TEMA 1. CROMOSOMA BACTERIÀ (2014)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Genética - 2º curso
Asignatura Biologia Molecular de Procariotes
Año del apunte 2014
Páginas 27
Fecha de subida 22/10/2014
Descargas 21
Subido por

Vista previa del texto

TEMA 1: CROMOSOMA BACTERIÀ - Circular.
dsDNA.
No té introns (no és del tot cert, més aviat podríem dir que no té “DNA brossa”).
No està dins el nucli.
Té elements mòbils.
Hi ha plasmidis (formen part del genoma, no del cromosoma).
El cromosoma bacterià és petit comparat amb el d’un eucariota. Aquest oscil·la entre 0,5 Mb i 10 Mb. HI ha un ventall de mides molt gran, tot i que la majoria estan situats entre les 3 i les 5 Mb (ex: E. coli).
El cromosoma és dsDNA (bicatenari) i cccDNA (circular i covalentment tancat). Això vol dir que no té ni inici ni final.
Sempre és cccDNA? NO. Alguns microorganismes tenen cromosomes lineals, i per tant no són covalentment tancats, però sí tenen dsDNA (ex: Borrelia burgdorferi, Agrobacterium tumefaciens i Streptomyces coelicolor). Fins i tot s’ha construït un bacteri E. coli amb DNA lineal, i funciona igual que un amb DNA circular, la qual cosa prova que no és necessari que el DNA sigui circular, sempre que hi hagi la maquinària de replicació necessària.
Els cromosomes cccDNA són altament estables: és molt difícil incidir nou DNA o trencar el DNA del cromosoma, a no ser que hi hagi un forat específic. Aquests són punts de separació de DNA anomenats nicks (poden tenir altres noms) on poden actuar enzims per degradar el DNA (nucleases intracel·lulars). Si el cromosoma fos lineal, en els extrems sempre podrien actuar aquests enzims, i per això els circulars són més estables. Tot i això, els cromosomes lineals tenen sistemes de protecció en els extrems que els fan estables davant d’aquests enzims. Els 5’ són els extrems més sensibles. Els sistemes de protecció són: - Hairpin telomere: enllaç covalent entre l’extrem 5’ i el 3’ del DNA. POWER. Això ho uneix un enzim que reconeix els dos extrems. La configuració de l’extrem canvia una mica perquè les bases complementàries no estan unides per ponts d’hidrogen, ja que l’estructura del nucleòtid és diferent de la normal.
- Invertron telomere: hi ha una proteïna unida covalentment a l’extrem 5’ que bloqueja l’entrada d’exonucleases. Ex: Streptomyces.
Els cromosomes de procariotes tenen només un origen de replicació (OriC). Els bacteris tenen només un cromosoma. Sempre? NO! Alguns microorganismes tenen 2, 3 o fins i tot més cromosomes. Un mateix microorganisme pot tenir uns cromosomes lineals i altres circulars.
Genoma: cromosoma bacterià + material extracromosòmic (bacteriòfags, plasmidis...).
El material extracromosòmic també aporta informació genètica.
Els diversos fragments de material extracromosòmic poden ser indispensables. Per exemple, Borrelia burgdorferi té 23 elements extracromosòmics i tots són indispensables.
Genoma de Borrelia burgdorferi.
També hi ha megaplasmidis, que són plasmidis molt grans, que mesuren més d’1 Mb. Tant els megaplasmidis com els plasmidis són cccDNA i dsDNA.
En què es diferencien un cromosoma i un megaplasmidi? El contingut del DNA pot ser més o menys essencial. Si és essencial, és un cromosoma. Si no ho és, i a més fa més d’1 Mb, és un megaplasmidi. Un (mega)plasmidi pot ser essencial o necessari, o cap d’aquests dos. Si és necessari, vol dir que aporta unes característiques bones per l’organisme, però que no són indispensables per la vida. Si és essencial, vol dir que sense ell no pot viure. Un (mega)plasmidi es pot convertir en un plasmidi essencial depenent de les característiques del medi.
Per poder classificar els gens en essencials o necessaris, per tant, hem de saber la seva funció.
Si aquesta no se sap, pot ser difícil fer aquesta classificació.
Els procariotes no tenen nucli. Sempre? Hi ha alguns bacteris amb una cosa semblant a una membrana nuclear que envolta el material genètic. Però no és ben bé la membrana que coneixem, per tant és un pseudonucli.
El material genètic dels procariotes està altament compactat (com en eucariotes). Està compactat unes 1000 vegades respecta a com estaria linealment. Ocupa un lloc específic al citoplasma, i es mou amb una direcció específica.
Exemple de DNA sense compactar.
No hi ha nucli, sinó nucleoide. El DNA està organitzat en dominis, i l’OriC interacciona amb les parets de la cèl·lula. La transcripció i la traducció es fan al mateix lloc, però els ribosomes estan justament als llocs del citoplasma on no hi ha DNA! El que passa és que les zones que es transcriuen són les zones perifèriques del nucleoide, just al costat d’on hi ha els ribosomes. A la zona interna del nucleoide, el DNA està més compactat i no hi ha ribosomes, i per tant no es transcriu ni es tradueix. És per tant molt important la posició i moviment del DNA.
La localització d’un gen és important per saber com es transcriu. Per a què un gen es pugui expressar s’ha de reubicar, s’ha de moure tot el nucleoide per deixar aquest gen a la zona perifèrica, a tocar dels ribosomes. Així doncs, la ubicació d’un gen pot determinar el seu grau d’expressió.
ARQUITECTURA DEL DNA BACTERIÀ Es coneix poc.
- El DNA es sobreenrotlla.
Acció de les NAPs (nucleòtid-associated-proteins).
Molecular crowding (amuntegament molecular).
Hi ha d’haver un equilibri entre la compactació i l’activitat de la cèl·lula. Com més activitat, més expressió de gens hi ha d’haver, i per tant menys compactació.
SOBREENROTLLAMENT Moure una part de la cadena de DNA fa que una altra se sobreenrotlli. El sobreenrotllament genera torsions.
Enzims tropoisomerases: generen sobreenrotllament per compactar el DNA. Poden fer el sobreenrotllament positiu o negatiu, per tensar (-) o destensar (+) el DNA. És important destensar-lo en la replicació. Per això produeixen talls en les cadenes de DNA, hi fan una volta més o menys i després el tornen a unir: - Tropoisomerasa 1: talla 1 cadena, i desenrotlla una volta.
Tropoisomerasa 2 (girasa): talla 2 cadenes, i desenrotlla un loop, dues voltes.
NAPs (Nucleotid-Associated-Proteins) Embolcallen, recobreixen, connecten i flexionen el DNA per canviar l’estructura dels nucleòtids.
Aquestes proteïnes són les que formen els nucleosomes en els procariotes, que s’anomenen nucleosoma-like perquè s’assemblen molt als dels eucariotes, però té unes altres proteïnes.
Després de la fibra de 10 nm, també forma loops, l’empaquetament del DNA en procariotes.
Les proteïnes equivalents a les histones dels eucariotes s’uneixen en dímers al DNA. Dos dímers, és a dir, un tetràmer d’aquestes proteïnes formen un nucleosoma-like, que queda envoltat per 39 pb.
Altres NAPs fixen els loops de sobreenrotllament, i generen dominis en el cromosoma bacterià.
Una topoisomerasa pot actuar només sobre un loop o domini i no afectar als altres: Hi ha moltíssimes NAPs: algunes generen torsió, altres recobreixen el DNA, altres el compacten, altres hi fan nusos... Ex: DPS té un efecte compactador.
Cap de les NAPs conegudes és essencial en els bacteris, per això es desconeix si potser hi ha una proteïna majoritària encarregada de l’empaquetament (com a mínim en microorganismes model com E. coli i B. subtilis).
MOLECULAR CROWDING És l’amuntegament molecular, un acumulament molt gran de molècules aparentment desordenades, però que en realitat sí que guarden un ordre. Això és necessari perquè la densitat del citoplasma és molt alta, i el citoplasma no és homogeni.
La gran quantitat de macromolècules en l’interior de la cèl·lula i en aquest cas l’elevada densitat del nucleoide redueix el volum de solvent accessible a altres macromolècules. Això dóna lloc a una major compactació i a l’increment de l’estabilitat de les NAPs associades al DNA. De la mateixa manera, també afavoreix a que els processos de transcripció i transducció tinguin lloc al llindar del nucleoide.
Actualment hi ha la hipòtesi de que aquest efecte és el més important en la compactació del DNA al nucleoide.
Com no hi ha prou solvent, les NAPs no tenen més remei que unir-se al DNA i aquest es compacta. Les proteïnes tenen una constant d’afinitat amb el DNA, i una altra amb el solvent.
Per tant, segons la situació, pot ser que s’uneixin al DNA o no. Dins una cèl·lula, la quantitat de solvent és poca, i llavors la constant d’afinitat amb el DNA és molt més gran que in vitro. Per tant, les NAPs s’uneixen amb el DNA i aquest es compacta.
A les vores del nucleoide és on hi ha més solvent, i per això les NAPs es poden desenganxar del DNA i deixar que altres proteïnes hi puguin interaccionar, per que es puguin dur a terme la transcripció i la traducció.
Quins són els papers de les NAPs? - Donen l’arquitectura al DNA.
Regulen l’expressió gènica.
Ubiquen el DNA a la cèl·lula.
Si hi ha proteïnes que torsionen el DNA i formen ponts, aquesta estructura pot facilitar o entropir l’entrada d’altres proteïnes (amb qualsevol funció: RNA polimerases, repressors, activadors...) associades al DNA.
Això fa que els gens es puguin expressar més o menys.
En les diferents fases d’una corba de creixement d’una població bacteriana, la concentració de NAPs varia. Això vol dir que les proteïnes que s’uneixen al DNA van variant.
El DNA també es mou sobre el citoesquelet i s’hi ubica. L’OriC i el punt terminal d’un cromosoma no se situen aleatòriament dins la cèl·lula, sinó que aquesta posició va variant durant el cicle cel·lular. El genòfor (cromosoma bacterià) es mou pel citoesquelet controlant la posició de tot el nucleoide, i permetent que la divisió es faci correctament.
Si el gen de les proteïnes MUK (un tipus de NAPs) es muta, això varia: el cromosoma no es pot separar bé perquè l’OriC i el punt terminal no s’ubiquen bé, i llavors les cèl·lules descendents no poden sobreviure.
LA REPLICACIÓ DEL DNA EN PROCARIOTES Els components de l’aparell de replicació són: - - DNA-polimerases: n’hi ha dos tipus que intervinguin en una replicació normal, cada una amb una funció. Els altres tipus (n’hi ha tres més) intervenen quan hi ha problemes en la replicació, com lesions en el DNA.
Encebadors (primers): són creats per la RNA-polimerasa, de la qual només n’hi ha un tipus.
Topoisomerasa (girasa): obre el DNA (fa voltes i el destensa). Deixa el DNA a punt perquè les dues cadenes puguin ser separades per l’helicasa.
Helicasa: obre les dues cadenes i les manté estables.
Nucleòtids suficients per replicar: específicament hi ha d’haver desoxiribonucleòtids, i no ribonucleòtids.
A més, també es necessita un senyal cel·lular previ a l’inici de la replicació perquè aquesta comenci.
Un primosoma és el conjunt d’enzims que intervenen en la formació de l’encebador de RNA que permetrà l’inici de la replicació de la cadena líder i de cada un dels fragments d’Okazaki: - DnaG (primasa): és la RNA-polimerasa.
Complex DnaB/DnaC: helicasa.
DnaT.
PriA, PriB, PriC.
Si la DNA-polimerasa 3 té una mutació, és letal, perquè no es pot dur a terme la replicació. Si la mutació la té la DNA-polimerasa 1, hi ha una baixa viabilitat si és defectiva en activitat Exo 5’3’.
La DNA-polimerasa més important és la 3. És la que realment està encarregada del procés de replicació. Té una taxa d’error molt baixa, per tant la replicació que fa és molt viable. La DNApolimerasa 1 s’equivoca més i és capaç de fer d’una tirada seqüències més curtes que la 3, només pot fer petits fragments. La 1, però, és molt més freqüent dins la cèl·lula i té activitat exonucleasa 5’3’, cosa que la polimerasa 3 no té. Tant la 1 com la 3, però, sí que tenen l’activitat polimerasa 3’5’. L’activitat exonucleasa 5’3’ permet eliminar els nucleòtids que la polimerasa 1 es va trobant per davant, i no només els de darrere. Això vol dir que pot eliminar els encebadors dels fragments d’Okazaki.
L’activitat proofreading és una capacitat que tenen les dues polimerases, que els permet assegurar-se del que han copiat, i reparar-ho si està malament. Aquesta activitat, però, és molt més bona en la polimerasa 3. Per això la replicació que fa aquesta és més fiable, perquè se n’adona abans dels errors i els corregeix amb més precisió. Per canviar una base que ja ha estat posada és pel que és necessari l’activitat exonucleasa 3’5’.
La ligasa produeix l’enllaç fosfodièster entre els nucleòtids que han quedat separats a causa dels fragments d’Okazaki a la cadena retardada.
La DNA-polimerasa 1, comença a replicar a la cadena retardada en els forats que han quedat entre fragments d’Okazaki, va replicant en sentit 5’3’ i gràcies a la seva activitat exonucleasa 5’3’ pot eliminar els encebadors que es va trobant, i fins i tot continua una mica més i torna a replicar una zona que ja estava replicada. Però com només és capaç de replicar petits fragments, es desenganxa ràpid de la cadena, i no acaba replicant tot el cromosoma un altre cop, sinó que només té el temps suficient per eliminar l’encebador i una mica més.
La DNA-polimerasa 1 és una proteïna monomèrica (codificada per un gen). La DNA-polimerasa 3 és hetermultimèrica, té moltes subunitats, és un holoenzim.
MODEL DEL TROMBÓ L’activitat polimerasa es pot observar marcant nucleòtids. Així s’ha vist que aquesta activitat està concentrada en un punt, que no es desplaça al llarg de la cadena, sinó que és la cadena la que es va movent i passant per on es troba el complex replicatiu. En aquell punt té lloc la replicació de la cadena patró i de la retardada.
L’holoenzim polimerasa 3 recull les dues cadenes. Una de les seves subunitats és l’helicasa, que separa cada monocadena. Llavors la polimerasa 3 pot replicar cada una de les monocadenes en sentit 5’3’. La cadena a replicar de la patró (leading strand) està en sentit 5’3’, però la retardada no! La cadena retardada llavors crea un loop.
Com sabem, la cadena retardada es replica per fragments, els fragments d’Okazaki. La monocadena que queda a l’espera de ser replicada, és estabilitzada per les proteïnes SSB.
També és molt important la proteïna β-CLAM, que manté unida la DNA-polimerasa 3 amb el DNA. Aquesta proteïna, en la replicació de la cadena patró, sempre està unida a la polimerasa, i això fa que polimerasa i DNA mai se separin, de manera que aquesta cadena es repliqui tota d’una tirada. En comptes, en la cadena retardada la β-CLAM es va desenganxant i tornant a unir a la polimerasa 3. Concretament, s’uneix quan detecta un encebador a la cadena retardada.
Quan la DNA-polimerasa arriba al següent fragment d’Okazaki ja replicat, la β-CLAM es torna a separar d’ella, de manera que la cadena retardada queda lliure. La polimerasa s’hi tornarà a unir a l’encebador següent. Així es van creant els fragments d’Okazaki en la cadena retardada.
La DNA-polimerasa 1 eliminarà després l’RNA dels encebadors que han quedat a la cadena retardada. El lloc on se situa la DNA-polimerasa 3 s’anomena replisoma.
PASSOS LIMITANTS DURANT LA REPLICACIÓ La síntesi de nucleòtids, concretament desoxiribonucleòtids (dNTPs) és un pas limitant de la replicació del DNA. A la cèl·lula, per cada dNTP trobem 1000 NTPs (ribonucleòtids). Això és normal, perquè la cèl·lula contínuament està transcrivint, i té moltes molècules com l’ATP.
En el moment de la replicació, és necessari passar NTPs a dNTPs. Hi ha una proteïna que és capaç de fer aquesta conversió: és la ribonucleotidil reductasa. Aquest enzim actua de forma dimèrica sobre tots els NTP. Per passar-los a dNTP cal gastar energia. Per això la cèl·lula controla que només es passin els necessaris per la replicació, perquè els NTP de la cèl·lula també els necessita per transcriure i fer funcionar la cèl·lula correctament.
Només es passa de NTP a dNTP quan la cèl·lula es vol dividir. Aquest pas està modulat per l’ATP.
Si hi ha una alta concentració d’ATP, aquest s’uneix a l’enzim, que augmenta la seva activitat i fa que es produeixin dNTPs.
El control de la síntesi es fa per feedback del producte, ja que és un enzim al·lostèric. Això fa que els dNTPs es produeixin equilibradament. La ribonucleotidil reductasa manté l’equilibri de % de guanina i citosina, que ha de ser el mateix, i també ho fa amb l’adenina i la timina. L’enzim es va ajustant per feedback per mantenir aquest equilibri a la replicació.
Les dCTP són les úniques que no fan feedback, el fan els altres nucleòtids. Les dTTP són especials, ja que l’enzim produeix dUTP a partir d’UTP, i després hi ha molts passos addicionals amb molts enzims per convertir el dUTP en dTTP. El que fa feedback, però, és el dTTP, per tant diem que la ribonucleotidil és un enzim controlat per punt final. La dTTP és la que inhibeix més perquè tarda més a produir-se, i és la que marca més l’equilibri.
Marcatge de DNA in vivo S’utilitzen anàlegs de timina, ja que els dTTP són productes finals i només es troben al DNA.
Només es pot fer amb la timina perquè és l’únic dNTP que no pot fer el pas enrere cap a NTP.
Tots els altres, si els marquéssim en la seva forma dNTP, podrien ser passat per enzims a NTP, i llavors l’RNA també quedaria marcat.
Per marcar el DNA, també es poden obtenir mutants incapaços de produir timina. Llavors se’ls hi ha d’inserir anàlegs de timina marcats (en el cas anterior, el bacteri produïa timines pròpies a més de les subministrades). Els anàlegs de timina no participen en el control al·lostèric.
L’enzim ThyA és específic de dTTP (i està codificat pel gen thyA). ThyA és capaç, en diferents passos, d’inhibir la incorporació de dTTP exògena. La cèl·lula normalment no incorpora dNTP de l’exterior, perquè ja li va bé produir els seus propis per regular la replicació.
Però si inhibim la producció de timina (inhibim el gen thyA, i per tant no hi ha enzim ThyA), la cèl·lula pot (i necessita) incorporar dTTP de l’exterior. Les cèl·lules sense ThyA són inviables si no hi ha dTTP a l’exterior.
Els microorganismes resistents a trimetoprim també són ThyA-. El trimetoprim impedeix el pas de l’àcid dihidrofòlic (DHF) al tetrahidrofòlic (THF). Sense THF no es poden produir dTTP, per més que la cèl·lula tingui ThyA. La cèl·lula, llavors, en tenir ThyA, es pensa que està produint timines, i la incorporació de l’exterior està inhibida, però en realitat no en té i mor.
Les cèl·lules a les que no afecta el trimetoprim són les que no tenen ThyA, perquè per molt que no es formi THF, la cèl·lula ja reconeix que no està produint timines, i llavors les incorpora de l’exterior. Per tant, el que s’ha de fer perquè els bacteris siguin resistents al trimetoprim és eliminar el gen thyA, per tal que siguin ThyA-.
INICI DE LA REPLICACIÓ EN PROCARIOTES On i quan s’inicia la replicació? I qui l’inicia? L’inici de la replicació es produeix a l’OriC. La proteïna que desencadena el començament de la replicació és la DnaA. Tots els OriC tenen uns llocs de reconeixement de la DnaA. Aquests llocs s’anomenen caixes de DnaA. Poden ser d’alta afinitat o de baixa afinitat: la seqüència de més afinitat és TTATCCACA, i com més diferències hi hagi respecte aquesta seqüència, menys afinitat tenen les caixes. Les seqüències poden estar orientades de maneres diferents, i sempre es repeteixen unes quantes vegades.
En l’OriC també hi ha regions riques en A i T. Hi ha tres seqüències de 13 pb que s’organitzen en repeticions en tàndem. Com aquestes dues bases s’uneixen per dos ponts d’hidrogen, costa menys separar les dues cadenes del DNA en aquestes regions que en altres. A prop hi ha un lloc de fixació de l’helicasa.
L’helicasa no pot unir-se a la seva zona de fixació si les dues cadenes estan juntes. Les proteïnes DnaA en unir-se a les caixes de DnaA, fan que les dues cadenes se separin per la zona rica en AT, llavors l’helicasa es pot unir i muntar el replisoma.
OriC d’E. coli.
Les seqüències GATC són les que reconeixen les metilases (Dam), que metilen les adenines d’aquestes seqüències. La freqüència de les seqüències GATC a l’OriC és molt més alta que la que es trobaria de manera aleatòria.
La proteïna DnaA és essencial per la cèl·lula perquè no només reconeix les caixes de DnaA sinó que, quan hi està unida, també facilita la unió de més proteïnes DnaA a la cadena de DNA. Així, al final ja no cal ni que hi hagi caixes de DnaA perquè les DnaA unides faran que encara s’hi uneixin més.
Totes aquestes proteïnes DnaA unides van nucleofilamentant el DNA. Hi n’hi ha tantes, que la força d’interacció entre elles és més gran que la força dels ponts d’hidrogen entre nucleòtids.
Llavors les dues cadenes es separen i es trenquen els ponts d’hidrogen. Llavors queda el complex obert. La DNA-helicasa (DnaB) pot interaccionar amb la seva regió i començar a fer la seva funció, que és continuar obrint la doble cadena a partir del punt on ho han fet les DnaA. Per això aquestes ja no són més necessàries, i salten. Es carrega el β-CLAM, les dues polimerases i la girasa, que es posa davant. Així ja està format el replisoma. La girasa va desfent el sobreenrotllament que produeix anar obrint la doble cadena perquè el DNA no es bloquegi i pugui anar avançant. La topoisomerasa es situa davant la DNA-polimerasa 3 dels dos complexos i va enrotllant les dues noves cadenes de DNA.
CONTROL DE L’INICI DE REPLICACIÓ La replicació del DNA per iniciar-se necessita que hi hagi suficients proteïnes DnaA per ocupar els llocs d’interacció, nucleofilamentar el DNA i separar les dues cadenes.
La replicació torna a començar quan es torna a acumular suficient DnaA. Això vol dir que si s’acumula suficient DnaA es pot tornar a obrir l’OriC (tan el vell com el nou) sense necessitat de que el primer hagi acabat de replicar el cromosoma. Per tant, una cèl·lula pot tenir el mateix cromosoma més d’un cop o dos.
Llavors, aquest procés com es para? Perquè si la quantitat de proteïnes DnaA és suficient, un cromosoma es podria estar replicant per 8 llocs diferents! Les DnaA no es degraden a les proteases, perquè la vida mitjana d’aquestes és més llarga que no pas una sola replicació. Les DnaA que interaccionen amb el DNA estan carregades amb ATP.
Quan es desenganxen del DNA, passen a estar unides a ADP, i així no poden interaccionar amb el DNA. Per tant un punt clau pel control és regular la concentració de DnaA-ATP i DnaA-ADP.
També es pot bloquejar el pas de les DnaA als llocs d’interacció.
Un altre mètode és controlar la quantitat de DnaA que es produeix.
El gen DnaA està molt a prop de l’OriC, per tant és dels primers en replicar-se, així, pot produir el doble de DnaA pel doble d’OriCs que hi ha. Però la DnaA associada a ATP bloqueja la síntesi de més DnaA. La DNa-ATP s’uneix al promotor del gen DnaA i fa un feedback negatiu.
Hi ha una proteïna associada al β-CLAM (Hda) que facilita el pas d’ATP a ADP, de manera que així s’està ordenant que no es torni a començar una nova replicació.
Control transcripcional per controlar la disponibilitat Dna-ATP a l’origen.
A prop de l’OriC hi ha la regió datA, que acumula cinc caixes DnaA. Al llarg del cromosoma hi ha altres regions d’alta afinitat amb proteïnes DnaA (gidA, dnaA, mioC, trp, uvrB...). Això fa que les DnaA hagin d’estar amb més concentració per començar una replicació perquè primer s’uneixen a aquests llocs d’alta afinitat. A més, hem de tenir en compte que totes aquestes caixes de DnaA van augmentant en nombre com més s’allunya la forquilla de replicació de l’OriC, de manera que cada cop hi ha més proteïnes DnaA unides a elles.
Aquestes regions d’alta afinitat no s’obren perquè a prop no hi ha cap regió rica en A-T (regions febles). Això fa que no funcionin com a orígens de replicació, sinó com a llocs de segrest de DnaA.
A prop de l’OriC, però, també hi ha unes seqüències on s’hi uneixen unes proteïnes que transformen el DnaA-ADP en DnaA-ATP. Serveixen per reutilitzar els DnaA quan estan en baixa concentració. S’ha de mantenir un equilibri amb els mecanismes que redueixen el nombre de DnaA-ATP.
Un altre mètode control és el de les seqüències GATC. Els GATC són reconeguts per la proteïna SecA. Aquesta és una proteïna membranal, que concretament reconeix els GATC hemimetilats, és a dir, que només una de les cadenes està metilada. Aquesta situació, es dóna justament després de la replicació (la cadena vella és la que porta la metilació, i la nova no). SecA és molt gran, i el que fa és amagar aquella regió de DNA a la qual s’uneix i no deixar que altres proteïnes la vegin.
Quan Dam metila els GATC, deixen d’estar hemimetilats i SecA allibera el DNA, de manera que les DnaA tornen a veure les seqüències de l’OriC i poden començar una nova replicació.
REPLICACIÓ BIDIRECCIONAL DEL CROMOSOMA – E. coli Quan entra el replisoma al cromosoma, aquest va avançant per si sol i va replicant a banda i banda d’OriC. La replicació és bidireccional perquè a l’OriC s’instal·len dues forquilles de replicació, dos replisomes. Això vol dir que entren dues helicases, dues polimerases 3 per cada replisoma... Una meitat del cromosoma serà responsabilitat d’una forquilla, i l’altra meitat de l’altra.
En altres microorganismes només hi ha una forquilla de replicació. Fins i tot, en microorganismes amb més d’un cromosoma, pot ser que cada un es repliqui de forma diferent: amb una forquilla o dues.
Observant una imatge d’un cromosoma dividint-se podem saber si hi ha una o dues forquilles, sempre que també sapiguem on és l’OriC.
Com es paren els dos replisomes que van avançant? Com ho fan per no passar-se després d’haver replicat la meitat del cromosoma, de manera que no continuïn replicant una part que ja hagi replicat l’altre replisoma? Hi ha unes proteïnes que s’anomenen TUS (Terminus Utilization Substance) que són proteïnes de terminació de replicació del cromosoma bacterià. Les seqüències ter són el lloc d’unió de les proteïnes TUS.
Cada replisoma es veu aturat per les TUS allunyades a les seqüències ter més llunyanes, situades més enllà de la meitat del cromosoma que replica (és a dir, les roses aturen el replisoma verd, i les taronges aturen el replisoma vermell).
Les seqüències ter i les proteïnes TUS tenen direccionalitat. És com si tinguessin dues cares: si el replisoma ve per una cara no s’atura, però si ve per l’altre sí. Si una forquilla de replicació arriba pel costat no permissiu de la TUS, aquesta forquilla salta. Les raons per les quals salta la forquilla encara s’estan investigant: - Model actual: es creu que les TUS interaccionen amb el β-CLAM, fent que aquest reaccioni i salti. Llavors ja no manté la polimerasa unida al DNA.
Model vell: el replisoma no pot passar ja que el DNA està ocupat per les TUS, i acaba saltant.
Si el replisoma passa la proteïna TUS per la part permissiva, fa saltar la proteïna TUS del DNA, i aquesta no es torna a unir. Així que en teoria està traient proteïnes TUS per aturar l’altre replisoma, però ara veurem que en realitat les proteïnes TUS només fan aturar un replisoma, i que l’altre acaba d’una manera diferent.
Hi ha més d’una regió ter i proteïna TUS per si a la primera el replisoma no para. Així, a la segona la forquilla ja va amb menys velocitat. Per tant, es podria dir que el que fan les TUS és anar alentint els replisomes fins que finalment una d’elles el fa saltar.
Una de les forquilles para i salta abans que l’altra, perquè no es poden trobar les dues alhora obrint les cadenes. Llavors, la que queda replicant continua i supera el punt on s’havia parat la primera. Aquest replisoma agafa les dues cadenes velles. Ara aquestes ja estan en cromosomes diferents, perquè aquesta part havia estat replicada pel replisoma que s’ha aturat primer.
Llavors, en agafar les cadenes velles, les noves de cada cromosoma es queden soles i s’uneixen entre elles per la seva complementarietat.
Això fa que es creï un creuament. Com se separen finalment els dos cromosomes? La cèl·lula veu que hi ha tres regions homòlogues, de manera que duu a terme una recombinació. La proteïna RecA és una recombinasa que detecta regions d’homologia, les enganxa i el que sobra ho talla.
Però llavors queda un “crossing”: els dos cromosomes estan units per una cadena. A aquest encreuament se l’anomena estructura de Holiday.
Com es desfà l’estructura de Holiday? A la figura de la dreta, pels enzims és molt fàcil accedir-hi. Així poden entrar i tallar les cadenes, tornant-les a ajuntar després. Els enzims que fan això són les resolvases. D’aquests n’hi ha diferents tipus. A alguns els hi és igual on es produeixi aquest encreuament, però sempre que passa en la replicació, l’encarregada és XerDC. Aquesta proteïna té dues subunitats (XerD i XerC).
Només actua sobre una regió molt concreta del DNA, molt a prop de la regió de terminació de la replicació.
XerDC funcionen com dues resolvases que actuen juntes. S’anomenen dif les regions on la XerDC actua. L’estructura de Holiday es mou fins a aquestes regions perquè puguin actuar aquestes resolvases.
Si es talla pel primer lloc, els productes són recombinats o creuats, i no interessen. Només se separen bé els dos cromosomes si es talla pel segon lloc.
Les XerDC interaccionen amb la proteïna Ftsk. Les Ftsk són proteïnes que formen part del septe (anell que separa la cèl·lula en dues parts al final de la divisió). Tot coincideix en un mateix punt. Els dos OriC es mouen als dos pols oposats, i el punt de terminació de la replicació, on hi ha les XerDC, es queda al mig, on s’està formant el septe, que té Ftsk i llavors interacciona amb elles.
Finalment la cèl·lula es divideix en dues.
Si apareixen concatèmers de cromosomes (units com si fossin anells) són resolts per les topoisomerases de tipus II (IV en el cas d’E. coli). Això es produeix perquè mentre es replica, el nucleoide continua compactat. El replisoma va descompactant el que ha de replicar i compactant el que ja ha replicat. Així, es van generant dos nucleoides separats.
DIVISIÓ CEL·LULAR El septe es produeix per l’acumulació de moltes proteïnes Fts(lletra aleatòria). Aquestes proteïnes polimeritzen i generen un septe que es va estrenyent, i al final separa la cèl·lula en dues. Les proteïnes del septe tenen molta afinitat entre elles, però llavors perquè no es forma el septe sempre? Perquè normalment aquestes proteïnes no tenen lloc dins la cèl·lula a causa del “molecular crowding”.
El septe es va muntant en una punta, però no té espai i se’n va a l’altra punta. Allà tampoc en té i torna... i així va fent successives vegades. És com si mesurés la longitud de la cèl·lula, i quan és suficientment llarga, forma el septe al mig perquè s’ha de dividir.
Una altra teoria diu que hi ha inhibidors d’aquestes proteïnes, que quan la cèl·lula és petita la seva concentració és més alta i llavors s’uneixen fàcilment a les del septe i no deixen que es formi. Quan la cèl·lula es fa gran i la concentració dels inhibidors llavors disminueix, el septe es pot formar.
PAPER DEL CITOESQUELET EN LA DIVISIÓ CEL·LULAR El nucleoide es mou pel citoesquelet. Si muten NAPs associades al nucleoide (MUKA, MUKB...), aquest es desubica, i en posteriors divisions cel·lular, es creen fantasmes de citoplasma que moren, perquè el nucleoide no s’ha ubicat bé durant la divisió. Per això sabem que hi ha NAPs associades al citoesquelet.
REPLICACIÓ DE CROMOSOMES AMB HAIRPIN TELOMERE REPLICACIÓ DE CROMOSOMES AMB INVERTRON TELOMERE La DNA-polimerasa 3 no necessita primosoma (són els únics cromosomes que no necessiten encebador). El primer nucleòtid de la cadena necessari per replicar (adenina) l’aporta la proteïna que fa de tap al telòmer. Es copien les dues cadenes de cop i no hi ha fragments d’Okazaki.
CICLE CEL·LULAR En aquest cas, les cèl·lules filles tenen sempre un cromosoma.
En aquest cas les cèl·lules filles tindran sempre un cromosoma i 1/3 de cromosoma.
Les cèl·lules filles tenen dos cromosomes i dues meitats de cromosoma: Podem veure, si fem els càlculs, que una cèl·lula mai no podrà tenir tres còpies d’un cromosoma.
Perquè d’un passa a dos, després a quatre... i així successivament.
Si en algun moment d’aquest cicle la concentració de DnaA disminueix, llavors la fase I s’allargarà, però no ho farà C, de manera que les cèl·lules filles de la primera divisió després de que passi això tindran una quantitat de cromosomes menor.
Amb més còpies de cromosoma hi ha més dosi gènica, i aquesta és més gran per uns gens que per uns altres. Això passa perquè certes proteïnes seran més necessàries en més quantitat pel medi on viuen.
Tots els gens que estan a prop de l’OriC produeixen més dosi gènica. Ja que en aquest cas una cèl·lual filla té 4 còpies d’un gen a prop de l’OriC, i dues còpies dels que estan més lluny.
Evolutivament, la posició dels gens respecte l’origen de replicació s’ha anat determinant segons quins gens es necessiti que estiguin més actiu i amb més expressió. Evolutivament, això ja comença a ser un procés de regulació gènica.
La distància dels gens respecte l’OriC no només determina la producció gènica, sinó que també les possibilitats per aquelles regions més properes de patir recombinacions i reordenacions.
...