Tema 11. Estructura dels àcids nucleics. El DNA (2014)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Pompeu Fabra (UPF)
Grado Medicina - 1º curso
Asignatura Bioquímica I
Año del apunte 2014
Páginas 19
Fecha de subida 02/02/2015
Descargas 15
Subido por

Vista previa del texto

Tema 11. Estructura dels àcids nucleics: el DNA NUCLEÒSIDS I NUCLEÒTIDS Els nucleòsids es componen per un sucre, que pot ser ribosa o desoxiribosa, i una base nitrogenada que s’hi uneix covalentment. Els nucleòtids són resultat de la unió d’un grup fosfat a un nucleòsid.
Base nitrogenada Bases nitrogenades puríniques Derivades de la purina Bases nitrogenades pirimidíniques Derivades de la pirimidina Nomenclatura Base Nucleòsid Nucleòtid Adenosin monofosfat (AMP) Àcid adenílic Adenina (A) Adenosina Guanina (G) Guanosina Guanosin monofosfat (GMP) Àcid guanidílic Citosina (C) Citidina Citidin monofosfat (CMP) Àcid cidílic Timina (T) Timidina Timidin monofosfat (TMP) Àcid timidílic Uracil (U) Uridina Uridin monofosfat (UMP) Àcid uridílic Forma tautomèrica Les bases nitrogenades normalment presenten forma tautomèrica, un tipus d’isomeria.
Conformacions syn i anti L’enllaç glucosídic de les bases nitrogenades pot ser syn o anti en funció de l’orientació d’aquestes: Nucleòtids no nucleics En els nucleòtids cíclics un mateix fosfat es troba esterificant dues posicions de la ribosa. El cAMP funciona com a cofactor d’alguns enzims, com per exemple la proteïna quinasa dependent del cAMP. Amb el trencament d’un dels enllaços s’obtindrà AMP.
ÀCID DESOXIRIBONUCLEIC (DNA) I ÀCID RIBONUCLEIC (RNA) La unió dels nucleòtids per mitjà de grups fosfat pot donar petits polímers: oligonucleòtids o polinucleòtids, que s’anomenen amb les bases nitrogenades que els formen, doncs és això el que els identifica.
El DNA i el RNA són cadenes llargues de nucleòsids, on es considera com a inici l’extrem 5 terminal (5’) i l’extrem 3 terminal (3’) com a final. Els grups fosfats actuen unint la posició 3’ i la posició 5’ dels diferents nucleòsids.
L’àcid ribonucleic (RNA) conté nucleòsids formats a partir d’una ribosa i les bases nitrogenades adenina, citosina, guanina i uracil.
L’àcid desoxiribonucleic (DNA) conté nucleòsids formats a partir d’una desoxiribosa (protó en lloc d’alcohol en el segon carboni) i les bases nitrogenades adenina, citosina, guanina i timina.
Per comparació les molècules de DNA són molt més grans que les molècules de proteïnes, ja que el DNA està format per moltes més subunitats. Això, però, els fa més fràgils i augmentant tendència a trencar-se quan els posem en un líquid en moviment per les forces de cisallament provocades per la diferència de velocitat entre les làmines.
Determinació de la composició del DNA Regla de Chargaff Chargaff observa que, excepte en alguns DNAs molt peculiars, existeix una relació en la proporció d’adenina i timina i guanina i citosina.
Estructura regular La cristal·lografia de Raigs X mostra una estructura molt regular i el patró en forma de creu indica una estructura helicoïdal. S’extreu que l’elevació de l’hèlix (distància entre plans) és de 0,34nm i que hi ha 10 parells de bases per repetició.
COOFORMACIÓ B DEL DNA O DOBLE HÈLIX ANTIPARAL·LELA. EL MODEL DE WATSON I CRICK Watson i Crick determinen l’estructura de doble hèlix antiparal·lela del DNA o conformació b.
Segons aquest model el DNA presenta una estructura molt compacta amb les càrregues negatives dels fosfats cap a l’exterior i les bases nitrogenades situades a l’interior de l’hèlix. El pla de les bases és quasi perpendicular a l’eix de l’hèlix i es troben enfrontades una purina i una pirimidina, seguint la regla de Chargaff. Adenina i timina s’uneixen mitjançant dos ponts d’hidrogen i citosina (A=T) i guanina s’uneixen amb tres (C≡G). L’enfrontament entre una purina i una pirimidina s’explica perquè dues purines no caben a l’espai interior de la doble hèlix mentre que dues pirimidíniques deixen massa espai enmig.
Sentit hèlix Dextrogira Diàmetre ≈20Å Parell de bases per volta d’hèlix 10 Gir d’hèlix per parell de bases 36o Elevació de l’hèlix 34Å Elevació per base nitrogenada 3,4Å Solc major Ampli i profund Solc menor Estret i profund Enllaç glicosídic Anti La conformació b del DNA pot presentar variacions locals en al seva estructura en algunes condicions. Sovint les bases aparellades no són exactament coplanars.
ALTRES POSSIBLES CONFORMACIONS DEL DNA Conformació a La presència d’un grup alcohol a la posició 2 de la ribosa (ribonucleòtid en lloc de desoxiribonucleòtid) desestabilitza la conformació b del DNA actuant com a impediment estèric. La conformació s’anomena en aquests casos conformació a i es dóna quan una de les molècules és RNA o híbrida de RNA i DNA o quan les condicions són de molt poca aigua (espores).
La conformació a presenta certes diferències en comparació amb la conformació b del DNA.
Principalment el seu solc principal és més estret mentre que el solc menor és més profund, l’espai interior és major i hi ha més bases per volta d’hèlix (11). Ambdues són dextrogires.
Conformació z En presència de moltes guanines i citosines seguides el DNA pot adoptar una conformació z.
En aquest cas l’hèlix és levogira, el diàmetre de l’espai interior és menor i hi ha més bases per volta d’hèlix. Es tracta d’una estructura frontera entre la conformació b i la desnaturalització.
Si bé tant en la conformació a com la en la conformació b les bases nitrogenades tenien un enllaç glucosídic anti, en la conformació z és anti per les pirimidines i syn per les purines.
Conformació h La conformació h del DNA es dóna quan hi ha moltes purines seguides i una de les cadenes de DNA reacciona amb dues cadenes simultàniament formant una hèlix triple.
En la conformació de triple hèlix, l’adenina pot formar acoblaments simultanis de Watson i Crick i de Hogsteen amb dues timines diferents. Watson i Crick i Hogsteen són dos models que expliquen els enllaços d’hidrogen i el segon té especial rellevància en la triple hèlix.
ESTRUCTURA DEL DNA Plegament del DNA La cadena de DNA és una cadena molt llarga que la cèl·lula ha de plegar per tal de fer-lo més compacte. Per aconseguir el plegament és necessari eliminar les repulsions electrostàtiques produïdes entre les càrregues negatives del grup fosfat. Amb aquest objectiu el DNA s’associa a histones: proteïnes bàsiques amb moltes lisines i arginines (càrregues positives) que apantallen les repulsions. El complex format pel DNA i la histona s’anomena nucleosoma. El plegament dels nucleosomes formarà les fibres de cromatina i aquestes, en algunes condicions, formaran una estructura visible: els cromosomes.
En algunes condicions, però, interessa que el DNA no sigui massa estable, de manera que la unió de les histones ha de ser modulable. La informació, per exemple, només serà accessible quan el DNA no es trobi formant nucleosomes. L’acetilació produïda per una histona acetilasa elimina la càrrega positiva de les histones evitant la seva interacció amb el DNA i permetent l’accessibilitat de la informació. Per altra banda, l’addició de sal incrementarà l’estabilitat del DNA ja que actuarà com a contraió apantallant les càrregues negatives.
BASES TERMODINÀMIQUES DEL PLEGAMENT DEL DNA La conformació b del DNA és la conformació més estable que aquest pot presentar i es dóna de manera espontània, de manera que és un procés afavorit termodinàmicament. En el procés de formació de la doble hèlix augmenta l’ordre i per tant es perd entropia. Això implica que el procés ha d’estar afavorit entàlpicament amb la formació de nous enllaços.
Si bé existeix un cert component hidrofòbic amb l’amagament de les bases nitrogenades a l’interior de l’hèlix, aquest no és tant important com ho era en proteïnes, doncs s’observa que en presència de detergent el plegament també es dóna tot i ser més costós.
També contribueixen, però no de forma determinant els ponts d’hidrogen formats entre les bases nitrogenades. La principal contribució d’aquests enllaços no seria en la formació de la doble hèlix sinó en l’augment de la seva estabilitat. Pel que fa als enllaços iònics no intervenen en aquest procés i, en tot cas, tindrien un efecte negatiu per la interacció entre les càrregues negatives del fosfat.
Les principals forces determinants en l’associació de les cadenes de DNA són les forces d’apilament o forces d’Stacking. Es tracta d’unes forces de Wan der Vaals entre dipols que es donen entre les bases de dos plans immediats gràcies a la poca distància que els separa (3,4Å).
Una petita afectació en la distància comportarà una gran afectació a les forces de Van der Waals i la desnaturalització de la doble cadena.
A partir de l’equació de Gibbs ΔG = ΔH – TΔS observem que un augment de la temperatura pot comportar la desnaturalització del DNA ja que la temperatura afecta a la distància entre les bases. La conformació b del DNA serà inestable a partir d’una temperatura de 70oC, anomenada temperatura de fusió o temperatura de desnaturalització.
Una estructura més estable tindrà una temperatura de fusió més elevada i diferents elements contribuiran a aquesta estabilitat.
- Enllaços pont d’hidrogen C ≡ G és més estable que A = T - Histones - Sal apantallament de les càrregues negatives - SDS Detergent, disminueix l’estabilitat L’estudi d’una mostra de DNA a diferents temperatures per absorbància permetrà determinar la temperatura aproximada de fusió ja que a aquesta temperatura es produeix un canvi molt brusc en l’absorbància.
Condicions en la hibridació de l’ADN. Encaix perfecte i cadenes amb petites diferències.
L’encaix entre dues cadenes de DNA no sempre interessa que es doni de manera exacta, sinó que a vegades les dues cadenes no són completament complementàries i difereixen en alguns punts. Les condicions en que es produeix la hibridació poden alterar-se per afavorir la unió disminuint la temperatura o augmentat la concentració de sal. Si, per contra, interessa que l’encaix sigui perfecte la hibridació es realitzarà a una temperatura propera a la temperatura de fusió i amb una petita quantitat de SDS.
SUPERENROTLLAMENT DEL DNA El DNA pot trobar-se relaxat o tensionat en funció de si passa o no pels punts que li toquen.
Relaxat i tensionat són dos topoisòmers del DNA. Es tracta de dues configuracions diferents, ja que és necessari el trencament d’enllaços per passar d’una a l’altra. Dins del DNA tensionat es distingeix entre DNA torsionat si hi ha un augment de la tensió o DNA retorçat si hi ha una disminució de l’espai. Es tracta de dues configuracions ja que són interconversibles.
Relaxat DNA Torsionat augment tensió Tensionat Retorçat disminució espai L’ADN, donada la seva llargada, es troba tensionat o superenrotllat dins la cèl·lula, suposant un allunyament de la conformació b.
El grau de tensió del DNA (ΔL) es mesura a partir del gir o torsió (ΔT) i del retorciment (ΔW).
El gir o torsió serà positiu o negatiu en funció de si s’augmenten o es disminueixen el número d’entrecreuaments, mentre que el retorciment serà positiu o negatiu en funció del sentit en què es doni.
L és el número de superenrotllament topològic, el número de vegades que s’entrecreuen les dues cadenes, i en la conformació b serà L0: número de lligament o d’enllaç. Variacions sobre aquest número, ja sigui per un augment del gir o per un augment de la tensió suposarà tensió (ΔL≠0). Torsió i retorciment seran interconversibles sense trencament d’enllaços.
La densitat superhelicoidal (σ) permet mesurar el grau de superenrotllament. ΔL fa referència a la variació de girs i L és el número de lligament o d’enllaç, el número de vegades que s’entrecreuen les cadenes en la configuració b, per tant s’observa que no tindrà les mateixes implicacions un canvi si el número de bases nitrogenades és gran o petit (10 parells de bases per volta en la configuració b).
El pas d’una configuració relaxada a una configuració tensionada requereix l’aportament d’energia per part de l’ATP. Aproximadament la hidròlisi de l’ATP proporciona una σ de 0,06, és a dir, 6 retorciments positius o negatius en una doble hèlix que s’entrecreua 100 cops (1000pb). En alguns casos no interessa una conformació massa estable del DNA, de manera que aquesta tensió pot servir per acumular energia.
Introducció de superenrotllament La topoisomerasa II o girasa introdueix superenrotllament al DNA a partir de la hidròlisi de l’ATP (és ATP dependent), doncs tots els organismes necessiten cert grau de separació de la conformació més estable, la conformació b, a partir del superenrotllament.
Actua tallant la doble hèlix i fent passar la cadena pel forat: La DNA girasa bacteriana és el blanc d’antibiòtics com al novocina, l’àcid nalidíxic o la ciprofloxacina.
La doxorrubicina i l’etopòsid són dos medicaments utilitzats en la quimioteràpia del càncer que actuen anul·lant la DNA girasa eucariota de compostos tumorals, necessària per la replicació de l’ADN.
Disminució de la tensió La tomoisomerasa I realitza l’efecte contrari i rebaixa la tensió al DNA. Si bé aquesta no requereix l’aportament d’energia, tampoc en produeix i és un enzim vital per la vida donat que totes les proteïnes necessiten, en algun moment, eliminar tensió. És el blanc de compostos antitumorals com per exemple la camptoecina.
TÈCNIQUES D’ANÀLISI DEL DNA Electroforesi en gels d’agarosa El DNA pot separar-se mitjançant electroforesi en gels d’agarosa. A diferència de les proteïnes, no és necessària l’addició de SDS ja que totes les molècules de DNA ja tenen càrrega negativa i la separació es realitza en funció de la seva migració cap al pol negatiu depenent de la relació càrrega/massa. Igual que en les proteïnes, les molècules més grans tindran més dificultats per passar pel gel i tindran una migració més lenta.
En l’anàlisi del DNA s’utilitzen agents intercalants per tenyir el DNA, principalment bromur d’etidi, taronja d’acridina i actinomicina D, i posteriorment es realitzava l’observació amb llum ultraviolada.
DNA relaxat DNA superenrotllat Les dues bandes representen el mateix plasmidi El pes molecular s’expressa en kpb, quilo parells de bases POLIMERITZACIÓ DEL DNA La polimerització del DNA consisteix en la prolongació de les cadenes per l’acció de la DNA polimerasa que catalitza la formació d’enllaços fosfodiéster. Actuen unint desoxiribonucleòtids en funció de la cadena complementària, que actua com a plantilla o motlle.
Activitat exonucleasa de la DNA polimerasa La DNA polimerasa té la capacitat de detectar i corregir possibles errors (missmatches) gràcies a la seva activitat exonucleasa, que actua tallant la cadena. Presenta un fragment 5’-3’ exonucleasa però també un fragment 3’-5’ exonucleasa que li permet tornar enrere.
Aquests errors poden ser mutacions naturals per tautomerització de les base nitrogenades. La tautomeria és un tipus d’isomeria en què les dues espècies es troben en equilibri i poden convetir-se mitjançant processos reversibles. En el cas de les bases nitrogenades el tautòmer ceto és predominant enfront el tautòmer enol. La presència d’aquest segon provoca l’associació una associació amb una base errònia. La timina, per exemple, s’associa de manera habitual amb l’adenina mitjançant dos ponts d’hidrogen. La forma enol, però, causa l’associació amb la guanina mitjançant tres ponts d’hidrogen.
La reparació dels errors requereix l’acció d’un complex enzimàtic, l’exonucleasa 1, que actua tallant al voltant de l’error detectat per tal que la polimerasa torni a realitzar la replicació.
Metilació del DNA La metilació del DNA mitjançant la formació de 5-metilcitosina permet reconèixer en una doble hèlix quina cadena és la cadena patró i quina ha estat la replicada. D’aquesta manera, quan es detecta un error, és possible saber quina cadena cal corregir, ja que serà sempre la no metilada. En vertebrats la metilació només es dóna en citosines dins de seqüències CG i degut a l’existència de metilases dirigides per metil-Cs un cop establert el patró de metilació els llocs de metilació s’hereten al DNA en la descendència.
La metilació no es dóna de manera continua al llarg de tota la cadena sinó que algunes parts contenen més metilacions que d’altres. Les illes CG, seqüències riques en CG, són particularment abundants als promotors i als primers exons de gens.
A més de per la correcció d’errors durant la replicació, la metilació del DNA és necessària pel silenciament de gens. És essencial pel desenvolupament en mamífers (“genetic imprinting”, inactivació del cromosoma X en femelles), per l’organització correcta de la cromatina en els estats actius (eucromatina) i inactiu (heterocromatina) i per l’expressió teixit específica de gens.
Desaminació del DNA La desaminació hidrolítica consisteix en la pèrdua d’un grup amí i provoca un canvi de base nitrogenada. La desaminació de la citosina produeix uracil, que s’unirà amb adenina en lloc de fer-ho amb guanina, i la desaminació de l’adenina produirà hipoxantina que s’unirà amb citosina. Aquestes modificacions provoquen una replicació errònia de les cadenes originals.
La desaminació hidrolítica de la citosina és fàcilment detectable donat que uracil no és una base nitrogenada del DNA. La correcció es realitzarà eliminant aquest uracil abans del procés de replicació i substituint-lo per una citosina, la base complementària de guanina. Si la replicació es dóna apareixerà una mutació, passant a tenir T=A en lloc de C≡G.
La presència de timina en lloc d’uracil al DNA és la que permet la reparació de les citosines desaminades. Aquestes dues bases es diferencien únicament per un grup metil que conté la timina. Si el DNA tingués uracil en lloc de timina seria molt més mutagènic ja que seria impossible detectar quan un uracil és resultat de la desaminació d’una citosina i quan no ho és, de manera que la modificació es mantindria amb el procés de replicació.
MUTÀGENS Els compostos mutagènics són compostos que, per algun tipus d’agent extern, han patit una alteració que provoca que una base del DNA hibridi sobre una que no li correspon, de manera que la seva lectura es veu alterada.
Radiació ultraviolada Els rajos ultraviolats provoquen la unió covalent de dues timines consecutives donant lloc a la formació de dímers de timina que impedeixen la formació de la doble hèlix. Aquests dímers poden ser ciclobutans o 6-4 fotoproductes i han de ser corregits abans que la DNA polimerasa comenci a actuar, ja que en cas contrari no els reconeix i afegeix com a base complementària una base a l’atzar.
La reparació realitza després de la detecció de l’error eliminant aquest amb les bases que l’envolten, refent la seqüència amb una DNA polimerasa i unint els fragments amb una DNA ligasa.
Agents O-alquilants: metilació de la guanina La metilació de la guanina per agents O-alquilants provoca que s’associï amb la timina en lloc de fer-ho amb l’adenina.
Agents nitrosilants: nitrosilació de la citosina La nitrosilació de la citosina provoca el seu aparellament amb l’adenina en lloc de amb la guanina.
Mutagènesi per anàlegs de les bases La mutagènesi també pot ser produïda per anàlegs de les bases, com és el cas dels tautòmers.
És el cas dels tautòmers imino de l’adenina i la 2-aminopurina (anàleg de l’adenina), que s’associen amb citosines.
Mutagènesi per agents intercalants Els agents intercalants són compostos plans amb certa analogia amb les bases que es col·loquen enmig de la cadena i modifiquen la pauta de lectura. La DNA polimerasa, en el procés de replicació, detecta la presència de quelcom que s’assimila a una base i afegeix una base a la cadena complementària fent que es modifiquin els triplets quan es realitzi la traducció.
AMPLIFICACIÓ DEL DNA La reacció en cadena de la polimerasa (PCR) és una tècnica que té com a objectiu l’obtenció d’un gran nombre de còpies d’un fragment de DNA a partir d’una quantitat mínima. La duplicació al laboratori es realitza mitjançant la separació de les cadenes per desnaturalització mitjançant un augment de la temperatura, la unió d’uns encebadors i l’extensió per la DNA polimerasa. Aquestes tres fases formen un cicle que es pot anar repetint i en cada cicle es duplica la quantitat de DNA (n cicles = 2n còpies).
1. Fase de desnaturalització 92-95oC – 30 segons 2. Fase d’anillament 50-60oC – 30 segons 3. Fase de polimerització 1 minut (en funció de la llargada de la cadena) Còpies DNA = 2n · Y Y número inicial de còpies de DNA L’augment de la temperatura per desnaturalitzar les cadenes desnaturalitza també la DNA polimerasa, de manera que seria necessari afegir-ne en cada cicle per continuar el procés. És per això que aquesta tècnica es basa en la utilització de DNA polimerases termostables que no es desnaturalitza amb la temperatura i permet la realització de cicles consecutius sense la necessitat d’afegir enzim. La utilització de la DNA polimerasa termostable permet l’automatització del procés amb un termociclador, que actua modificant la temperatura amb el temps.
La col·locació dels oligonucleòtids en el sentit correcte és imprescindible, ja que les DNA polimerases actuen exclusivament de 5’ a 3’. És possible la utilització d’oligonucleòtids que no siguin exactament complementaris a la cadena a duplicar mitjançant una disminució de la temperatura, que permetrà l’anillament i la síntesi.
El principal avantatge d’aquesta tècnica és que és una tècnica molt sensible, però això implica un desavantatge, i es que és altament susceptible a contaminació.
SEQÜENCIACIÓ DEL DNA. MÈTODE DE SANGER La seqüenciació del DNA es basa en l’ús de 2,3 dideoxinucleòtids, anàlegs dels nucleòtids també anomenats terminadors, que aturen la reacció catalitzada per la DNA polimerasa. És una tècnica molt més barata i ràpida que la seqüenciació de proteïnes.
El mètode de Sanger consisteix en realitzar l’amplificació del DNA en presència de diferents deoxinucleòtids i dideoxinucleòtids marcats. La proporció de dideoxinucleòtids enfront de deoxinucleòtids és d’1/10, ja que interessa que només acabi una petita part de les cadenes.
Es realitzarà, per tant, la desnaturalització de les cadenes, l’anillament de l’encebador i la polimerització en presència de diferents dideoxinucleòtids, de manera que la reacció acabarà en diferents punts. A continuació es realitza una electroforesi, que separa les cadenes en funció de la massa, i es visualitzen mitjançant una autoradiografia.
L’autoradiografia de l’electroforesi pot llegir-se de baix a dalt, de fragment més petit a fragment més gran, obtenint-se així la seqüència de la cadena de DNA.
5’-TTGGGGTTCGGAAGCTATCTATCAAAAGTCAAATGGCTGTAG-3’ Aquest mètode s’aplica actualment amb alguna modificació: la principal és el marcatge dels dideoxinucleòtids terminadors amb fluorescència en lloc de amb radioactivitat. En aquest cas cada base està marcada amb un colorant fluorescent diferent, amb fluorescència a diferents longituds d’ona (diferents colors). L’ordre dels pics indicarà l’ordre de les bases i no serà rellevant la seva alçada.
TÈCNIQUES D’ANÀLISI I MANIPULACIÓ DEL DNA Les endonucleases de restricció són enzims que tallen el seqüències molt específiques del DNA.
Habitualment són palindròmiques, tallen al mateix punt en les dues cadenes ja que la seqüència complementària llegida a l’inrevés coincideix amb la seqüència que tallen, i poden donar lloc a extrems roms o extrems cohesius.
Les endonucleases de restricció poden utilitzar-se tant per tallar el DNA per punts molt específics com per tallar-lo per punts qualssevol i permetre’n una millor manipulació.
Southern Blot L’anàlisi del DNA es realitza mitjançant Southern Blot, basat en la separació de les seqüències de DNA en funció del pes molecular mitjançant l’electroforesi en gel d’agarosa i la seva transferència en una membrana de nitrocel·lulosa. Un cop realitzada la transferència es desnaturalitza la doble hèlix amb un increment de temperatura i s’hibrida amb una seqüència d’oligonucleòtid anomenada sonda, que és complementària a la seqüència que s’està buscant.
Aquesta sonda està marcada radioactivament, de manera que es pot realitzar una autoradiografia per detectar els fragments hibridats.
La modificació de les condicions en què es dóna la hibridació mitjançant alteracions de la temperatura, la concentració de SDS o de sal permetrà que la hibridació sigui més o menys selectiva en funció de si busquem una seqüència de DNA molt concreta o si no la coneixem de manera exacta.
El marcatge de les sondes pot realitzar-se de diferents maneres: 1. Desnaturalització del DNA Anellament de l’oligonucleòtid específic Polimerització en presència de dATP, dCTP, dTTP i dGTP (α-P32) 2. Defosforilació amb una fosfatasa Fosforilació amb polinucleòtid quinasa i ATP Desnaturalització del DNA 3. Formació de “nicks” (osques) al DNA Reparació: polimerització en presència de dATP, dCTP, dTTP i dGTP (α-P32) Desnaturalització del DNA Immunoprecipitació de cromatina La immunoprecipitació de cromatina s’utilitza per detectar complexes DNA-proteïna i determinar a quina regió de el DNA s’uneix aquesta proteïna. El procés consisteix en: 1) Tractament amb formaldehid per formar enllaços covalents i evitar la separació del complex.
2) Lisis cel·lular, preparació i ruptura controlada del DNA mitjançant sonicació (ultrasons) per obtenir fragments de 500 parells de bases. D’aquesta manera es disposa d’una solució amb DNA fragmentat i complexes de DNA fragmentat i proteïna.
3) Immunoprecipitació amb anticossos específics per la proteïna per coimmunoprecipitar el fragment de DNA unit a ella.
4) Reversió de l’entrecreuament per separar el complex 5) Eliminació de la proteïna i l’anticòs amb proteïnasa K.
6) Purificació del DNA 7) Anàlisi del DNA per PCR quantitativa amb oligonucleòtids corresponents a diferents regions del genoma.
L’experiment requereix la realització de diferents controls. En primer lloc cal realitzar un control positiu i comprovar que el fragment de DNA es detecta al fragment original de DNA (input) i en segon lloc cal realitzar un control negatiu i comprovar que el fragment de DNA no es detecta amb una proteïna que sabem que no l’uneix.
CONCEPTES IMPORTANTS Els compostos dels nucleòtids i identificar les cinc bases que els composen.
Les propietats bàsiques d’un àcid nucleic Les característiques físiques de la conformació b del DNA i distingir-la de les conformacions a i z.
Les característiques generals de les histones i com es regulen.
Saber quines forces estabilitzen la doble hèlix del DNA.
Indicar què és la temperatura de fusió o desnaturalització del DNA i de quins factors depèn.
Entendre com el DNA es troba tensionat a la cèl·lula i què suposa això per la seva estructura i la seva estabilitat.
Indicar com es poden separar els fragments de DNA al laboratori i com es visualitzen.
Indicar com es produeix la polimerització del DNA al laboratori i quins requeriments té Recordar com es produeixen les mutacions i com la cèl·lula les repara Descriure quin tipus de modificació pateix el DNA i perquè serveix.
Descriure la tècnica d’amplificació del DNA basat en l’acció del DNA polimerases termostables (PCR), entendre com funciona i dissenyar oligonucleòtids per amplificar una seqüència determinada.
Comprendre en què consisteix la tècnica de seqüenciació del DNA Entendre com es determina la presència de DNA mitjançant Southern Blot Saber com es marca una sonda de DNA Indicar com es determina si una proteïna s’uneix al DNA ...