Ante determinados estímulos, el genoma se reactiva: se expresan genes de replicación, el genoma se replica y se produce cierta 45 Microbiología cantidad de viriones (no demasiado grande). Los viriones de desplazan -movimiento retrógrado- desde el núcleo a los terminales, salen de la neurona por gemación e infectan el epitelio.
Este ciclo se puede producir de manera continuada. El herpesvirus se caracteriza por causar sucesivas recidivas.
Es similar lo que ocurre en el caso del virus herpes-Zóster, aunque el tipo de células infectadas sea distinto.
PRIONES Son un tipo distinto de partículas infecciosas (proteinaceous infectious particle).
Se trata de complejos proteicos responsables de enfermedades de desarrollo lento que afectan al sistema nervioso. Se manifiestan en forma de acumulaciones de la proteína priónica en forma de placas o fibrillas en el cerebro - depósitos amieloides, que causan el esponjamiento de la materia gris.
Causan las conocidas como encefalopatías esponjiformes.
En animales - Scrapie - oveja- en esta enfermedad es en la que se han desarrollado la mayoría de los estudios.
- Encefalopatía espongiforme de los felinos - Encefalopatía esponjiforme bovina (BSE) o enfermedad de las vacas locas Algunos priones afectan a humanos: - Enfermedad de Creutzfeld-Jakob (CJD), es la forma más común. Existen tres tipos Esporádica (no hereditaria), es aquella en la que no hay casos previos dentro de la misma familia.
Iatrogénica - por ingestión de alimentos contaminados o por transfusión.
Familiar - historial dentro de la familia sanguínea.
- Insomnio familiar fatal - Enfermedad de Gerstmann-Straussler-Scheinker (GSS) - Kuru Como ya se ha dicho, es en el scrapie en la que se han realizado la gran mayoría de los estudios. El agente infeccioso del scrapie fue purificado y caracterizado: se trata de una proteína de 254 aa codificada por el propio genoma de la oveja. Ocurre igual con el resto de enfermedades priónicas: el agente infeccioso que causa estos depósitos amieloides es codificada por el propio genoma del individuo.
La proteína infecciosa tiene una región transmembrana (por tanto, se trata de una proteína localizada en la membrana citoplasmática) y una secuencia repetida.
46 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV No se conoce cuál es la función natural de esta proteína aunque se conoce que no es esencial (ciertos ratones transgénicos que no la tienen son viables y completamente normales). La enfermedad no es consecuencia de la falta de proteína sino de aparición de esta proteína anómala que se acumula.
En el caso del scrapie, la proteína normal recibe el nombre de PrPc mientras que la proteína priónica se llama PrPsc.
La forma no patológica de la proteína tiene un porcentaje muy elevado, de alrededor del 43%, de sus aa en hélice α. En cambio, la forma patológica tiene una proporción menor, del 33%, de hélice α y además, el 43% de sus aa en forma de hojas β antiparalelas.
El cambio conformacional (de forma normal a forma priónica) puede producirse de forma espontánea o ser inducido por la presencia de moléculas con la estructura patológica. Estas estructuras pueden agregarse y formar multímeros, que son los que constituyen los agregados.
Las formas patológicas son además muy resistentes a la acción de las proteasas debido a su estructura.
Existen muchos estudios actualmente sobre los factores que determinan este cambio.
La proteína es capaz, de manera natural, a formar pequeños oligómeros. Cuando alguna de estas proteínas entra en contacto con la forma anómala, ésta actúa como molde y determina que la forma normal se transforme en proteína anómala, sin necesidad de modificaciones en la secuencia de aa. Una única molécula con estructura PrPsc cataliza la conversión - se trata de un proceso autocatalítico que da lugar a fibrillas.
47 Microbiología La conversión de la PRIMERA PROTEÍNA ANÓMALA puede producirse de manera espontánea, aunque esto ocurre con una frecuencia muy baja. Estas constituyen las formas esporádicas de la enfermedad.
En la forma iatrogénica de la enfermedad, se adquiere la forma anómala de la proteína por ingestión de material contaminado; es esta proteína anómala la que cataliza a conversión.
Por último, en las formas hereditarias, lo que ocurre es que existen ciertas mutaciones hacen que aumente la probabilidad de que se produzca el cambio de forma normal a forma patológica.
Las personas portadoras de una de las copias del gen con alguna de estas mutaciones tienen mayor predisposición al cambio.
Existen barreras de especie: la PrP humana es más similar a la de la vaca que a la de la oveja. Por tanto, la forma patogénica en oveja no puede inducir el cambio en seres humanos mientras que la proteína priónica de la vaca sí puede inducir el cambio de la proteína de los humanos.
Por tanto, la barrera de la especie puede saltarse si las especies se encuentran próximas.
El agente infeccioso, estrictamente hablando, no depende de material genético pero, para que pueda existir esta proteína éste sí es necesario. La proteína solo podrá producir los cambios clínicos si hay un gen que codifique para dicha proteína.
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