Tema 3. Western Blott (2016)

Resumen Catalán
Universidad Universidad Rovira y Virgili (URV)
Grado Biotecnología - 3º curso
Asignatura Tecniques de bioquímica i biologia molecular
Año del apunte 2016
Páginas 5
Fecha de subida 20/04/2016
Descargas 12
Subido por

Vista previa del texto

Maria Lobato Gómez. Universitat Rovira i Virgili Tema 3: Western Blotting 1. Fonament: Tècnica que s’usa per identificar una proteïna en mostres amb un barreja complexa de proteïnes (homogenat) després d’una electroforesi. La proteïna específica és reconeguda per un anticòs específic per aquesta, el qual presenta complementarietat per reconeixement de forma, aleshores es forma un immunocomplex antigen-anticòs, on l’antigen és la proteïna d’interès i aquest complex es detectarà per immunodetecció, ja sigui per un marcatge de forma directa o indirecta, això s’explicarà més endavant.
Els avantatges d’aquesta tècnica són els següents: - La hibridació és específica, ja que només hi ha unió si hi ha complementarietat. A més, aquesta es donarà encara que hi hagi quantitats importants de molècules similars, però no idèntiques, a la diana.
Detectem una proteïna d’interès en una mostra sense purificar, cal tenir en compte que el procés de purificació és molt laboriós i en aquest cas detectem directament.
És una tècnica que s’ha convertit en semi-quantitativa, ja que dins d’un gel d’electroforesi es poden comparar diferents carrils on s’han carregat diferents mostres i dir en quines mostres hi ha menys o més proteïnes  no diem quantitats exactes, però podem comparar.
2. Objectiu: Quantificar de forma específica i individualitzada una proteïna en una barreja complexa.
3. Procediment: 1- Obtenció de l’homogenat del teixit d’interès  Centrifugació per obtenir la fracció de l’homogenat que ens interessa  Quantificació de proteïna que hi ha en la fracció (sobrenedant o pellet) que ens quedem després de la centrifugació, mitjançant un mètode colorimètric, per tal de saber quina quantitat de mostra hem de carregar en el gel d’electroforesi.
2- Electroforesi en gel per separar els components de la barreja: per a que el nostre Western pugui ser comparable, hem d’ajustar la quantitat de proteïna de cada pouet al màxim. Els gels de Western Blot són gels de poliacrilamida, l’electroforesi en aquests gels molts cops és referida com PAGE.
Aquests gels es formen per polimerització de l’acrilamida monomèrica i la formació de ponts creuats entre aquesta i la N,N’-metilenbisacrilamida, aquests ponts es formaran amb l’ajut de catalitzadors (persulfat amoni i TEMED).
La relació %T (monòmer total) / %C (bisacrilamida) determina el marge de mida de molècules que es poden separar en el gel, com més alt sigui el %T, la mida del porus serà més petita.
Hi ha dues formes d’aconseguir gels per Western-Blotting:  Gels casolans: es genera una malla de polímers, concretament amb poliacrilamida i metilenbisacrilamida, depenent de la quantitat d’aquests, el porus tindrà diferent mida. És per aquest porus per on passarà la mescla de proteïnes, la qual es separarà en funció de la mida.
 Gels comercials: ja venen preparats amb una determinada mida de porus, són més econòmics i al usar-los hi ha un important estalvi de temps.
Els gels acostumen a ser discontinus: hi ha la part inferior (gel separador), que és on es separen les proteïnes de la mostra, i conté la concentració de polímers que hem triat segons la mida de la proteïna que volem separar, i després hi ha la part superior (gel apilador), en la que hi ha menys quantitat d’acrilamida i és on es posaran les pintes d’electroforesi i per tant, on es carregaran les mostres.
Maria Lobato Gómez. Universitat Rovira i Virgili Tipus d’electroforesi segons la naturalesa de la mostra: Mostra no desnaturalitzada: no s’afegeix cap detergent, la migració de les proteïnes dependrà de la relació mida/càrrega, no s’acostuma a fer perquè la separació es basa en dos paràmetres i com menys paràmetres hi ha menys solapaments, i per tant, els resultats de la separació són més fàcils d’interpretar.
Les proteïnes estaran en la seva conformació nativa i es separaran per càrrega neta i mida/forma.
Mostra desnaturalitzada (SDS-PAGE): s’afegeix el detergent SDS en el tampó d’electroforesi, aquest anul·larà la carrega nativa de les proteïnes de la mostra. Es bloqueja la càrrega de la proteïna natural, de forma que la separació es durà a terme en funció d’un únic paràmetre: la mida. A banda del detergent, s’apliquen altres condicions desnaturalitzants: calor i un tiol de baix PM, que és un agent reductor. El resultat d’aquesta desnaturalització és que totes les proteïnes tenen càrrega negativa i es diferencien únicament en el seu pes molecular. Un carril haurà d’estar destinat al patró de PM.
Un cop carregada la mostra (desnaturalitzada o no), s’aplica al gel un camp elèctric (70 V durant 2-3 h). En el cas d’una mostra no desnaturalitzada, podem carregar-la en qualsevol dels pols (càtode o ànode), en canvi, quan la mostra està desnaturalitzada, com que totes les proteïnes de la mostra presenten càrrega negativa, es carrega en el càtode per a que les proteïnes es desplacin cap a l’ànode en funció de la seva mida/forma.
3- Electroblotting  transferència a un suport sòlid de les macromolècules separades: Quan ja hem dut a terme l’electroforesi, es transfereixen les proteïnes del gel a una membrana. Per a fer-ho, haurem de fer el següent: Aquest sandvitx es trobarà en tot moment submergit en tampó de transferència, que és similar al tampó típic dels gels SDS-PAGE (inclou un percentatge de metanol que ajuda a la transferència). Es pot aplicar corrent elèctric durant 30 minuts o tota la nit.
S’ha de vigilar la temperatura i ha d’estar en agitació.
Maria Lobato Gómez. Universitat Rovira i Virgili Quan apliquem un camp elèctric, les proteïnes que es troben en el càtode es dirigiran cap a l’ànode, transferint-se a la membrana. El resultat serà un gel més o menys buit i una fotocòpia del gel en la membrana.
Per saber si s’ha produït correctament la transferència podem tenyir el gel després d’aquesta amb plata, Coomassie Blue o Gel-dryer, si la transferència ha sigut bona, esperem no trobar gairebé res de proteïna en el gel. També es pot fer una tinció “reversible” de la membrana (Ponceau S), la tinció es reversible perquè després en la membrana hem de dur a terme la immunodetecció i a més, la membrana és molt sensible.
Diferents tipus de membranes: Tensile strength fa referència a la força d’unió.
 Nitrocel·lulosa: és el primer tipus de membrana que es va fer servir en Western-Blot i els Blottings d’àcids nucleics (Northern i Southern). Presenta una capacitat d’unió moderada però és molt làbil, la unió no és covalent, és per càrrega.
 PVDF: és un material nou, molt dur i que pot unir una gran quantitat de proteïna mitjançant unions hidrofòbiques.
 Niló: funciona per tot tipus de molècules, són bons per proteïna i són molt més eficients que PVDF i nitrocel·lulosa, també són més resistents.
4- Bloqueig i preparació de l’anticòs específic: En què consisteix el bloqueig? Quan fem una electroforesi, queden espais morts en el gel i quan fem la transferència a la membrana segueixen quedant espais buits sense proteïna. Per poder dur a terme la immunodetecció, aquests forats s’han d’omplir amb proteïnes irrellevants (bloqueig), sinó quan posem l’anticòs primari aquest s’unirà als espais lliure i tindrem soroll de fons.
Per dur a terme el bloqueig, hem de submergir la membrana en un tampó que conté molta proteïna irrellevant (ha de ser fàcil d’obtenir i no ha de tenir res a veure amb la proteïna que volem detectar), acostuma a ser llet.
L’anticòs específic primari s’obté d’un animal, s’acostuma a comprar Maria Lobato Gómez. Universitat Rovira i Virgili 5- Formació complex antigen-anticòs específic: Incubació amb l’anticòs primari o la parella d’anticossos primaris que vulguem, com? Submergint la membrana en una solució que contingui aquest/s anticòs/os i incubar una estona per a que tingui lloc el reconeixement. És aquí on el protocol es diferencia si duem a terme un marcatge directe o indirecte:  Directe: aquest anticòs primari estarà marcat i del punt 6- passarem directament al 8 Indirecte: aquest anticòs primari no està marcat L’anticòs primari procedeix d’una espècie diferent a la que estem estudiant i com més sensible sigui, menys quantitat de proteïna es recol·lectarà.
6- Rentat de l’anticòs primari sobrant amb un tampó salí 7- Incubació amb l’anticòs secundari: aquest reconeixerà l’anticòs primari i estarà marcat. Per seleccionar l’anticòs secundari hem de tenir en compte l’espècie de l’anticòs primari, el tipus d’anticòs primari (en el cas que sigui una IgG, l’anticòs secundari haurà de ser un anti-IgG), haurà d’estar purificat i pot estar marcat de diferents formes: a. Marcatge enzimàtic: i. Peroxiadasa de rave: econòmic, ràpid i més estable  colorimetria i quimioluminiscència. És estable durant anys en el congelador ii. Fosfatasa alcalina: més sensible per colorimetria. Decau en 15 dies b. Marcatge fluorescent: FITC, ficoeritrina, Quantum Red c. Amplificació de senyal amb biotina: amplificació amb avidina conjugada amb enzims o fluorocrom d. Marcatge radioactiu: detecció amb pel·lícula sensible a la radiació El marcatge indirecte és més versàtil i econòmic, ja que, si la hibridació és la unió anticòs primari-proteïna, podem usar un anticòs secundari no multi-específic de bona qualitat, el qual dins de tota la mostra complexa de proteïnes només ens reconeixerà la que volem (la que està marcada amb anticòs primari) 8- Detecció de les unions específiques: a. Marcatge enzimàtic: i. Substrats per la peroxiadasa ii. Substrats per la fosfatasa alcalina b. Detecció de fluorescència c. Sistema biotina-avidina: l’anticòs està unit a la biotina, la qual té molta afinitat per l’avidina, aquesta avidina portà acoblada un enzim, si s’afegeix el substrat d’aquests enzim podrem detectar les senyals, que poden ser diferents segons el tipus d’enzim acoblat, també pot ser que l’avidina estigui unida a un component fluorescent.
d. Marcatge radioactiu: presenta desavantatges tals com la baixa seguretat i estabilitat 9- Quantificació dels nivells d’expressió: a. Comparació relativa de cada membrana: sabem quina és la banda que ens interessa pel marcador de pes molecular, de forma que podem ignorar les bandes paràsit (les que no ens interessen) que s’obtenen quan el procediment no està 100 % optimitzat. S’escaneja la membrana mesurant el nombre de píxels que hi ha en cada banda d’interès  un analitzador d’imatges ens calcula la densitat negre de cada banda; es tracta d’unitats arbitràries però serà un nombre que ens donarà una idea de la quantitat de proteïna que hi ha en cada pouet, també es pot mesurar a ell, però interessa més tenir-ho tot quantificat.
b. Càrrega uniforme entre totes les mostres: com ja s’ha esmentat, volem que en cada pouet hi hagi la mateixa concentració de proteïna, per a fer-ho, abans de dur a terme l’electroforesi es fan càlculs per tal de saber quina és la quantitat de cada mostra que hem d’afegir per a que totes les mostres tinguin la mateixa concentració de proteïna Maria Lobato Gómez. Universitat Rovira i Virgili c. Detecció de la proteïna problema i detecció de la proteïna de referència: podem cometre errors a l’hora de calcular la quantitat de mostra que hem de posar en cada pouet o a l’hora de carregar la mostra, obtenint així falsos positius. Per tal d’evitar aquests falsos positius, el que fem és usar una proteïna de referència, la qual acostuma a ser del citoesquelet o alguna que s’expressi de forma constitutiva durant el procés que volem estudiar. Es fa un ratio de la proteïna d’interès i la de referència per tal de corregit l’error.
Una de les utilitats d’aquesta quantificació relativa és mirar quantes vegades més o menys s’ha expressat una proteïna en diferents situacions.
També es pot dur a terme una quantificació absoluta: construïm una recta patró de la membrana. El problema és que no és fàcil tenir proteïnes patró pures i es gasten molts carrils del gel amb fer la patró.
...