Biologia Molecular Tema 1 (Part 2) (2015)

Apunte Español
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Bioquímica - 2º curso
Asignatura Biologia Molecular
Año del apunte 2015
Páginas 9
Fecha de subida 14/03/2015
Descargas 7

Vista previa del texto

1 TEMA 1 –L’ESTRUCTURA SECUNDÀRIA DEL DNA.
1.1 CONFORMACIONS DE LA CADENA RIBOSA-FOSFAT.
Els angles dels enllaços que conformen l’esquelet sucre-fosfat són molt importants per a la doble hèlix. En concret n’hi ha dos que poden variar: 1 l’angle de l’enllaç que hi ha entre el C1 i el nitrogen de la base i 2 els angles relacionats amb la pentosa.
1 Enllaç N-glucosídic –uneix el sucre amb la base. Hi ha diferents possibilitats d’angle; són les anomenades orientacions estèricament permeses. Les purines podem tenir aquest angle amb la base posada cap a un cantó (sin) o bé just al cantó oposat (anti). En el cas de les pirimidines és diferent: només les podem tenir en anti perquè tot i ser més petites, si les posem en sin l’oxigen carbonílic “xoca” amb els grups de la ribosa i això seria un impediment estèric. El DNA B té tant les purines com les pirimidines en anti.
2 Ribosa –és un pentàgon. Cada vèrtex d’un pentàgon regular forma un angle de 108º. Tenim un problema, i és que aquest pentàgon està fet per carbonis, amb una estructura tetraèdrica i els seus angles són de 109,5º. Això es resol fent que el pentàgon adopti una posició de “mitja cadira”. El carboni de referència és el C5’, el que està més aixecat al cantó dret. Quan un àtom està en “endo” és que està en el mateix pla que aquest. Quan està en “exo” és que no ho està. En la conformació de mitja cadira, el C3’ està aixecat (es veu en la segona figura però no en la primera perquè està eclipsat) i per tant està en endo. El C2’ és el carboni del costat del C5’. Aquest en el DNA B està també en conformació endo. També trobem confòrmers que són C3’ exo: estan a l’altre costat del pla. Si tenim aquests confòrmers, la distància entre el fosfat i el següent és de 5,9A. Si tenim el C2’ endo, la distància és més gran.
1.2 APARELLAMENTS DE BASES DIFERENTS DELS DE W I C Un investigador anomenat Hogsteen va proposar, 10 anys més tard de que la hipòtesi de la doble hèlix veigués la llum, uns aparellaments de bases diferents dels establerts per W i C. Va agafar una barreja de nucleòtids A i T equimolar, va cristal·litzar-la i va mirar per difracció de raigs X quins ponts s’havien produit. Va veure que els ponts d’hidrogen entre A i T no eren els mateixos que els proposats per W i C: el nucleòtid d’adenina estava col·locat a l’inrevés! Va repetir el mateix procediment amb la parella G-C, a pH àcid. Aquest cop va trobar 2 ponts d’hidrogen entre aquestes bases; tampoc es corresponia amb el model de W i C, que deia que entre aquests nucleòtids n’hi havia 3, de ponts! Aquest experiment el què demostra és que es poden fer ponts d’hidrogen de moltes maneres diferents. En compostos naturals, per exemple, hi ha ponts entre T i C i entre T i G. Aquests aparellaments també es produeixen al DNA a mesura que es van unint les cadenes per formar la doble hèlix, però finalment acaba adoptant la conformació més estable amb els ponts que toquen.
Alexander Rich va intentar fer el mateix experiment que Hogsteen però de forma més sofisticada: va utilitzar espectroscòpia IR. Va obtenir l’espectre de G i C per separat i amb les dues bases juntes. Si G i C no interaccionessin, aquest segon espectre seria la suma dels dos espectres per separat. Però el resultat experimental va revelar un espectre diferent: els nucleòtids havien interaccionat. També va fer aquests anàlisis amb G i A, i va observar que la suma dels espectres i l’espectre observat eren pràcticament idèntics: això volia dir que pràcticament no hi ha hagut interacció entre aquests dos nucleòtids.
En funció dels canvis en l’espectre va ser capaç de determinar la concentració del producte associat i la concentració d’equilibri de les dues bases per separat. Amb això en va calcular la constant d’equilibri (K). Això ho va fer amb totes les parelles que va poder. La K ens indicava la constant d’associació dels nucleòtids entre ells. Com més gran, més associació.
Comparant els valors, es veia que la K per als aparellaments entre A i T i entre C i G era molt més gran que per a qualsevol altre aparellament de nucleòtid.
1.3 ESTUDI DE LA CRISTAL·LOGRAFIA DE RAIGS X D’OLIGONUCLEÒTIDS. ANGLES DE TWIST, TILT, ROLL I PROPELLER TWIST. SLIDE: DESPLAÇAMENT DELS PARELLS DE BASES.
El 1963 Khorana va sintetitzar RNA mitjançant síntesi química (no enzimàtica): Gràcies a això es van poder fer “oligos”: seqüències curtes de nucleòtids. A partir dels 70 es va començar la síntesi química automatitzada. Això va permetre tenir en una dissolució moltes còpies d’un mateix oligo, la qual cosa facilitava molt l’anàlisi per cristal·lografia de raigs X. Es van fer oligos i va obtenir cristalls. Aquests donaven lloc a taques en el difractograma que permetien determinar l’estructura 3D de la molècula que estaven sintetitzant.
A la imatge veiem un diagrama de densitat electrònica corresponent a un d’aquests cristalls. Amb aquest es poden localitzar les bases i la distància entre elles. Així, es va poder confirmar una part de la hipòtesi de la doble hèlix de DNA proposada per W i C.
Una altra tècnica per analitzar l’estructura 3D de les proteïnes és la RMN. Es van fer experiments 2D. En l’espectre que obtenim, la diagonal representa l’espectre unidimensional. Els pics (o ressonàncies) de fora de la diagonal es produeixen quan hi ha interaccions no covalents entre protons.
RMN per a noobs –En el diagrama tenim representats 3 protons. El protó 1 i 2 estan interaccionant entre ells perquè trobem un punt blanc que correspon al creuament entre aquests dos protons. Això vol dir que en l’espai aquests protons estan propers. El mateix passa amb el protó 1 i 3. En canvi, el 2 i el 3 no intraccionen perquè no hi ha cap puc entre ells.
RMN ens permet fer l’experimentació en solució aquosa. Aquesta tècnica no només ens dóna informació dels enllaços covalents, sinó les relacions en l’espai entre àtoms (si estan més propers o no). Aquesta tècnica ens permet distingir entre els diferents tipus de DNA (B,Z,A).
L’any 1979 apareix la primera estructura resolta mitjançant cristal·lografia de raigs X, al laboratori d’Alexander Rich. Va fer un oligo amb la seqüència CGCGCG. Dickerson també ho va fer. Rich va descobrir el DNA Z. Dickerson va descobrir l’estructura del DNA B, i es va veure que aquesta era la forma natural del DNA.
La hipòtesi de Watson i Crick ja no és només una hipotesi; ja és una estructura.
A les diferents estructures de DNA B que s’han estudiat, es troben angulacions diferents pel que fa a les parelles de bases. Tenim diversos angles a tenir en compte: 1 Angle de twist. És aquella rotació que s’ha de fer perquè quan s’hagi pujat 10 parells de bases es torni a arribar a la mateixa posició que l’inicial. Si la hipòtesi de W i C és correcte, aleshores l’angle de twist és 360º/10pb=36º/pb.
2 Angle de tilt. Si tenim una doble hèlix perfecte, en principi els parells de bases són perpendiculars a l’eix que travessa l’hèlix, però no és així en la doble hèlix de DNA. Les bases estan una mica inclinades: en el model de W i C l’angle de tilt és de 6º.
3 Angle de roll. Pot adquirir diversos valors en funció del tipus de DNA.
4 Angle d’hèlix o propellor twist. Si tenim dues bases aparellades, el primer que pensem és que estan al mateix pla, però no és així. En els parells de bases de DNA es pot veure com una està una mica girada respecte l’altra.
Per què el DNA fa aquest angle? Imaginem-nos un eix que travessa longitudinalment les bases. Amb l’angle propellor, el contacte entre la base i la seva parella té una superfície més gran. Amb això també s’aconsegueix més contacte entre parells de bases consecutives, amb la qual cosa disminuïm la interacció amb l’aigua de l’entorn.
Es dónen els 4 tipus d’angulacions alhora a cada parella de bases del DNA. Els valors dels angles varien en funció de l’àcid nucleic, presenten una gran variabilitat.
Entre dues parelles de bases consecutives definim 3 eixos perpendiculars entre ells. Sobre aquests eixos es generen les angulacions. L’eix z és el que genera el twist, i travessa perpendicularment les bases. L’eix y travessa longitudinalment les bases i ens permet els angles de roll i també l’slide (lliscament lateral). Per últim tenim l’eix x, que ve “cap a nosaltres” i permet l’angulació en tilt.
En les estructures de DNA natural estudiades, l’angle de twist pot anar de 28 a 42º. L’angle de roll va de +20 a -10º. Els valors per a l’slide es troba entre 2 i -1A. L’angle de tilt va de 6 a 20º.
La cosa es complica quan hi ha la transició d’una Pu a una Py. Com que tenim l’angle de propellor, si volem posar una parella amb contacte íntim amb la superior hi ha un bony (asterisc) que impedeix aquest contacte: és el que anomenem un “impediment estèric”. Això es soluciona fent que la parella i la de sota facin un angle de roll (imatge de l’esquerra). Però aquesta angulació provoca alhora que hi hagi un lliscament lateral (slide) de 2A, perquè els contactes siguin més estables. Hi ha una relació mecànica entre els diferents moviments dels angles del DNA: si en toquem un, els altres canvien. Si tenim una parella de bases i a sota una altra, i entre elles l’slide és de 0, aleshores el twist és de 36º. Amb un slide de 2A, com que hem de mantenir les distàncies dels enllaços éster-fosfòric, cal també que hi hagi un canvi en l’angle de twist: passa de 36º a 28º.
Un cop es van tenir estudiats els angles de moltes molècules de DNA van poder generalitzar. Es va establir una divisió dels DNA en funció dels valors dels angles d’slide i de roll. Els DNA B són els que tenen aquests dos valors petits (cap a l’esquerra de la gràfica) i els DNA A són els que els tenen grans (cap a la dreta).
1.4 ESTRUCTURA DEL DNA Z I A.
Partim d’una estructura amb angles de Roll i d’Slide 0 (a). Aquesta és la forma de DNA que li correspon al DNA B o al DNA de W i C.
A mesura que vario aquests dos angles, l’estructura esdevé diferent. Quan arribo a Roll=12º i S=2A, l’estructura que tinc correspon al DNA A (d). És un tipus de DNA existent a la natura i que va ser descobert simultàniament al DNA B. Molècules com per exemple l’RNAds adopten aquest tipus de conformació. Les estructures híbrides RNA-DNA que es formen durant el procés de transcripció també. El fet que adopti aquesta forma és que els hidroxils del C2’ de la ribosa (de l’àcid ribonucleic, no el desoxi) impedeixen la formació d’una estructura com la del DNA B.
Rosalind Franklin va descobrir el DNA A, al mateix temps que W i C van publicar la seva hipòtesi al Nature. El DNA B es formava quan les fibres estaven en un medi d’aigua pura sense etanol, o a molt baixa concentració.
Quan aquesta puja (75%) el DNA B esdevenia A.
Pel que fa a l’enllaç N-glucosídic, la conformació anti per Pu i Py val tant per A com per B. Pel que fa a la conformació de la ribosa, al DNA B tenim el confòrmer C2’ endo, però al DNA A la conformació és C3’ endo.
Si mirem el DNA A, els parells de bases estan ocupant una regió anul·lar i al mig no hi són. En canvi al DNA B les parelles de bases estan travessant el centre. El forat intern del DNA A està ple d’aigua (i això el fa més inestable).
Si mirem el DNA A frontalment veiem que és més xato que el DNA B. El mateix nombre de parells de bases ocupen una longitud més curta en el DNA A que en el DNA B. En el DNA A, a més, podem apreciar que el solc gran es veu menys.
La forma Z del DNA va ser descoberta al laboratori d’Alexander Rich, quan van fer un cristall d’un oligo que tenia per seqüència 3’-CGCGCG-5’, a l’any 1979 (recordem que els DNA B i A van ser hipotetitzats el 1953). Jovin (1972) ja havia fet, abans que Rich, experiments amb DNA de longitud heterogènia però igualment amb la mateixa seqüència de guanina i citosina. A diferència del primer, no va fer estudis cristal·logràfics sinó que va utilitzar tècniques de dicroïsme circular. El DNA de Jovin va ser descrit com poli dGdC, entre molts altres noms similars.
Quan mirem un raig d’una radiació electromagnètica com pot ser la llum, el camp elèctric oscil·la en totes les direccions possibles.
Quan posem un polaritzador enmig de la trajectòria de la llum, aconseguim que la oscil·lació es produeixi en un sol pla. Aquesta polarització pot ser plana o bé circular; en aquest cas el camp elèctric oscil·larà en totes les orientacions possibles al llarg de la propagació (com si es desplacés cap endavant en espiral). La llum pot ser polaritzada circularment cap a la dreta o cap a l’esquerra, o tots dos alhora en menor o major grau. En el dicroïsme circular mesurem l’absorció de la llum polaritzada circularment cap a la dreta i cap a l’esquerra a diferents longituds d’ona. L’espectre de dicroïsme circular és el resultat de la resta d’aquests dos espectres.
Si una molècula, com per exemple la del DNA, té asimetria tridimensional (té propietats quirals) aquesta espectroscòpia ens permet caracteritzar-la. Al laboratori de Jovin es va veure que el seu polinucleòtid els donava un espectre de dicroïsme circular igual que el del DNA B. Però si afegien una elevada concentració de NaCl (3-4M), aleshores l’espectre per a les mateixes longituds d’ona era completament diferent (era gairebé com l’invers de l’espectre que havien obtingut en el DNA sense res).
Més tard, quan es va poder caracteritzar l’estructura d’aquest DNA, se li va anomenar DNA Z perquè si uneixes els fosfats fa una ziga-zaga que recorda aquesta lletra. En el DNA B els fosfats embolcallen el DNA en una corba progressiva en forma d’hèlix. Una altra particularitat és que aquesta hèlix de DNA Z gira cap a l’esquerra. Aquest canvi de sentit del gir de l’hèlix és la que va invertir l’espectre de dicroïsme circular en l’experiment de Jovin.
En aquesta secció transversal del DNA Z, veiem que les parelles de bases no passen exactament pel centre, però hi estan molt a prop.
En el dibuix (desenvolupat al laboratoria de Rich) es veu un DNA B que en la regió central passa a Z. En el DNA B les conformacions pel que fa a l’enllaç N-glucosídic les bases estan en anti i pel que fa a la ribosa aquesta està en C2’ endo. Si un tros d’aquest DNA esdevé Z, les parelles de bases han de fer un gir de 180º que fa que G i C s’inverteixin. La C (Py) queda com estava (anti C2’endo) però la G (Pu) esdevé syn 3’endo.
És per això que hi ha autors que consideren que la unitat bàsica d’aquest DNA són dues parelles de bases, és a dir, un dinucleòtid. És aquest gir de 180º el que fa que els fosfats es posin en Z. La distància que hi ha entre els fosfats d’una mateixa cadena s’escurça. La distància entre els fosfats d’una cadena i la seva antiparal·lela també s’escurça un 40% respecte el DNA B. Això provoca un augment de la repulsió entre fosfats. Això explica que a l’experiment de Jovin s’hagués de posar una alta concentració salina al DNA per tal de poder experimentar amb el DNA Z. La conformació d’un DNA depèn en part de la seqüència, però també de les condicions del medi i altres elements que puguin alterar el DNA. Perquè es formi el DNA Z, per exemple, cal que hi hagi en una mateixa cadena alternança Pu-Py.
1.5 ESTUDI DE LES SEQÜÈNCIES POLI DA I POLI DT.
Els oligonucleòtids de cadenes d’A i T complementàries són molt especials.
En aquest DNA, si hi afegim histones no es formen els nucleosomes. Això ens indica que el DNA no està ben protegit. Van pensar que segurament el que impedia la formació dels nucleosomes era que aquest DNA era molt rígid. En fer l’anàlisi estructural, van apreciar que aquests oligos agafen un angle de propellor molt marcat que fa que es produeixi un pont d’hidrogen extra: l’oxigen 4 de la timina s’uneix per pont d’hidrogen amb el nitrogen 6 de l’adenina del pis de sobre. Aquests ponts travessers dónen rigidesa i impedeixen que es puguin doblegar per formar els nucleosomes.
...