Seminaris de Bioquímica (2016)

Apunte Catalán
Universidad Universidad de Barcelona (UB)
Grado Farmacia - 1º curso
Asignatura Bioquímica
Año del apunte 2016
Páginas 7
Fecha de subida 30/04/2016
Descargas 24
Subido por

Descripción

Temari de tots els seminaris de bioquímica de primer de farmàcia

Vista previa del texto

Rafiki Botànica Farmacèutica 2015/16 TURMIX (blender): utensili que s’utilitza per homogeneïtzar un teixit. Trenca les membranes de les cèl·lules de manera mecànica. No s’homogeneïtza en sec sinó que es posa un tampó d’homogeneïtzació, normalment de pH 7.4 (pH fisiològic), o buffer.
Si tenim un gram de teixit, posam de dues a quatre vegades més de buffer que de teixit.
El politró aspira el teixit amb el líquid i el tritura per després amollar-lo ja homogeneïtzat.
Totes les homogeneïtzacions necessiten buffer. Un altre utensili és el Potter que es pot emprar de manera manual fins a rompre el teixit, o bé, posam l’èmbol del Potter a una berbiquí per fer-ho de manera mecànica. S’ha de baixar l’èmbol poc a poc.
Tots els aparells han d’estar freds perquè les broques, que fan la feina mecànica s’encalenteixen quan giren. Normalment es posa en refrigeració, al voltant de 4 graus, amb gel i aigua (el gel tot sol no refreda). Si la temperatura es massa elevada, hi ha molta calor i les proteïnes no ho poden resistir, de manera que precipitarien i quedarien desnaturalitzades.
El mètode de sonicació (no és físic) s’assembla al politró però enlloc de xuclar el líquid i triturar-lo, gira molt ràpidament a una freqüència tan elevada, que genera gran quantitat de calor. L’alta vibració del so produïda per la rotació de l’aparell trenca les cèl·lules. Es fa en un recipient tancat perquè pot arribar a sonicar les cèl·lules del cervell.
Els detergents més utilitzats per a trencar les cèl·lules són: Triton-X100, NP-40, CHAPS o SDS. Aquests, en concentracions baixes trenquen les membranes amb molta facilitat.
Amb molt poc volum de ... es poden fer moltes reaccions. L’elecció del buffer dependrà del pH que volem tamponar (equació de Henderson-Hasselbach: pH= pka + log (A-/HA)), perquè un buffer sigui bo el seu pka ha de ser pròxim al pH a tamponar de manera que el quocient del logaritme ha de ser 1, si és possible. Un buffer molt versàtil és el tampó format a base de sistemes d’hidrogenfosfat ja que poden tamponar a pH fisiològic si es troben conjugats amb dihidrogen fosfat (molt emprat), o a pH bàsic, conjugat amb fosfat; a pH àcid, conjugat amb fosfòric. El més utilitzat és el trishidroximetilaminometà (tris) que 1 Rafiki Botànica Farmacèutica 2015/16 té un pka pròxim a 8. Hi ha una llista de “Good buffers” que indiquen quina és la relació entre la forma acídica i la forma alcalina depenent del pH i del pka de cada tampó. Si volem fer servir un tampó que té un valor de pka allunyat del pH, el quocient del logaritme estarà molt desequilibrat i tendrà poca força tamponant.
Quant més concentrat està el buffer, independentment del pH, més força tamponadora té. Normalment una concentració òptima és la de 40 milimolar, en canvi, 1000 milimolar seria excessiu. Saber les concentracions és necessària perquè si t’excedeixes, per exemple, posant massa sodi o potassi en el sèrum d’un pacient el pots matar (<1000 milimolar).
Els tampons s’han de conservar adequadament i s’han de renovar. Si guardes durant molt de temps un buffer, poden aparèixer “submarins” (precipitats) i, llavors, ja no seria útil ni eficaç.
A quatre graus centígrads els enzims poden funcionar, però la seva velocitat de reacció serà molt lenta. Però a pics, és millor treballar així perquè et pot interessar controlar el temps de reacció, per exemple en reaccions catalitzades per nucleases. Si treballes a temperatura ambient l’enzim ho degradarà tot, en canvi, a quatre graus podràs aturar la reacció en el punt que t’interessi.
Per separar els components dels teixits que volem tenir per després analitzar, utilitzarem diferents sistemes de centrifugació.
CENTRIFUGACIÓ Un cop hem homogeneïtzat la mostra l’hem de separar. Per fer-ho farem successives centrifugacions per obtenir les diferents parts aïllades.
Per separar els nuclis i els mitocondris, els orgànuls més pesats, utilitzem una primera entre 500-800·G (una G és un cop la força de la gravetat) per tal d’homogeneïtzar.
Posteriorment es faria una altra centrifugació a 10.000G durant 20 minuts per centrifugar els nuclis i tot seguit una hora a 100.000 G per centrifugar els mitocondris.
2 Rafiki Botànica Farmacèutica 2015/16 Hi ha diferents tipus de centrífuga, la ultracentrífuga és la de velocitat més alta. També n’hi ha de pols, de sobretaula, de microtubs...
Les centrífugues giren a tanta velocitat que s’escalfen i ´s necessari tenir un bon sistema de refrigeració. També s’ha de tenir el rotor, el que gira, a una temperatura adequada (4ºC +/-).
Hi ha unes tabulacions que relacionen les rpm amb les G per saber quin tipus de centrífuga has d’utilitzar en cada cas. Les G depenen de les rpm però sobretot del radi del braç. Com més radi tengui el rotor, major serà la força G. Si el radi és el doble, la velocitat augmenta, aproximadament, el doble. També pots variar el nombre de G canviant les revolucions a que gira el rotor. En cas de que no hi hagi la taula pots saber la velocitat a que girarà el rotor segons la fórmula a=v2angular·r. Vangular=(2π/60)·rpm. El valor de d’acceleració obtingut s’ha de dividir entre 9.8 per obtenir el resultat en Gs.
La majoria de les proteïnes globulars són solubles en una dissolució 1M de sulfat d’amoni (25% saturat normalment, sinó, has de saturar més la dissolució). Has de saturar la dissolució perquè el sulfat d’amoni “capti” l’aigua i deixi les proteïnes sense. Així les proteïnes precipitaran i llavors les podràs separar amb la centrífuga.
DIÀLISI La primera cosa que s’ha de fer es treure l’excés de sal que hem afegit per tal de separar les proteïnes. Habitualment es fa amb una diàlisi. Consisteix en ficar la proteïna i l’excés de sal en una bossa de diàlisi (membrana semipermeable) en un vas de precipitat, que contengui un buffer (PBS), de molt volum. D’aquesta manera, per osmosi la sal sortirà de la bossa de diàlisi fins a arribar a un equilibri. Cada cop la bossa estarà més diluïda perquè conté menys sal. S’ha de repetir el procediment canviant l’aigua del vas de precipitats fins haver purificat la proteïna sencera.
Normalment, en el vas es posen 100 pics més volum que el que conté la bossa de diàlisi.
El cut-off de la bossa de diàlisi marca quin pes molecular sortirà per osmosi i quin no. El 3 Rafiki Botànica Farmacèutica 2015/16 que sigui d’alt pes molecular quedarà dins la bossa i el que sigui de poc, sortirà. El conjunt de bossa i vas de precipitat s’han d’estar agitant tot el temps, fins i tot durant la nit. Per això s’ha d’anar en compte perquè no s’espenyi el sac de diàlisi. Generalment, amb tres canvis d’aigua ja n’hi sol haver prou.
CROMATOGRAFIA La cromatografia més usual és la de penetrabilitat o de gel filtració. Consisteix en un tub de Sephadex que conté una sèrie d’esferes de dextrà. També es pot utilitzar Sepharosa (agarosa) o Sephacel (cel·lulosa). Aquestes esferes contenen uns porus que deixen entrar molècules d’un determinat pes molecular, el que s’anomena volum d’exclusió. Si el volum d’exclusió es de 25kD vol dir que les de 25kD ja no podran penetrar en les esferes. Llavors, es poden separar proteïnes perquè les que no entren a les esferes arriben al final del tub molt ràpidament mentre que les que passen per dins de la bolla, tarden més perquè el seu recorregut és més llarg. La elució és inversament proporcional al pes molecular: les que pesen poc tarden més a sortir ja que penetraran en les esferes.
El que es pot fer és separar les proteïnes d’un colorant, normalment dicromat de potassi (groc). En el mateix tub tenim la proteïna tenyida de color blau i el dicromat. Amb el temps veiem que la proteïna ha baixat abans si pesava més que el dicromat. (pràctiques).
Hi ha un mètode que s’anomena recol·lecció de tubs que recolleix, de manera automàtica, un mil·lilitre de solució. Quan ha recollit un mil·lilitre, la màquina, gira i col·loca un altre recipient abaix del tub de filtració i així successivament.
Un altre tipus de cromatografia és la d’intercanvi iònic. Aquesta cromatografia concentra, en funció de la càrrega, els ions separats, en la cromatografia de penetració. L’intercanvi iònic pot ser positiu o negatiu. El més comú és el de les columnes de dietil aminoetil (DEAE), també poden ser de fosfocel·lulosa.
La càrrega d’una proteïna depèn de la composició aminoacídica. L’extrem inicial d’una proteïna (NH2) tindrà una càrrega positiva i , l’extrem final (COOH) tindrà càrrega negativa.
Per tant, la càrrega neta d’una proteïna depèn de les cadenes laterals dels aa que la 4 Rafiki Botànica Farmacèutica 2015/16 formen. El glutàmic i l’aspàrtic donaran càrrega negativa i, els més positius, arginina i lisina. El punt isoelèctric és el punt de pH en el qual la càrrega neta és zero. Si l’aa té pka1, pka2 i pka3, el PI és la semisuma de les dues espècies que estan a prop de l’espècie elèctricament neutre.
En aquesta cromatografia, els ions de càrrega positiva quedaran “enganxats” a la fosfocel·lulosa, que és negativa mentre que els ions negatius de la proteïna baixaran fins a baix. Al contrari passaria si utilitzéssim DEAE. Aquesta passa s’anomena “pas-through”.
Després es fa nét el tub amb buffer i s’hi afegeix una solució, en concentració creixent, de NaCl. A mida que anem afegint NaCl competirà per els ions que havien quedat en el tub.
El sodi competirà pels ions atrapats negatius i el clorur pels positius. Segons la concentració de clorur sòdic, les proteïnes es desenganxaran les boles. Unes ho faran a una concentració de 10mmolar i altres de 50mmolar, de manera que podrem separar les proteïnes en funció de la seva càrrega.
***com fer el gradient de de NaCl.
Un altre tipus de cromatografia són les columnes d’afinitat. Aquestes concentren la proteïna que vols purificar. Es tracta de fer que una esfera, que estarà en el tub, tingui més o menys afinitat pel substrat, la proteïna que volem purificar. Si la proteïna té afinitat per la glucosa, les esferes estaran unides a glucosa per tal de captar la proteïna.
Tot seguit afegirem molt de buffer per eliminar del tub les proteïnes que no ens interessen. Després, per alliberar la proteïna, farem passar pel tub molta concentració de glucosa arrossegarà la proteïna que es troba enganxada a les esfera. Aquest mètode també es pot fer amb antígens enlloc de glucosa o canviant el pH. És un mètode que permet una purificació molt acurada.
ELECTROFORESI En un procés de purificació de proteïnes, una de les tècniques principals és la electroforesi. La separació electroforètica té en compte les càrregues de les substàncies a separar, sobretot es separen proteïnes, nucleòtids...
5 Rafiki Botànica Farmacèutica 2015/16 A la barreja de proteïnes se li aplica un camp de elèctric amb un pol negatiu i un de positiu.
S’han de controlar dos aspectes: el voltatge, que és la diferència de potencial, i, l’amperatge (intensitat), que ve donat en ampers per carril.
Els gels que s’utilitzen poden ser de diferents tipus en funció de la massa molecular de les proteïnes que es volen separa: d’agarosa (per separar DNA), i, de poliacrilamida. Aquests gels no es dissolen en aigua sinó que ho fan en un tampó, normalment TAE (tris-acetatEDTA) i TBE (tris-borat-EDTA).
Quan el gel està fet, si és horitzontal, té forma de pinta i és en les cavitats la pinta on s’hi aboca la barreja de mescla.
S’ha de desgasificar els buffers, es a dir, llevar l’oxigen que hi ha. Llavors, es absència d’oxigen es forma una malla que depenent de la concentració d’acrilamida tindrà un diàmetre determinat. El mínim en el que es pot fer un gel separador és un 5%.
Les proteïnes es posen en un buffer lleugerament alcalí (pH 8) perquè estiguin una mica carregades negativament perquè corrin cap al pou positiu (ànode); pol negatiu (càtode).
La corrent que subministra el càtode és contínua. El gel separador, que és un gel porós, depenent de la seva porositat deixarà passar amb més o menys resistència les proteïnes.
Si tenen molta càrrega negativa faran més via a baixar, al igual que si tenen poca massa molecular.
Els gels natius són els que aprofiten la càrrega intrínseca que les proteïnes tenen en el buffer utilitzat; els gels desnaturant són els que utilitzen SDS (detergent) per carregar negativament les proteïnes. Per a cada dos aa s’uneix una molècula d’SDS. Si tenim un pèptid de vuit aa unirà 4 molècules d’SDS i tindrà una càrrega de -4 (la càrrega de la proteïna queda anul·lada quan afegim SDS, només tenim en compte el nombre de molècules d’SDS enganxades).
El pes molecular mitja d’un aa és 110Da i un nucleòtid 330Da. Si tenim una proteïna de 6 Rafiki Botànica Farmacèutica 2015/16 110kDa tindrà 1000 aminoàcids.
Després de l’electroforesi s’ha de tenyir el gel per poder veure les proteïnes ja que sinó ho veuríem transparent. Llavors, hem de comparar on es troben les nostres proteïnes enfront de les bandes partó de pes molecular conegut.
Mobilitat relativa: el que arriba més avall és 1, quan més amunt 0.7, 0.5, ... La nostra proteïna sempre tindrà una mobilitat relativa menor que 1. La mobilitat és inversament proporcional al pes molecular de les proteïnes.
SEPARACIÓ PER PH, gel d’amfòlits per crear un gradient de pH.
Quan es fan dues separacions, primer es fa la que separa millor. Després d’aquesta manera separació es gira el gel 90º i es fa la segona separació. La separació es bidimensional perquè en una d’unidimensional no seria possible tenir totes les proteïnes separades.
Normalment la primera separació es la isoelectrònica i després es fa l’electroforesi amb SDS.
WESTERN-BLOTT Quan hem fet una electroforesi amb SDS, hem de fer una transferència de les proteïnes a una làmina de polímer. Després, farem reaccionar la tira de proteïnes amb un anticòs determinat per així poder reconèixer i determinar la proteïna que reacciona amb l’anticòs.
Com que els anticossos reaccionen amb proteïnes específiques, podrem identificar una única proteïna. Només veurem una banda a la tira i la intensitat d’aquesta banda depèn de la quantitat de proteïna que hi havia. Identificar i determinar proteïnes.
7 ...