TEORÍA DE LAS PRÁCTICAS (2016)

Resumen Español
Universidad Universidad de Valencia (UV)
Grado Ciencias Ambientales - 2º curso
Asignatura Microbiología
Año del apunte 2016
Páginas 6
Fecha de subida 24/04/2016
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PRÁCTICAS MICROBIOLOGÍA UNIDAD I: Ubicuidad de los microorganismos en el ambiente.
El aire es un ambiente hostil para el desarrollo microbiano, pero es un medio propicio para la dispersión de microorganismos.
Las técnicas básicas en Microbiología buscan conseguir aislar individuos microbianos y conseguir que una vez aislados se mantengan como tal, es decir, que no se contaminen con los microorganismos del ambiente.
PRÁCTICA 1: Valoración de la carga microbiana del ambiente.
Nacimiento de la Microbiología como ciencia a partir de 2 descubrimientos principales: - Observación de los microorganismos  Leeuwenhoek Observación de sus colonias  Koch - Confirmación de que los microorganismos se desarrollan a partir de células parentales  Pasteur Ambiente: Cualquier ámbito o sustrato que pueda contener microorganismos (todas partes).
Para muestrear microorganismos aerotransportados empleamos la técnica de impactación natural.
Índice de biodiversidad de Margalef = (S−1) Ln N Cada colonia es un individuo microbiano  Los distintos tipos de colonias representan distintos individuos microbianos.
PRÁCTICA 2: Conceptos de esterilidad y asepsia.
 Esterilidad: Ausencia de microorganismos en un material, concretamente la ausencia tanto de células vegetativas como de células de resistencia y virus.
Calor  Agente más empleado para esterilizar materiales en microbiología.
Los aparatos que usan calor para esterilizar los materiales son: - Autoclave  Esterilización por “calor húmedo”.
En su interior se genera una atmósfera de vapor de agua con temperaturas superiores a los 100ºC.
Los materiales que se esterilizan son instrumental de vidrio, metal o plástico resistente, y la mayoría de medios de cultivo microbiológicos.
Tratamientos de 120ºC/1 atm/20 minutos o 115ºC/0,5 atm/30 minutos.
- Horno Pasteur  Esterilización por “calor seco”.
En su interior el aire es caliente y seco.
Los materiales que se esterilizan son las pipetas de vidrio que deben estar empaquetadas en envolturas resistentes al calor y el aceite de vaselina.
Tratamientos de 160ºC/2 horas o 180ºC/1,5 horas.
Las herramientas que se utilizan para transferir inóculos se esterilizan por “calor seco”, por incineración o mediante flambeado, a la llama del mechero Bunsen.
Materiales termolábiles: Materiales que no se pueden esterilizar por calor porque se estropearían (p.ej: plástico).
Procedimientos de esterilización de materiales termolábiles: - Filtración a través de membranas  Para esterilizar soluciones nutritivas de vitaminas, etc.
Se hace pasar la solución a través de un “filtro estéril”, mediante la succión de una bomba de vacío.
Los poros del filtro tienen un diámetro inferior al tamaño de las bacterias. El líquido estéril se recoge en un recipiente que también es estéril.
- Radiaciones  Para esterilizar materiales de plástico que no resisten al calor (placas Petri o pipetas Pasteur).
Se emplea el UV para esterilizar la superficie y el aire de las cabinas de seguridad biológica de flujo laminar.
Irene Lizarán / Unybook: ilizaran Página 1  Asepsia: Conjunto de procedimientos usados en el laboratorio, los cuales preservan las propiedades de las muestras a analizar, las cepas microbianas, y los materiales estériles.
Estos procedimientos evitan la “contaminación” ambiental de materiales y muestras.
Normas de trabajo: 1) Los procedimientos de transferencia de inóculos deben realizarse con la llama del mechero Bunsen encendida.
2) El asa de siembra debe esterilizarse antes y después de tomar el inóculo, nunca se deja el asa de siembra sobre la mesa sin estar esterilizada.
3) Cuando se siembra un inóculo líquido con una pipeta de vidrio, nunca se insufla aire en el interior del medio estéril.
4) Las pipetas o puntas de pipeta se depositan en recipientes adecuados para su procesamiento.
5) Todos los tubos que contienen microorganismos deben estar tapados por un tapón.
Cuando se destapen, se flamea la boca del tubo, y antes de cerrarlos se vuelve a flamear.
6) Las placas Petri siempre deben tener la tapa puesta.
7) Los cultivos microbianos deben “matarse” en el autoclave antes de desecharlo en la basura.
UNIDAD II: Microorganismos, de la célula a la colonia.
Sólo podemos conocer las propiedades de las especies microbianas estudiando las características de sus individuos.
PRÁCTICA 3: Tipos de medios de cultivo y sus usos, generalidades.
Medios de cultivo: Substratos nutritivos que sirven para alimentar a los microorganismos y así conseguir poblaciones con una alta biomasa microbiana.
Los distintos medios de cultivo se definen en función de: - Según la consistencia que poseen  La consistencia es debida al porcentaje de agar que contienen.
1) Medios sólidos = 1,5% de agar.
2) Medios semisólidos = 0,3% de agar.
3) Medios líquidos = 0% de agar.
- Según los nutrientes que contienen.
1) Medios definidos = Compuestos por substancias químicamente puras.
Calidad de nutrientes baja.
Microorganismos protótrofos.
2) Medios complejos = Contienen hidrolizados de proteínas (no substancias químicamente puras).
Calidad de nutrientes más alta.
Microorganismos auxótrofos y protótrofos.
Protótrofos  Pueden crecer en medios definidos, con una cantidad de nutrientes baja, y en medios complejos también.
Auxótrofos  Sólo crecen en medios complejos, con una cantidad alta de nutrientes.
Irene Lizarán / Unybook: ilizaran Página 2 PRÁCTICA 4: Medios de cultivo selectivos y diferenciales.
Cultivo de enriquecimiento selectivo: técnica que utiliza condiciones de cultivo que favorecen el crecimiento de los microorganismos que deseamos aislar, en detrimento de los otros microorganismos que le acompañan en el inóculo.
Los medios de cultivo que se utilizan contienen substancias que bien incremental en crecimiento del microorganismo que queremos aislar, o bien inhiben el crecimiento de los microorganismos que no queremos aislar.
Tipos de medios de cultivo: - Según las propiedades selectivas que presentan: Las propiedades selectivas son debidas a la incorporación de substancias que inhiben el crecimiento de algunos microorganismos y por tanto favorecen a aquellos cuyo crecimiento no se afecta por tales substancias.
Las substancias que dotan al medio de cultivo de propiedades selectivas son  Colorantes, NaCl, pH, sales biliares, antibióticos…etc.
1) Medios generales  No contienen agentes selectivos.
2) Medios selectivos  Sí que contienen agentes selectivos.
- Según las propiedades diferenciales que presentan: Estas propiedades son debidas a la incorporación de substancias que ponen de manifiesto propiedades bioquímicas/fisiológicas de los microorganismos que crecen en el medio.
Las substancias que dotan al medio de propiedades diferenciales son  Combinación de un azúcar y un indicador de pH / Combinación de un compuesto de azufre y de sales de hierro / Adición de una macromolécula biodegradable…etc.
Muchas veces los medios de 1) Medios no diferenciales  No contienen agentes diferenciales.
cultivo son al mismo tiempo 2) Medios diferenciales  Contienen agentes diferenciales.
selectivos y diferenciales.
PRÁCTICA 5: Técnicas de siembra en placa y obtención de cultivos puros.
El resultado del crecimiento microbiano a partir de una muestra ambiental es un conjunto heterogéneo de microorganismos.
Esta heterogeneidad se puede observar a simple vista en un medio sólido, pues sobre el agar distinguimos distintos tipos de colonias, y cada colonia es el resultado del crecimiento de un único microorganismo.
En un medio líquido por el contrario, el crecimiento de los microorganismos sólo produce turbidez y no se puede distinguir los diferentes tipos de microorganismos.
Cuando hay una elevada densidad de microorganismos en medio sólido se forma un “césped microbiano”, son millones de pequeñas colonias creciendo tan cerca unas de otras que no se distingue su individualidad.
Para conseguir aislar colonias microbianas en medio sólido, se utiliza como herramienta de siembra el asa de filamento redondo, y la muestra se inocula sobre la superficie del medio según la técnica de siembra por triple estría.
Cada una de las colonias aisladas es un individuo microbiano, pues la colonia es consecuencia del desarrollo de una célula que se ha dividido en millones de microorganismos idénticos por bipartición.
Se realizan sub-cultivos a partir de la colonia aislada, llamados “cultivos puros” o “cepas microbianas”.
Irene Lizarán / Unybook: ilizaran Página 3 PRÁCTICA 6: Tinción de Gram y prueba KOH.
Tinciones diferenciales: Permiten distinguir entre tipos celulares diferentes, o entre distintas estructuras celulares, según su respuesta al proceso de tinción y/o de coloración que se aplica.
La tinción de Gram es una “tinción diferencial”: - Bacterias Gram-positivas  Color morado oscuro.
- Bacterias Gram-negativas  Color rosa pálido.
La causa de esta coloración final y la respuesta a la lisis reside en el tipo de pared celular que presentan.
Prueba de KOH: - Bacterias Gram-positivas (KOH+)  Se lisan.
- Bacterias Gram-positivas (KOH-)  No se lisan.
UNIDAD III: Recuento de unidades formadoras de colonia.
En este proceso hay que tener en cuenta la importancia del medio de cultivo y temperatura de incubación, pues sólo podremos contar los individuos microbianos de una muestra cuando éstos sean capaces de crecer bajo las condiciones que hemos impuesto en el laboratorio.
PRÁCTICA 7: Recuento de heterótrofos en placa.
El control de la calidad sanitaria de aguas está basado en el recuento de microorganismos.
Hay varios métodos de recuento: 1. Recuentos indirectos: Aquellos que evalúan la biomasa/cantidad de microorganismos cuantificando la concentración o abundancia de un componente celular determinado, o una molécula, o la turbidez generada por las células en una suspensión acuosa.
Estos métodos tienen limitaciones importantes.
2. Recuentos directos: Se cuantifican los individuos microbianos que están “viables”, es decir, que están vivos y son capaces de desarrollar una colonia bajo las condiciones de cultivo que hemos impuesto.
No vamos a contabilizar aquellos microorganismos de la muestra incapaces de crecer por estos dos motivos: a) Están muertos  No son viables.
b) Las condiciones de cultivo impuestas no son adecuadas  Son viables pero no crecen.
Proceso de “disoluciones decimales seriadas”: Esta técnica consiste en la necesidad de fraccionar la muestra donde se encuentran los microorganismos, para así conseguir crecimiento en el medio sólido en forma de colonias aisladas.
Para que el recuento sea válido, las placas deben contener entre 20 y 200 colonias.
Para cada dilución se siembran 3 placas de agar TSA, cada una de ellas con un inóculo de 0,1Ml.
El número de “unidades formadoras de colonia” (UFC) contabilizadas debe acompañarse de la descripción de las condiciones de cultivo: - Nombre del medio de cultivo empleado.
- Temperatura.
- Tiempo de incubación.
- Presión parcial de oxígeno.
Irene Lizarán / Unybook: ilizaran Página 4 PRÁCTICA 8: Recuento de coliformes por filtración.
Cuando los microorganismos viables son muy escasos en la muestra, debemos concentrarlos antes de llevar a cabo el recuento en placa.
Una forma de hacerlo es filtrar la muestra por una membrana que retenga todas las células microbianas y después situar esa membrana sobre la superficie del medio de cultivo para el recuento.
Los nutrientes penetran en la membrana y permiten el crecimiento de colonias sobre la membrana.
Se suelen utilizar medios selectivos y diferenciales.
Todos los métodos de análisis de la calidad sanitaria de las aguas están basados en el recuento de viables por filtración.
Los coliformes fecales son bacterias que se utilizan como “microorganismos indicadores de contaminación fecal”  Escherichia coli, Enterococcus faecalis y Clostridum perfringens.
Bacterias Gram- que producen ácido a partir de lactosa.
UNIDAD IV: Actividades microbianas.
La actividad de las poblaciones microbianas en el medio ambiente produce el reciclado de los nutrientes.
Los microorganismos heterótrofos son los que mineralizan la materia orgánica.
La mineralización consiste en la ruptura de los enlaces C-C presentes en los compuestos orgánicos.
Estos compuestos orgánicos son, en realidad, formas químicas reducidas del carbono. Al mismo tiempo que se fracturan dichas moléculas, los átomos de carbono se van a oxidar  Se requiere un agente oxidante.
Según la naturaleza de dicho agente oxidante hablaremos de  Respiración aerobia, Respiración anaerobia o Fermentación.
PRÁCTICA 9: Respiración aerobia, demanda bioquímica de oxígeno.
Ambientes óxicos  Ambientes con oxígeno, en los que son los microorganismos heterótrofos y aerobios los encargados de mineralizar la materia orgánica produciendo CO2 y agua.
La cuantificación del oxígeno disuelto en agua se puede realizar mediante el empleo de oxímetros o mediante métodos químicos.
Los microorganismos heterótrofos aerobios consumen oxígeno cuando mineralizan la materia orgánica, y por tanto este consumo será tanto mayor cuanta más materia orgánica haya en la muestra.
DBO5: Es la cantidad de oxígeno disuelto consumido por los microorganismos en una muestra de agua, cuando éstos descomponen la materia orgánica durante 5 días.
Aspectos metodológicos: - El agua debe saturarse de oxígeno.
- Es necesaria una población microbiana que asegure la mineralización de la materia orgánica.
- Durante el periodo de incubación (5 días) se debe mantener en oscuridad y a una temperatura de 20ºC.
Método químico de Winkler modificado: 1) Reactivos 1+2  Se forma hidróxido de manganeso que sedimenta en forma de precipitado marrón.
2) Reactivo 3  Disolución del precipitado marrón y formación de yodo molecular.
3) Reactivo 4  Reacciona con el yodo molecular tiñendo la solución de color azul oscuro.
4) Reactivo 5  Genera anión yodo, desaparece el azul de la disolución.
El yodo molecular producido es equivalente al oxígeno que había en la muestra, y puede ser valorado con tiosulfato sódico = La cantidad de tiosulfato empleada en esta titulación está directamente relacionada con la cantidad de oxígeno disuelto que había en la muestra.
Irene Lizarán / Unybook: ilizaran Página 5 PRÁCTICA 10: Respiración anaerobia, desnitrificación.
Ambientes anóxicos  Ambientes sin oxígeno, en los que los microorganismos heterótrofos realizan respiraciones anaerobias y mineralizan la materia orgánica produciendo CO2 y agua.
Entre éstos microorganismos están las bacterias desnitrificantes, las cuales respiran nitrato produciendo nitrito, o respiran nitrito y generan nitrógeno molecular.
La cuantificación de nitrato y nitrito en una matriz acuosa se puede realizar mediante electrodos o mediante métodos químicos.
Método químico de Griess: 1) Reactivo NIT1  Reacciona con los nitritos, formando sal de diazonio.
2) Reactivo NIT2  Reacciona con la sal de diazonio, formando un compuesto de color rojo.
Cando se obtiene como resultado la ausencia de color rojo en el medio, indica la ausencia de nitritos.
Esta ausencia puede ser causada por dos fenómenos distintos: a) Los nitratos del medio están intactos, los microorganismos no los han utilizado y por eso no se ha generado nitritos.
b) Los nitratos del medio han sido totalmente transformados a N2 en el proceso de desnitrificación.
Para conocer la causa de esta ausencia de nitrato, vamos a adicionar polvo de zinc a la muestra.
Este reactivo sólo puede reaccionar con el nitrato si se encuentra en la muestra.
Si una muestra da negativa para nitritos, y se produce una reacción positiva (rojo) al añadir zinc, significa que los nitratos de la matriz están intactos  a).
Si una muestra da negativa para nitritos, y la adición de zinc continua produciendo una reacción negativa (rojo no), indica desnitrificación = los nitratos de la matriz han sido transformados en nitrógeno molecular  b).
PRÁCTICA 11: Fermentación.
Ambientes anóxicos  Ambientes sin oxígeno, en los que hay microorganismos heterótrofos que mineralizan “parcialmente” la materia orgánica produciendo ácidos orgánicos y gas (CO2 o H2).
Estos microorganismos son las bacterias fermentadoras, y el proceso que realizan es la fermentación.
Para determinar la existencia de fermentación, hay que valorar la “acidificación” del medio, con el uso de un pHmetro o indicadores de pH, así como la producción de gases.
El pH del medio se valor añadiendo unas gotas del indicador rojo de metilo.
Si el color es rojo intenso, significa que el pH es menor que 4,4, por lo que sí ha habido fermentación.
Si vemos que en la campana de Durham hay gas, también significa que ha habido fermentación.
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