TEMA 8. TIPUS DE RNA I EL SEU PROCESSAMENT (2014)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Genética - 2º curso
Asignatura Biologia Molecular d'Eucariotes
Año del apunte 2014
Páginas 20
Fecha de subida 04/01/2015
Descargas 26
Subido por

Vista previa del texto

TEMA 8: TIPUS DE RNA I EL SEU PROCESSAMENT TIPUS DE RNA En la següent taula veiem els diferents tipus de RNA que hi ha. Bàsicament parlarem dels tres primers: L’RNA acabat de transcriure sempre ha de patir modificacions per arribar a ser RNA funcional.
El pre-mRNA no és funcional! En procariotes l’RNA acabat de transcriure no pateix modificacions per ser funcional, ja que la transcripció i la traducció es donen seguides.
Els tres RNA necessaris per l’expressió dels gens són l’mRNA, el tRNA i l’rRNA.
La transcripció permet la síntesi de RNA en les cèl·lules: en bacteris la seqüència transcrita es correspon amb la del mRNA, tRNA i rRNA, però en eucariotes no, perquè hi ha un processament.
En eucariotes tots els RNAs recent transcrits pateixen modificacions, per la qual cosa les seqüències dels RNAs funcionals es troben dins el gen, però són més curtes que les del gen i en falten trossos. A això se l’anomena falta de col·linealitat.
mRNA La col·linealitat diu que una seqüència contínua de nucleòtids en el DNA codifica per una seqüència contínua d’aminoàcids en una proteïna.
Però en eucariotes els gens estan interromputs: contenen exons i introns. Els introns s’eliminen en el procés de maduració, de tal forma que en el mRNA madur que es tradueix s’han eliminat les seqüències intròniques. Per això en eucariotes hi ha falta de col·linealitat.
El mRNA conté els exons, que són zones homòlogues a les seqüències exòniques del gen. Per tant, si aparellem un gen amb el seu mRNA, s’observaran loops en el DNA, les seqüències intròniques.
Un gen que codifica per proteïnes sempre comença i acaba per exons. Els exons són les seqüències que es troben en el mRNA encara que no totes les seqüències del mRNA són codificants, perquè també hi ha seqüències d’inici i final de la traducció. Els gens, al principi tenen una regió que es transcriu però no es tradueix. És la seqüència 5’UTR. De la mateixa manera, a l’exó final hi ha la senyal de final de traducció, que no es tradueix, i s’anomena seqüència 3’UTR.
Per què un gen té més introns que un altre? No hi ha cap norma que expliqui això. Sí que s’observa que al llarg de l’escala evolutiva, els organismes que a nivell morfològic són més complexos, tenen més introns en els seus gens.
Característiques de les seqüències d’introns i exons: - L’ordre dels introns és el mateix en el DNA que en el RNA.
En eucariotes, hi ha introns tant en el pre-mRNA com en el pre-tRNA i el pre-rRNA.
L’estructura d’introns i exons d’un gen es manté en tots els teixits i tipus cel·lulars.
Els gens evolutivament conservats tenen la mateixa estructura d’introns i exons.
En gens emparentats, s’observa que els exons tenen seqüències similars però els introns no, és a dir, es conserva la funció dels exons durant l’evolució. Això té aplicacions experimentals en l’aïllament i la caracterització de gens (zoo blot, exon trapping...).
Exemple: família gènica 4CL (acyl-CoA sintetasa) de la fava (Phaseolus vulgaris) i la fava de soja Glycine max).
En l’esquema observem que les caixes de colors representen els exons, i les línies els introns. La variabilitat entre els gens es deu a la recombinació. Les mutacions es poden donar en exons o en introns. La pressió selectiva, però, és major en els exons, ja que aquests es tradueixen a proteïnes, que ens els introns. Per això es veu més varietat en els introns (en la llargada, la seqüència...).
Per aquesta raó en els gens conservats la variació es troba bàsicament en els introns. Això és una característica que s’utilitza per poder analitzar gens. La seqüència de l’exó està conservada mentre que la de l’intró no.
ZOO BLOT És un Southern blot amb DNA de diferents espècies. El genoma degradat de diferents organismes d’espècies diferents s’hibrida amb una sonda de DNA o RNA de la regió del genoma que volem analitzar.
Tenim un gen provinent d’una espècie, i volem mirar si també hi és en altres espècies. Però no podem utilitzar el gen com a sonda per hibridar amb el genoma degradat de les altres espècies perquè els introns d’unes i altres segur que són diferents. En aquest cas, haurem d’utilitzar només els exons. Si hi hibriden, veurem una banda en l’electroforesi, i veurem que una determinada espècie té el gen que analitzem.
EXON TRAPPING La seva traducció seria “atrapament d’exons”.
Permet determinar si un fragment del genoma conté exons, i per tant, forma part d’un gen que codifica per una proteïna.
S’utilitza un vector que té dos exons, un a cada extrem, i s’introdueix la regió que es vol estudiar a l’intró que hi ha entre aquests dos exons. Si després d’afegir al regió i d’haver-se produït l’splicing l’mRNA produït és més gran que el del vector sense cap regió introduïda, llavors la regió conté un o més exons.
PROCESSAMENT DEL PRE-mRNA Aquest procés està associat a la transcripció: hi ha modificacions tant en l’extrem 3’ com en el 5’ i splicing (eliminació d’introns). La maquinària encarregada de fer l’splicing i les altres modificacions s’associa a la cua CTD de la RNA-polimerasa II.
La finalització de la transcripció està acoblada a la modificació de l’extrem 5’ del pre-mRNA.
Després de la modificació de l’extrem 5’ ve l’eliminació d’introns, i després la modificació de l’extrem 3’.
- Modificació del pre-mRNA en l’extrem 5’ Consisteix en la unió d’una guanina a aquest extrem, la qual cosa confereix estabilitat a l’RNA i és necessari per l’inici de la traducció. L’enzim guaninatransferasa és el que permet la unió de la guanina. A partir d’aquí actua la metiltransferasa, que afegeix metilacions diverses al principi de la molècula de RNA. Hi ha metilació de la guanina, de la primera base del mRNA i de la segona.
L’extrem 5’ del pre-mRNA s’anomena CAP1, CAP2 o CAP3 depenent de quantes bases estiguin metilades.
- Modificació del pre-mRNA en l’extrem 3’: adició de la dua polyA Hi ha tres elements importants per la modificació d’aquest extrem i la terminació de la transcripció: - Senyal de poliadenilació (senyal polyA).
Punt de tall del pre-mRNA.
Seqüència rica en uracils que es troba per darrere del punt de ruptura del pre-mRNA.
El complex CFI i CFII s’unia a la seqüència polyA gràcies als factors CPSF i CstF i duen a terme la ruptura del pre-mRNA pel punt de tall. El fragment de mRNA que queda a la RNA-polimerasa II és molt inestable perquè és ric en uracils, que formen ponts d’hidrogen molt dèbils amb el DNA, la qual cosa fa que es desuneixi del DNA i es degradi, i la RNApolimerasa II es desenganxi del DNA i pugui començar un nou procés de transcripció.
A més d’aquests factors, a la seqüència polyA també s’hi uneix PAP, que és una polimerasa que sintetitza la cua polyA a partir del punt de tall del pre-mRNA. Aquesta cua pot tenir una longitud d’entre 50 i 200 adenines. Aquesta polimerasa és especial perquè no utilitza cap motlle, simplement addiciona adenines.
A mesura que es genera la cua polyA, aquesta es va protegint amb la proteïna PABP (PolyA Binding Protein). La cua polyA és necessària pel transport del mRNA del nucli al citoplasma i per l’inici de la traducció.
El complex de processament de l’extrem 3’ conté diversos enzims. CPSF i CstF tenen diverses subunitats, però la resta de factors són monomèrics.
- Eliminació d’introns: splicing Hi ha diferents grups d’introns, que podem observar en la següent taula. Els introns dels grups 1 i 2 es troben en RNAs que tenen activitat enzimàtica pròpia capaç de tallar els introns de mRNA.
En comptes, en el cas dels introns del grups 3, que són els que es troben el el pre-mRNA nuclear, és a dir, el que prové de gens transcrits per la RNA-polimerasa II, l’eliminació dels introns la fa el complex spliceosomal.
Per acabar, l’eliminació dels introns del tRNA la fan uns altres enzims.
Nosaltres, per tant, ens centrarem a explicar el procés d’splicing del grup 3. Aquest és un procés que requereix una precisió extrema, ja que sinó d’un pre-mRNA en sortirien mRNAs diferents, i sempre s’ha d’obtenir el mateix mRNA madur.
En el 100% dels introns observem que en les bases properes als exons hi ha una seqüència consens, tant en l’extrem 5’ com en el 3’. A més aquesta seqüència consens avarca part de l’exó. Els introns, en 5’ sempre comencen per les bases GT. En 3’, sempre acaben per AG.
Per això els gens a vegades s’anomenen GT-AG.
Els introns també tenen una seqüència consens interna, més propera a l’extrem 3’, formada per entre 11 i 40 nucleòtids. Aquesta sempre conté una adenina, que és fonamental per la reacció d’splicing.
El procés d’splicing consisteix en dues reaccions de transesterificació: El grup hidroxil central ataca l’enllaç fosfodièster que uneix l’última base de l’exó 1 amb la primer de l’intró.
Aquesta interacció provoca el tall de l’enllaç fosfodièster.
Llavors l’extrem 5’ de l’intró forma un enllaç fosfodièster amb el grup hidroxil de l’adenina.
L’extrem OH de l’exó 1 ara provoca la ruptura de l’enllaç fosfodièster entre l’última base de l’intró i la primera de l’exó 2. Llavors es produeix un enllaç fosfodièster entre l’exó 1 i el 2.
- L’intró, que ha quedat separat de la resta del mRNA, trenca l’enllaç fosfodièster i al final es degrada per l’acció de les exonucleases.
Aquest procés és molt precís, sempre es dóna per aquests mateixos punts.
L’spliceosoma (o empalmosoma) és un complex de snRNPs (ribonucleoproteïnes petits nuclears) que permet que s’estableixin unes interaccions que provoquen la ruptura i la formació dels enllaços fosfodièster.
Aquestes snRNPs provenen de l’associació de snRNA i proteïnes. Els snRNA són petits (100-200 nucleòtids) i rics en uracil (per això es diuen U1, U2, U4, U5 i U6). El complex forma una estructura secundària amb l’intró, i l’activitat catalítica la té U6.
Primer de tot U1 reconeix la seqüència consens 1 de l’intró. Mirar l’esquema de la dreta.
Els llocs d’inici d’splicing són reconeguts per complexos RNA/proteïna U1 i U2, la qual cosa garanteix la precisió del tall.
Les interaccions entre snRNPs i RNA es donen per complementarietat. Tot se situa de forma correcta degut a l’aparellament entre els RNA dels snRNPs i les seqüències consens de l’intró.
U2 s’uneix a la seqüència consens interna, i U1 a la de l’extrem 5’. La interacció entre U6 i U2 es produeix per la interacció entre els seus RNAs, que són complementaris.
- U1: senyalitza la unió de l’exó 1 amb l’extrem donador de l’intró.
U2: s’uneix a l’adenosina de l’intró que inicia l’atac nucleofílic per trencar la unió entre l’exó 1 i l’intró. U2 i U6 formen el nucli catalític de l’spliceosoma.
U6: activitat catalítica, trenca els enllaços fosfodièster.
U4: emmascara l’activitat catalítica de U6 fins que els punts d’unió es troben alineats.
U5: s’uneix a l’extrem 3’ de l’exó 1 i el 5’ de l’intró quan U1 se’n va de l’spliceosoma.
Fidelitat de l’splicing El tall ha de ser molt precís perquè sinó el marc de lectura pot canviar. Llavors es generarien aminoàcids totalment diferents, i fins i tot podrien aparèixer mutacions sense sentit.
Si les seqüències de tots els introns són iguals, per què els extrems d’un intró reconeixen l’altre extrem del mateix intró, i no el d’un altre? Això podria passar amb molta facilitat si el procés no estigués molt controlat.
L’splicing es dóna a mesura que es dóna la transcripció, la qual cosa permet que no hi hagi errors, perquè l’eliminació d’un intró es fa abans que surti de la RNA-polimerasa II el següent.
SELFSPLICING Aquest procés és el que feien els introns dels grups 1 i 2 que formaven part de RNAs que tenien activitat autocatalítica. Són ribozims.
Aquests RNAs agafen estructures secundàries que li proporcionen l’activitat catalítica que utilitza sobre si mateix.
Hi ha tres classes de reacció de tall i unió que es desenvolupen sempre a través de dos esterificacions. Primer, un grup OH lliure ataca la unió entre el primer exó i l’intró. Després, l’OH lliure de l’extrem del primer exó ataca la unió entre l’intró i el segon exó.
SENYALITZACIÓ I TRANSPORT DEL mRNA L’mRNA madur es trasllada al citoplasma, on serà traduït. El transport es fa per una translocació per porus de la membrana nuclear.
Aquest és un transport actiu que requereix proteïnes de l’spliceosoma. Quan s’ha eliminat l’intró, la regió que connecta els dos exons té associat un complex que es diu EJC (Exon Junction Complex). Aquest complex està implicat en diverses funcions respecte al mRNA: - Transport.
Estabilitat de l’mRNA.
Localització del mRNA.
És un complex de 9 proteïnes. El model que es proposa és que una proteïna (REF) del complex EJC permet la unió de les proteïnes transportadores (TAP/Mex).
MODIFICACIÓ DEL pre-mRNA Un mateix pre-mRNA pot donar lloc a diferents RNAs madurs, i en conseqüència, crear proteïnes diferents (isomorfes). Això es pot produir per: - Splicing alternatiu.
Poliadenilació alternativa: un pre-mRNA pot tenir diverses seqüències de poliadenilació, de manera que la cua polyA es pot afegir en diferents punts.
Edició de l’mRNA: canvis en la seqüència de nucleòtids de l’mRNA.
- Splicing alternatiu Un gen sempre comença per un exó i acaba per un exó, de manera que el primer i l’últim exó mai es veuran afectat per l’splicing alternatiu. Aquest procés, però, pot eliminar un exó dels del mig juntament amb els introns que l’envolten.
Per exemple, si mirem l’esquema, podem veure que en el segon cas, s’elimina l’exó 3 juntament amb els introns 2 i 3. I en el tercer cas s’elimina l’exó 4 amb els introns 3 i 4.
Quan es tradueixin a proteïnes, totes tindran els mateixos extrems Nter i Cter: són proteïnes isomorfes.
Un exemple és el del gen de la tropomiosina α en rates, que pateix splicing alternatiu i genera diferents proteïnes isomorfes depenent de en quin teixit es trobi.
Els casos que veiem que l’extrem 5’ és diferent es deuen a l’ús de promotors alternatius. Les diferències en l’extrem 3’ es deuen a la poliadenilació alternativa, que explicarem a continuació.
Les A marquen els diferents punts on es pot afegir una cua polyA, i les línies discontínues són els introns.
L’splicing alternatiu permet que, tot i tenir uns 22.000 gens, els humans puguin produir molta més diversitat de productes gènics (fins a 100.000 o més), i que per tant siguin organismes més complexes que altres que tenen més gens però no tenen splicing alternatiu. S’estima que aproximadament un 50% dels gens del genoma humà pateixen splicing alternatiu.
- Poliadenilació alternativa En el següent esquema observem un gen que té dos senyals de poliadenilació (AATAAA) i dos codons stop (signe d’stop). En aquest cas, la seqüència de polyA que es farà servir depèn de l’splicing alternatiu. Les proteïnes resultants seran isomorfes, però a causa de l’splicing alternatiu.
Ara tenim un altre cas, en el qual la poliadenilació alternativa és independent de l’splicing alternatiu, ja que les dues seqüències de poliadenilació es troben darrere el codó stop, en regió no codificant. Per tant es podran generar dos pre-mRNAs diferents, però com els dos senyals estan fora de la regió codificant, es generaran sempre les mateixes proteïnes.
Tot i això, cada un dels pre-mRNAs té una estabilitat i una vida mitjana diferent, per la qual cosa la quantitat de proteïna serà diferent en els diferents teixits en els que es produeixi un premRNA o un altre.
- Edició de l’mRNA L’edició es fa abans de l’splicing. S’afegeixen o es canvien nucleòtids que no estaven a la cadena motlle.
Canvi de base en el mRNA En l’exemple que s’exposa es modifica l’mRNA de l’intestí. Es canvi una base: la C original es substitueix per una U, de manera es genera un codó stop. En l’intestí aquesta proteïna té molts menys aminoàcids.
En altres casos es pot canviar un aminoàcid per un altre, fent que la proteïna agafi una conformació diferent.
Mitjançant un mRNA guia Aquest mètode consisteix en una addició de bases, i es fa sempre gràcies a mRNAs guies. Es fa en paràsits, encara no s’ha trobat en eucariotes comuns.
En l’exemple l’mRNA madur té uns uracils que no estan presents en la seqüència del gen. Hi ha uns mRNA guies complementaris al codificat pel gen.
L’mRNA guia conté unes sèries de bases que no aparellen amb el DNA a modificar (sempre són adenines en aquest cas). Aquestes serveixen de motlle per introduir els uracils en aquells punt de l’mRNA que s’editen.
DEGRADACIÓ DE L’mRNA EN EUCARIOTES La estabilitat de l’mRNA depèn de: - El cap i la cua polyA: són dos elements que protegeixen el pre-mRNA de les exonucleases.
Seqüències específiques del mRNA que poden estabilitzar o desestabilitzar l’mRNA: s’han descobert seqüències desestabilitzants en la regió 3’UTR.
Mutacions sense sentit en la regió codificadora desencadenen la degradació de l’mRNA.
Si l’extrem 3’ perd la cua polyA, les seqüències riques en A i U en la regió 3’UTR són sensibles a ser degradades per exonucleases. Si s’elimina el CAP, les exonucleases comencen a degradar l’RNA en sentit 5’3’ perquè és l’extrem 5’UTR el que passa a estar exposat a les exonucleases.
EVOLUCIÓ DEL CONCEPTE DE GEN A NIVELL MOLECULAR 1.
2.
3.
4.
5.
Un gen  Un enzim.
Un gen  Una proteïna.
Un gen  Un polipèptid.
Un gen  Diversos polipèptids (splicing alternatiu).
Un gen  Seqüència de DNA que codifica per un RNA funcional.
RESUM DE GEN EUCARIOTA QUE CODIFICA PER UNA PROTEÏNA Tots els introns comencen per 5’GT i acaben per 3’AG. Les regions que es transcriuen però no es tradueixen i estan en el mRNA són les regions d’inici i final de transcripció (5’UTR i 3’UTR). La transcripció comença sempre per un exó i acaba amb un exó.
TOTES LES PAUTES PER A L’EXPRESSIÓ D’UN GEN ESTAN EN EL MATEIX GEN.
L’única seqüència de nucleòtids que trobem en el mRNA i no el gen de DNA és la cua polyA.
RNA DE TRANSFERÈNCIA: tRNA És la molècula que permet adaptar la seqüència de nucleòtids a la d’aminoàcids. Ella mateixa porta un aminoàcid i pot reconèixer la seqüència d’un mRNA.
Els diferents tRNAs són molt similars entre si. Tenen una estructura secundària que es forma per la interacció entre diferents zones de la seva seqüència. Es diu que tenen uan estructura en forma de fulla de trèvol: es diferencien quatre braços i un braç addicional (es diu variable perquè varia de mida entre els diferents tRNA).
Els dos braços més importants són: - Braç de l’anticodó: és la seqüència que reconeix els codons de les seqüències de nucleòtids del mRNA.
Braç acceptor: convergeixen els extrems 5’ i 3’ del tRNA. La monocadena amb l’extrem 3’ forma un extrem protuberant que sempre té les bases CCA, i és on s’unirà l’aminoàcid.
Els tRNAs tenen bases modificades, que han sofert modificacions posteriorment a la transcripció a partir dels gens que codifiquen per tRNAs.
Els tRNAs tenen una forma de L invertida, en la qual queden el màxim d’allunyats el braç de l’anticodó i l’acceptor.
L’anticodó s’uneix complementàriament al codó de l’mRNA. Els aminoàcids que porten s’acoblen i formen un polipèptid. Els dos braços estan molt allunyat perquè no interaccionin.
Així, els aminoàcids no molesten en la lectura de l’mRNA i es poden unir bé els uns als altres.
ELIMINACIÓ DE L’INTRÓ DE tRNA La transcripció dels gens de tRNA també genera un pre-tRNA. En la imatge següent veiem que en vermell està marcat un intró. Per eliminar-lo hi ha d’haver una reacció enzimàtica, que es divideix en dos passos: - - Actuació d’una nucleasa: és una nucleasa específica que reconeix l’intró.
Actuació d’una ligasa que uneix els dos fragments separats restants.
Els extrems 3’ i 5’ després de l’acció de la nucleasa, però, no són els necessaris. L’extrem que ha de ser 3’OH té unit un fosfat que fa que es formi un fosfat cíclic. Aquest és obert per una fosfodiesterasa, que fa que es quedi un fosfat.
Després, una quinasa passa el fosfat de l’extrem 3’ al 5’, de manera que ara ja tenim els extrems correctes: 3’OH i 5’P.
Ara pot actuar la quinasa i unir-los.
rRNA I RIBOSOMES Els rRNA formen part dels ribosomes. L’rRNA és l’RNA més abundant de la cèl·lula, representa un 60% del total. Això és perquè les estructures que formen es necessiten en abundància, els ribosomes. Són necessaris per la traducció, per produir totes les proteïnes necessàries per la cèl·lula.
Hi ha més de 100 còpies de gens de rRNA en el genoma, unes 280 en humans. En el nucli els gens que codifiquen per rRNA s’agrupen en el nuclèol: és una zona amb una densitat característica, i que s’observa més fosca en el microscopi.
Les unitats de transcripció de rRNA es troben juntes en una mateixa regió, seguides una de l’altra. Per això, la transcripció és contínua.
PROCESSAMENT DEL rRNA DESPRÉS DE LA TRANSCRIPCIÓ Els gens de rRNA també es transcriuen a pre-RNA, que ha de patir modificacions per arribar a rRNA madur i funcional. En eucariotes hi ha quatre rRNA: 5.8S, 18S i 28S. Aquests es troben sempre junts en una unitat transcripcional i en el mateix ordre (18S, 5.8S i 28S), i hi ha un quart (5S) que es troba en una altra unitat.
RIBOSOMES Els ribosomes estan formats per dues subunitats que a la vegada estan formades per proteïnes ribosomals i rRNA. El ribosoma en eucariotes és 80S: la subunitat gran és la 60S i la petita la 40S.
Els rRNA també agafen estructures secundàries i terciàries per crear un ambient òptim per a què es doni la traducció.
En els ribosomes, el lloc A és on s’hi uneix un tRNA carregat amb un AA (es diu lloc Aminoacídic o Aminoacil). El lloc P és el lloc Peptídic o Peptidil, i s’hi troba el tRNA que carrega la cadena polipeptídica en creixement. El lloc E és el lloc de sortida o Exit, i és el lloc per on el tRNA que ja ha participat en el procés de traducció i està descarregat abandona el ribosoma.
Aquestes tres regions s’organitzen i es creen amb la participació de les dues subunitats del ribosoma. El mRNA s’uneix a la subunitat petita.
...