Tema 7 (2013)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Bioquímica - 2º curso
Asignatura Bioquímica II
Año del apunte 2013
Páginas 31
Fecha de subida 17/10/2014
Descargas 32
Subido por

Vista previa del texto

Judith Gonzàlez Gallego Bioquímica T7 TRANSPORT ELECTRÒNIC I FOSFORILACIÓ OXIDATIVA En el metabolisme vist fins el moment hem pogut observar que hi ha una sèrie de reaccions, entre les quals trobem descarboxilacions, on obtenim molècules amb enllaços que són rics en energia però el rendiment en forma d’ATPs és molt baix.
Això és degut que la major part de l’energia que s’allibera amb aquestes reaccions queda retinguda en forma de coenzims reduïts.
En l’etapa següent, que es coneix com nivell 3 del metabolisme, es produeix la utilització del reductor, que ha estat emmagatzemat en forma de coenzims reduïts, de cara a la obtenció d’energia mitjançant la reoxidació d’aquests coenzims. Els coenzims donen electrons a la cadena de transport electrònic i acaben transferint-se a l’oxigen per formar aigua, en aquest procés es forma un + moviment de protons que crea un gradient de H i permet la síntesi d’ATP.
COMPARTIMENTACIÓ Tant la cadena de transport electrònic com la fosforilació oxidativa són dos processos que es donen de forma compartimentada, es produeixen a la membrana interna mitocondrial.
Recordem que els mitocondris són uns orgànuls que tenen una doble membrana: per una banda tenim la membrana externa que és permeable a moltes molècules petites i alguns ions. Per una banda, la membrana interna és molt impermeable de manera que actua com a barrera molt selectiva amb les molècules petites, els ions i fins i tot amb els protons. Entre aquestes dues membranes trobem l’espai intermembranós.
La membrana interna mitocondrial conté associada diversos complexos i proteïnes, entre els quals trobem:  Complexos que duen a terme el transport electrònic.
 Translocasa que permet l’intercanvi d’ATP que surt del mitocondri i ADP que entra.
 ATP sintasa que permetrà la síntesi d’ATP a partir d’un gradient de protons.
 Gran quantitat de transportadors que permeten l’intercanvi de molècules del citosol amb l’interior del mitocondri.
1 Judith Gonzàlez Gallego Bioquímica T7 Per una altra banda, a la matriu mitocondrial trobem:  El complex de la piruvat deshidrogenasa (PDH).
 Els enzims que intervenen en el cicle del citrat, tot i que es considera que es troben aïllats.
 El mitocondri es tracta d’un orgànul preparat per l’obtenció d’energia, de manera que hi haurà els enzims necessaris per la degradació d’algunes biomolècules com els àcids grassos. Això és degut que els productes que s’obtenen poden entrar a formar part del cicle de Krebs i que juntament amb els coenzims reduïts puguem obtenir ATP.
Recordem que en el mitocondri també hi ha DNA i ribosomes, tot i això la gran majoria de les proteïnes mitocondrials que expressen venen codificades pel DNA nuclear, de manera que són sintetitzades pels ribosomes del citosol i després són transportades al mitocondri. Hi ha algunes que se sintetitzen en el propi mitocondri, venen codificades per DNA mitocondrial i s’expressa i sintetitzen en el mitocondri.
A part d’això trobem altres enzims implicats en el metabolisme, també metabòlits com ara el ATP i ADP, cations divalents (magnesi i calci), cations monovalents (potassi), etc. Recordem que en el cas del mitocondri, és un orgànul on les concentracions d’ATP i ADP sí que poden variar de manera significativa en funció de l’activitat metabòlica que hi hagi.
TRANSPORTADORS ELECTRÒNICS DE LA CADENA RESPIRATÒRIA Se sap que el poder reductor pot venir de la degradació de glucosa a piruvat però també del cicle de Krebs, de la degradació d’àcids grassos, etc. De manera que cal tenir present que el poder reductor no prové només del cicle del citrat sinó que també pot provenir d’altres vies de degradació que es produeixin dins el mitocondri.
Ubiquinona La estructura de la cadena de transport electrònic mitocondrial es va veure que estava composada per diferents biomolècules de les quals hi havia unes que eren relativament senzilles i que eren liposolubles, per tant es trobaven inserides i es podien moure lliurement per dintre la bicapa lipídica que constitueix la membrana interna mitocondrial. La que té un paper molt important en la cadena de transport electrònic és la denominada com ubiquinona o coenzim Q.
La ubiquinona té l’estructura típica d’una quinona i després té una estructura d’isoprè repetida 10 vegades. La cua d’isoprenoide llarga és el que permet que pugui estar dins la bicapa i es pugui moure.
La ubiquinona (Q) es pot trobar en la forma totalment oxidada o reduïda, de manera que a mesura que va captant protons i electrons es va reduint. Se sap que la ubiquinona es redueix en dues etapes:  Primera etapa. La ubiquinona capta un protó i un electró formant un estat + intermediari anomenat semiquinona ( QH).
 Segona etapa. Es capta un segon protó i electró de manera que es forma l’ubiquinol (Q2) 2 Judith Gonzàlez Gallego Bioquímica T7 La ubiquinona és un dels receptors que és capaç de transportar dos electrons i dos protons. Se sap que hi ha alguns que únicament són capaços de transportar electrons i inclús un únic electró.
S’ha vist que la ubiquinona està prsent en tots els organismes vius i aquest és el motiu pel qual rep el nom que té (ubiqüitat).
CITOCROMS Trobem altres biomolècules característiques de la cadena de transport electrònic que ja són més complexes que les anteriors. Es tracten d’unes proteïnes que tenen unides com a grups estructurals, grups hemo, de manera que contenen ferro.
El grup hemo és una estructura de protoporfirina del tipus IX. Que sigui d’un tipus o d’un altre depenen de quins siguin els substituents de l’anell tetrapirròlic. El grup hemo està format pels quatre anells pirròlics connectats entre ells mitjançant enllaços de coordinació amb el nitrogen i en el centre se situa un ferro. El que diferencia les protoporfirines són les cadenes laterals i la del tipus IX és la que constitueix alguns tipus de citocroms.
La protoporfirina IX forma el grup hemo que juntament amb una proteïna és el que constitueix un determinat tipus de citocrom.
Dintre dels citocroms hi trobem de diferents tipus en funció del tipus de ferro hemínic que continguin. A la imatge inferior esquerra veiem el tipus que composa els citocroms de tipus b, de manera que tots aquests citocroms b contenen aquesta estructura.
Hi ha un altre tipus de citocroms que s’assemblen al B però es produeix una unió covalent entre la porfirina del grup hemo i la proteïna. En el cas anterior, l’enllaç no es dóna per un covalent sinó per enllaços de coordinació amb el ferro (com amb l’hemoglobina). Se sap que en els citocroms de tipus C hi ha hagut una condensació entre els vinils i les cisteïnes (marcat amb una fletxa) i en conseqüència no trobem l’enllaç doble que abans hi havia.
Per tant, segons la cadena polipeptídica pot haver-hi aquesta unió covalent o no. Veiem que els substituents al citocrom b i c són els mateixos l’únic que canvia és que hi ha dues condensacions de vinils amb cisteïnes, i aquest fet és el que determinarà que sigui d’un tipus o d’un altre.
Per una altra banda trobem els citocroms de tipus A que contenen el grup hemo A. En aquest cas la seqüència de substituents és similar però té algunes modificacions. On abans hi havia un metil ara trobem un grup aldehid i on abans hi havia un vinil ara trobem una cadena hidrocarbonatada llarga. Aquesta cadena està formada per tres isoprenoides units i és el que caracteritza els citocroms de tipus A. En aquest cas. La unió amb la proteïna tampoc és covalent sinó que és per coordinació.
3 Judith Gonzàlez Gallego Bioquímica T7 Els citocroms de tipus B tenen el mateix grup hemo que hi ha a la hemoglobina o a la mioglobina però a la seva funcionalitat hi ha una diferència molt gran: el grup hemo en la mioglobina i la hemoglobina uneix l’oxigen i durant el transport d’evacuació no hi ha canvi en l’estat d’oxidoreducció del ferro; en el cas dels grups hemo que hi ha en els citocroms, el ferro sí que varia de valència (ferrós a fèrric) depenent de l’etapa de transport en la que es trobin els electrons.
Hi ha una gran varietat de citocroms i s’ha vist que tenen la peculiaritat, degut a la presència de dobles enllaços conjugats, de poder absorbir llum. En conseqüència tenen espectres d’absorció diferents i aquest fet ens permet fer una classificació dels diferents citocroms.
Pel que fa al seu funcionament en la cadena de transport d’electrons se sap que tenen una funció molt complexa i que únicament tenen la capacitat de transportar els electrons d’un en un.
PROTEÏNES AMB COMPLEXOS FERRO – SOFRE Les estructures de proteïna i ferro a partir de les quals hi ha transport electrònic no només està present en els citocroms.
Trobem també un altre tipus de biomolècules que ho contenen, les proteïnes ferro – sofre.
En el cas de les proteïnes ferro – sofre el ferro no és hemínic, és a dir, no hi ha grup hemo. En aquest cas el ferro és unit per les cadenes laterals de la proteïna, aquest fet ho podem observar a la imatge: quatre cisteïnes uneixen per coordinació, a partir del sofre, ferro. Les unions que es produeixen no es considera que siguin unions covalents fortes.
Aquestes estructures poden ser més o menys senzilles en funció de la quantitat de sofres que hi hagi. En el cas de les proteïnes ferro sulfurades es transporta també un únic electró.
Hi ha un altre tipus de proteïnes que també són ferro sulfurades però en aquest cas la coordinació es produeix amb dues histidines i dues cisteïnes. Aquestes proteïnes es coneixen amb el nom de complexes ferro – sofre de Rieske. En aquest cas els nitrògens estan aportats per les histidines i els sofres per les cisteïnes.
4 Judith Gonzàlez Gallego Bioquímica T7 POTENCIALS DE REDUCCIÓ ESTÀNDARD Dels diferents components que intervenen en la cadena de transport electrònic es va veure que tenien potencials de reducció diferents. Sabem que la transferència d’electrons va d’un component amb un potencial de reducció més negatiu a un amb un potencial més positiu, així doncs si els ordenem segons el seu potencial podem arribar a saber quin és l’ordre d’actuació.
ASPECTES ENERGÈTICS DE LA CADENA DE TRANSPORT ELECTRÒNIC + El NAD té un potencial estàndard de -0,32 i els electrons són finalment cedits a l’oxigen que té un potencial estàndard de reducció de 0,82. Per tant, el canvi energètic que es produeix per cada parell d’electrons des del NAD+ fins l’oxigen és de -220 KJ/mol.
Sabent que per la síntesi d’ATP calen 35,5Kj /mol, podem deduir que amb aquesta alliberació d’energia per la transferència d’electrons s’allibera suficient energia per la formació de varies molècules d’ATP. L’acoblament energètic no és del 100% tot i així es poden sintetitzar més d’una molècula d’ATP.
5 Judith Gonzàlez Gallego Bioquímica T7 COMPLEXES DE LA CADENA DE TRANSPORT ELECTRÒNIC Estudi dels components de la cadena de transport electrònic mitocondrial Primer mètode d’estudi Per l’estudi de la cadena de transport electrònic va ser molt important veure que hi havia compostos que la bloquejaven. Es va poder determinar a quin nivell la bloquejava i a partir d’aquí es va saber com estaven ordenats.
El fonament es basava en el fet que la cadena de transport electrònic comença a partir d’un compost reduït que va cedint els electrons fins a l’oxigen i durant aquest procés es va oxidant. Per tant, si es produeix un bloqueig en aquest punt, tots els components situats més enllà del punt estaran més oxidats del que tindrien que estar ja que no han estat reduïts per l’anterior.
Si aquests compostos donen un espectre d’absorció diferent en funció si estan oxidats o reduïts, es pot seguir a veure en quin estat estan aquests compostos en funció de la presència o absència del blocant.
Es va veure que quan es posava rotenona els compostos a partir de la ubiquinona estaven més oxidats. Quan es posava la antimicina A es va veure que uns determinats compostos es trobaven més oxidats i altres més reduïts. Pel que fa al cianur o CO el que bloqueja és l’últim pas en la formació d’oxigen de manera que tots els compostos es trobaven reduïts.
Experimentant amb aquests i altres inhibidors es va poder anar seguint la seqüència d’aquests components a la cadena de transport electrònic.
6 Judith Gonzàlez Gallego Bioquímica T7 Segon mètode d’estudi Una altra de les estratègies que es va seguir va ser intentar aïllar els components de la cadena transport electrònic mitocondrial.
Es va fer un xoc osmòtic amb digitonina de manera que els mitocondris es van inflant fins arribar un punt on es trenquen. A partir de els membranes obtingudes es van fer etapes de purificació i finalment es va observar que obteníem associacions de components (complexes), cadascun dels quals eren capaços de catalitzar algunes de les etapes que formen part de la cadena de transport electrònic.
 Complex I capaç de catalitzar la transferència d’electrons des del NADH fins al coenzim Q.
 Complex II capaç de catalitzar la transferència d’electrons des del succinat fins al coenzim Q.
 Complex III capaç de catalitzar la transferència d’electrons des del coenzim Q fins el Citocrom C.
 Complex IV capaç de catalitzar la transferència d’electrons des del citocrom C fins a l’oxigen.
 ATP sintasa hidrolitzava l’ATP en ADP i fosfat inorgànic.
Així doncs, hi ha 4 complexes que formen part de la cadena de transport electrònic a la qual trobem associada un altre complex que és capaç de sintetitzar ATP. Es va veure que aquest component quan estava aïllat actuava com a una ATPasa.
7 Judith Gonzàlez Gallego Bioquímica T7 Components dels complexes de la cadena de transport electrònic A partir dels quatre complexes aïllats amb el mètode anterior, es va analitzar cadascun d’ells per tal de saber quina era la seva composició.
Complex I El complex I es tractava d’una NADH deshidrogenasa, és un complex amb una massa molecular molt gran i que està composat per una gran quantitat de cadenes polipeptídiques. Es va veure que en aquest complex hi havia coenzims del tipus FMN (mononucleòtids de flavina) i també centres ferro – sofre.
Complex II El complex II és una succinat deshidrogenasa, es tracta d’un complex més senzill que l’anterior i que conté únicament 4 subunitats. El complex II conté FAD i també centres ferro – sofre. Aquest complex no es considera que tingui citocroms.
Complex III El complex III és el de la ubiquinona citocrom C oxidoreductasa. Aquest citocrom és d’un pes molecular intermedi als anteriors i està format per 11 cadenes polipeptídiques. Trobem tant ferro hemínic com no hemínic, és a dir, hi ha citocroms i centres ferro – sofre.
Complex IV El complex IV és el de la citocrom oxidasa. Està composada per diferents subunitats. Pel que fa a la seva composició trobem citocroms (ferro hemínic) i també centres de coure.
Citocrom C Quan es van aïllar aquests components i es va intentar reconstituir el procés es va veure que a part d’aquests components de tipus aïllats faltava un altre component: el citocrom C.
El citocrom C és una proteïna petita que conté ferro hemínic i està format per una única cadena polipeptídica. No forma part de la membrana interna mitocondrial sinó que és una proteïna que pot saltar i difondre’s movent-se per l’espai intermembranós.
De manera que quan els mitocondris lisen es perd el que hi ha en aquest espai i per tant es perd el citocrom C.
8 Judith Gonzàlez Gallego Bioquímica T7 ESQUEMA GENERAL DE LA CADENA DE TRANSPORT ELECTRÒNIC L’estructura del complex I permet la transferència d’electrons des del NADH fins al coenzim Q i el complex II permet la transferència d’electrons des del succinat fins al coenzim Q. De manera que els complexos I i II són diferents punts d’entrada d’electrons a la cadena de transport electrònic, no van un darrere l’altre.
Del coenzim Q els electrons passen cap al complex III i d’aquest passen cap al IV. Entre mig interactua el citocrom C, en aquest moment interacciona amb la cara externa de la membrana mitocondrial permetent el pas dels electrons des del complex III cap al IV. Finalment, el complex IV cedeix els electrons a l’oxigen formant-se l’aigua.
En els components de la cadena de transport electrònic mitocondrial, hi ha alguns que ocupen tot l’espai transmembrana i altres que només ocupen la part interna de la membrana interna mitocondrial, de manera que no formen cap mena de transport transmembrana. Concretament el complex I, III i IV es troben a les dues bandes de la membrana, el complex II està inserit però no arriba a l’espai intermembrana.
Dels quatre complexos aïllats, aquells que ocupen tot l’espai intermembrana, actuen a la vegada com a transportadors de protons des de la part interna de la matriu mitocondrial cap a l’espai intermembrana.
A l’esquema podem diferenciar la cara N (matriu) i la cara P (espai intermembrana). Aquesta terminologia prové que des de l’interior es bombegen càrregues positives cap a fora de manera que la matriu mitocondrial quedarà carregada positivament a la part externa (espai intermembranós) i negativament a la interna (matriu.
9 Judith Gonzàlez Gallego Bioquímica T7 EL COMPLEX I El complex I és l’únic que permet la iniciació de la cadena de transport electrònic a partir de la cessió dels electrons del NADH. En aquest complex hi ha diferents components i proteïnes. Dins dels factors que s’utilitzen per a la transferència d’electrons trobem:  FMN, mononucleòtid de flavina.
 Proteïnes ferro – sofre  Proteïnes de Rieske que recordem que tenen el ferro coordinat amb deus cisteïnes i dues histidines.
partir del complex I els electrons són finalment cedits al coenzim Q. Cal tenir present que el coenzim Q no es troba dins del complex I de manera que no es tracta d’un coenzim integral sinó que queda lliure dins de la membrana. En la transferència d’electrons intervé el FMN que pot arribar a captar fins a dos electrons i també intervenen proteïnes amb centres ferro – sofre que transporten electrons d’un en un.
Pel que fa a la transferència d’electrons en el complex I, concretament, es cedeixen dos electrons del NADH fins al FMN que cedirà els electrons d’un en un als centres Fe – S que els seguirà passant fins al coenzim Q. Un cop el coenzim Q hagi captat dos electrons, captarà protons del medi i passarà a formar QH2 que quedarà localitzat dins la bicapa lipídica.
Globalment, quan es produeix aquesta transferència d’electrons ve associat a un bombeig de protons (4 H+). Cal distingir entre els protons que interaccionen amb el coenzim Q i els protons transportats.
El NADH cedeix 2 electrons i un protó que queda dissolt en el medi. Si mirem que necessitem per tal que funcioni el procés, veiem que calen 6 protons del medi però com que el NADH s’oxida i cedeix un protó, únicament calen 5 protons del medi. Per poder produir el procés també és necessària la presència de coenzim Q.
10 Judith Gonzàlez Gallego Bioquímica T7 Mecanisme d’actuació del complex I A la imatge podem observar que hi ha una part de la proteïna que queda fora de la bicapa, orientada cap a la matriu, i una altra inserida en la bicapa. La part encarada cap a la matriu i la que queda dins de la membrana són les parts que s’han pogut cristal·litzar.
Veient l’estructura es va definir com funcionaria la transferència d’electrons. El NADH deixa anar els dos electrons que són captats per FMN que els deixarà anar d’un en un pels centres ferro sofre. Fins que al final són transferits al coenzim Q per donar QH2. Cal tenir present que no només hi ha un centre ferro-sofre sinó que hi ha més d’un i transfereixen els electrons d’un en un. El fet que aquest sigui un procés ràpid fa que hi hagi una quasi simultaneïtat en la transferència d’electrons.
El mecanisme de bombeig de protons en el complex I no està gaire clar. Se suposa que es dóna com en el complex III i ho estudiarem posteriorment.
o FORMA DE BOMBEIG DE PROTONS  El mecanisme de bombei en el complex I no esta gaire clar. Se suposa que es dona com en el complex III i que studiarem posteriorment.
EL COMPLEX II El complex II és caracteritza per no bombejar protons. En la majoria d’esquemes s’indica que està inserit en la meitat de la membrana amb una part de complex que queda cap endins però, quan es va resoldre l’estructura del complex es va veure que tenia una part d’hèlix alfa hidrofòbiques que quedarien inserides a la membrana. Se sap que el complex II està format per diferents cadenes polipeptídiques.
Cal tenir present que en la transferència d’electrons intervé, bàsicament, la part interior i poca part intermembrana. En aquest cas no té el braç llarg que té el complex I i que permet el bombeig de protons.
El complex II és un complex que també conté FAD des d’on es cedeixen electrons fins els centres Fe – S. A partir d’aquí són transferits a la ubiquinona i possteriorment al coenzim Q que formarà QH2.
11 Judith Gonzàlez Gallego Bioquímica T7 El complex II es caracteritza per no tenir citocrom, és a dir, per no tenir ferro hemínic. Quan es va estudiar la seva estructura es va veure que sí que té un grup hemo del tipus hemo b. Llavors, això va fer plantejar si realment era correcta la seqüència de transferència en el transport d’electrons que havia estat proposada o bé si aquest grup hemo b tenia una altra funció. Es va concloure que l’hemo b no participa en el procés normal de transferència d’electrons, de manera que surten del complex sense passar per aquí.
En una transferència d’electrons es pot produir que algun s’escapi del camí que han de seguir en condicions normals i això ocasionaria problemes ja que poden interaccionar amb l’oxigen i així formar radicals lliures. S’ha vist que l’hemo b actua com a trampa per capturar aquells electrons que s’escapen de la via de transferència electrònica.
Mecanisme d’actuació del complex II El complex II cedeix els electrons des del FADH2 fins als centres ferro sofre i arriba fins al coenzim Q. En el complex II el donador d’electrons no és el FADH2, és a dir, el coenzim FADH2 no el trobem dissolt i lliure en el citosol o en la matriu mitocondrial sinó que aquest està unit fortament a la proteïna que l’utilitza com a coenzim. El primer substrat que cedeix els electrons a la cadena de transport és el succinat.
Mitjançant la succinat deshidrogenasa, associada a la membrana mitocondrial interna, el succinat passarà a fumarat cedint els electrons al FADH2. Recordem que aquest enzim també el trobem al cicle de Krebs.
Aquest complex és un dels models dels complexos que cedeixen electrons al coenzim Q sense haver-hi passat pel complex I. Trobem altres vies a partir de les quals es cedeixen electrons a la cadena de transport electrònic:  Degradació àcids grassos. Quan es degraden els àcids grassos es produeix FADH2 que queda unit a la oxidoreductasa que intervé en el procés de degradació. Hi ha uns enzims que s’encarreguen de transferir els hidrògens a una altra proteïna que actua com a transportador d’electrons, ETF (flavoproteïna transportadora d’electrons), i d’aquesta es transfereixen a la ETF:Q (flavoproteïna d’electrons coenzim Q oxidoreductosa) que finalment els cedirà directament al coenzim Q.
 Glicerol fosfat. Una altra via que permet la entrada de poder reductor cap a l’interior del mitocondri és la via en la qual intervé el glicerol 3 – fosfat deshidrogenasa que està associada a la part externa de la membrana interna mitocondrial Aquest enzim a partir del glicerol dóna dihidroxiacetona fosfat i els electrons es transfereixen directament al coenzim Q.
12 Judith Gonzàlez Gallego Bioquímica T7 Així doncs, hi ha altres vies que fan la mateixa funció que el complex II. Per tant, el coenzim Q és un punt d’integració de diferents vies de transferència d’electrons. Cal tenir present que els electrons que venen de la via del NADH provoquen el transport de protons cap enfora però totes les altres vies que cedeixen electrons no contribueixen al bombeig de protons.
Per una altra banda, hem de saber que el mecanisme de la cadena de transport electrònic no cal que comenci necessàriament des del NADH o el succinat sinó que pot començar a partir d’altres metabòlits que cedeixen electrons a les flavoproteïnes i que acaben arribant al coenzim Q.
EL COMPLEX III El complex III és el lloc per on passen tots els electrons, independentment de per on entrin. El complex III és un dels complexes que està millor caracteritzat: no solament està format per diferents cadenes polipeptídiques sinó que és un dímer de diferents cadenes que es troben associades formant l’estructura de la imatge. Podem diferenciar dues meitats que són idèntiques.
En el complex 3 trobem:  Centres ferro – sofre  Proteïnes de Rieske  Citocroms de tipus B i també tipus C, citocrom bc1.
Cal tenir present que el citocrom C que hi ha integral no és el mateix que transfereix els electrons. Es denomina així perquè es tracta d’una cadena polipeptídica única amb un grup hemo del tipus C unit.
El citocrom bc1, amb centres hemo i centres c, té la peculiaritat que de grups hemo C només hi ha d’un tipus però de grups hemo B en tenim 2 i que tenen propietats diferents segons l’espectre d’absorbància:  BL de longitud d’ona més baixa (562 nm)  BH de longitud d’ona més alta (566 nm) 13 Judith Gonzàlez Gallego Bioquímica T7 Tots aquests components intervenen en la transferència d’electrons i a la vegada el complex 3 uneix el coenzim Q pel qual té dos llocs d’unió: un que està situat prop de la matriu mitocondrial (part interna) i un altre prop de la cara externa.
El coenzim Q transporta electrons de dos en dos i els pot cedir a la vegada o bé d’un en un. Per una altra banda els centres ferro – sofre els transporten d’un en un igual que el citocrom C. Aquests electrons hauran de ser transportats fins el complex IV.
El cicle Q en la transferència d’electrons El cicle Q ens serveix per poder entendre com es produeix el bombeig de protons i la transferència d’electrons.
Arriba un QH2 que interacciona amb una de les subunitats del complex III en el costat de la cara intermembrana. El QH2 deixa anar els dos electrons i dos protons que s’aniran al complex intermembrana. Queden dos electrons, un dels quals és transferit als centres ferro – sofre, després al grup hemo c1 i posteriorment al citocrom C. Pel que fa a l’altre electró, és transferit cap a l’altre grup hemo, l’hemo Bl, que alhora és transferit al altre grup hemo, BH, que està situat més cap a l’espai intermembrana. L’electró és transferit a un altre component perquè el procés continuï, aquest el pot tornar a transferir al coenzim Q.
El coenzim Q oxidat interacciona amb el citocrom bc1 del complex III per la cara interna de la membrana mitocondrial interna i aquest pot actuar captant 1 o 2 electrons. En aquest cas el Q capta un únic electró.
Consideració: El coenzim Q reduït s’uneix a la part intermembranal i quan està oxidat a la part de la matriu mitocondrial.
Posteriorment, arriba un altre QH2 que fa el mateix procés, és a dir, deixa anar dos electrons i dos protons. L’electró que no va als centres ferro sofre serà transferit al coenzim Q. Cal tenir present que el coenzim Q pot tractar-se d’una nova molècula o bé una molècula que ja hagi rebut un electró i que per tant en rebre un segon electró és capaç de captar dos protons de la matriu mitocondrial i en conseqüència en podem obtenir un altre QH2.
En general s’han bombejat 4 proptons cap a l’espai intermembrana. Això ho podem veure en el balanç net: 14 Judith Gonzàlez Gallego Bioquímica T7 EL COMPLEX IV El complex IV és un complex que es diferencia dels anteriors en el fet que a part de tenir centres de tipus ferro també té centres amb coure que també intervenen com a transportadors. De fet hi ha dos tipus de centres: dos centres que tenen coure, coure binuclear (dos àtoms de coure), i després un altre centre que conté coure i a més grips hemo, concretament del tipus hemo A i a3, aquest és denominat com a citocrom aa3.
Mecanisme d’actuació del complex IV La transferència d’electrons es produeix a partir d’un citocrom que cedeix un electró i que és transportat pels centres de coure fins als centres que tenen el grup hemo, primer passen pel tipus a i després pels de tipus a3, seguidament són cedits a un altre centre de coure i finalment són transferits a l’oxigen.
Moltes vegades, a l’estequiometria de la reacció de la transferència electrònica es posa que a partir d’un NADH es forma una molècula d’aigua gastant mitja molècula d’oxigen. Cal tenir present que això no és possible, de manera que l’estequiometria s’ha de fer amb 2 NADH que cedeixen 4 electrons que són necessaris perquè es produeixi la reducció d’una molècula d’oxigen per donar dues d’aigua.
Això vol dir que durant el funcionament del complex IX han de marxar 4 citocroms, cadascun aportant un electró i que s’ahn de quedar dins del complex fins que són transferit a la molècula d’oxigen per donar aigua.
El procés no està clar però, al haver-hi tots els grups que transfereixen electrons es podrien quedar en els citocroms a, a3 i també en el CuA (binuclear), actuant així com a reserva d’electrons.
En aquest procés es produeix un bombeig de protons. A l’esquema observem que hi ha bombeig de 4 protons de la matriu mitocondrial a l’espai intermembrana. Per fer aquest càlcul, el que es té en compte és que entren 2 NADH, i en conseqüència se cedeixen 4 electrons amb els quals a partir d’una molècula d’oxigen es formaran dues molècules d’aigua. Considerem que cada molècula d’aigua transporta dos protons a l’espai intermembrana. En aquest cas no hi ha un consens respecte a com es produeix el bombeig de protons.
15 Judith Gonzàlez Gallego Bioquímica T7 ESQUEMA GENERAL DE LA CADENA DE TRANSPORT ELECTRÒNIC S’ha proposat un model de quines són les proteïnes i les estructures que formen part dels complexes de la cadena de transport electrònic. A dia d’avui encara falta per saber com és l’estructura del complex I que es troba inserida dins la membrana.
BALANÇ DE LES REACCIONS DE LA CADENA DE TRANSPORT ELECTRÒNIC En la reacció del complex I veiem que hi ha un protó apantallat això és degut que en molts esquemes el posen però en realitat no cal contar-ho a l’hora de fer el balanç.
16 Judith Gonzàlez Gallego Bioquímica T7 DERIVATS TÒXICS DE L’OXIGEN MOLECULAR Quan es produeix el transport d’electrons al llarg de la cadena de transport electrònic, els diferents complexos poden estar en contacte amb l’oxigen. Si la transferència funciona correctament, sabem que el complex IV contacta amb l’oxigen però també poden haver-hi altres components que contactin.
Vam veure que en el cas del complex II hi havia un grup hemo que servia per capturar els electrons que es desviaven del cicle i per retornar-los a la cadena. Cal tenir present que es considera que en aquest complex no hi ha grups hemo que participin en la cadena de transport.
Hi ha unes altres situacions que degut a la presència de l’oxigen, els electrons són cedits a l’oxigen abans d’arribar al complex IV, és a dir, a deshora i en conseqüència es creen radicals lliures oxidatius.
Així doncs, dins del mitocondri s’han de posar en marxa mecanismes que protegeixin a la cèl·lula contra l’estrès oxidatiu, és a dir, contra l’aparició de radicals lliures oxidatius. En el citosol havíem vist que s’elaborava amb el glutatió i que per fer-ho era necessària la presència de poder reductor. Un altre dels sistemes per copsar la formació d’aquests ions superòxids és per intervenció d’altres enzims com la superòxid dismutasa o la catalasa.
En el cas del mitocondri el sistema per contrarestar l’estrès oxidatiu també va lligat amb el glutatió. La glutatió reductasa, que està en la forma oxidada, passa a la forma reduïda. El pas de regeneració de glutatió oxidat mitjançant la glutatió peroxidasa és el que permet l’eliminació de peròxid d’hidrogen. Aquesta regeneració també dóna aigua. Pel que fa l sistema de reducció, cal tenir en compte que es produeix amb la participació de NADPH i dóna NADP+.
En el mitocondri la via de les pentoses fosfat no té lloc, per tant, necessitem altres sistemes que proporcionin NADPH. S’ha vist que tenim una transaminasa de nucleòtids (transhidrogenasa) que permet que a partir de NADH i NADP+, s’intercanviï el poder reductor per obtenir NADPH que participarà en el procés per contrarestar aquest estrès oxidatiu.
17 Judith Gonzàlez Gallego Bioquímica T7 Patologies que poden ocasionar danys per radicals lliures Hi ha diferents patologies que s’han descrit degut a la presència de radicals lliures d’oxigen. No vol dir que aquesta sigui la única causa però sí que és una de les característiques que hi ha en l’aparició d’aquestes patologies. Entre elles trobem:  Aterogènesi  Malalties hepàtiques provocades per l’alcohol  Emfisema: bronquitis  Diabetis  Parkinson  Síndrome de Down  Distròfia muscular de Duschene ALTERACIONS MITOCONDRIALS I APOPTOSI.
L’estudi de la cadena de transport mitocondrial va ser molt important de cara a la caracterització del que es coneix com mort cel·lular programada (apoptosi) que pot estar donada per la via intrínseca o la via extrínseca en funció dels diferents senyals extracel·lulars. Dintre d’aquestes vies d’inducció de l’apoptosi hi ha una en la que hi h una participació clara del citocrom C.
A partir de diferents senyals que la cèl·lula rep, s’acaba alterant la estructura de la membrana externa mitocondrial, concretament, varia la permeabilitat dels porus de la membrana. Entre la membrana externa i la interna és per on es va desplaçant el citocrom C, en condicions normals el citocrom C no surt perquè no és capaç de travessar els porus però si aquests s’alteren i es fan més grans, el citocrom podrà sortir. Quan surt és capaç d’interaccionar amb proteïnes citoplasmàtiques entre les quals trobem les APAF-1 (factor activador de proteases relacionades amb l’apoptosi) que interacciona amb una sèrie de proteïnes que són factors activadors de proteases relacionades amb l’apoptosi. Aquestes proteïnes oligomeritzen formant unes estructures anomenades apoptosomes.
Les proteases formades provoquen l’activació d’altres proteases cel·lulars conegudes com caspases. Així doncs, hi ha una cascada d’activació on l’apoptosoma activa la procaspasa – 9, aquesta activa la caspasa – 9 dimèrica que activarà altres caspases per proteòlisi com la 3 i la 7 que estan en forma de precursors. Aquestes són les que després induiran la degradació de proteïnes cel·lulars, la qual cosa provocarà un desequilibri en la cèl·lula i com a conseqüència la mort cel·lular.
18 Judith Gonzàlez Gallego Bioquímica T7 El procés de l’apoptosi a vegades es considera negatiu però cal tenir present que és necessari en diferents situacions durant el procés de desenvolupament cel·lular, s’ha de produir per tal que hi hagi un recanvi d’estructures.
A la vegada, l’estudi del procés d’apoptosi ha servit de cara al disseny de fàrmacs, concretament anticancerosos. Moltes vegades, una de les característiques de les cèl·lules tumorals és que perden la capacitat de produir apoptosi de manera que esdevenen insensibles a diferents fàrmacs que provoquen l’alteració del DNA o altres estructures, així doncs tot i que estiguin danyades no provocaran l’apoptosi.
En molts cassos el que és més important de cara a l’eficàcia del fàrmac no és que produeixi el canvi sinó que aquest canvi vingui acompanyat d’apoptosi. És per aquest motiu que molts fàrmacs que s’utilitzen es busca que siguin proapotòtics, és a dir, que facin que la cèl·lula entri en apoptosi.
TRANSPORT ELECTRÒNIC I FOSFORILACIÓ OXIDATIVA Fins al moment hem vist que com a conseqüència de la transferència d’electrons s’ha produït un bombeig de protons, el qual a creat un potencial de membrana on la matriu mitocondrial està carregada negativament i l’espai intermembrana positivament.
Aquest gradient és utilitzat per la síntesi d’ATP on els protons tornaran a entrar a la matriu.
Durant un temps es va pensar que els components de la fosforilació oxidativa i els de la síntesi d’ATP estaven associats però es va veure que això no era així. Realment, són processos que estan acoblats i els components no interaccionen físicament entre sí.
Per una banda el transport electrònic crea el gradient de protons que serà utilitzat per la fosforilació oxidativa per la formació d’ATP.
ENERGIA PROTÓ MOTORA Quan es crea un gradient de protons entre les membranes, també s’està creant una diferència de components entre elles. A l’espai intermembrana hi ha una concentració més elevada de protons.
Aquesta espècie química que està a diferents concentracions en una part i l’altre, també té càrrega de manera que també es crea un potencial elèctric.
19 Judith Gonzàlez Gallego Bioquímica T7 El canvi d’energia lliure que hi ha en el retorn dels protons per dins ve donat per: La diferència energètica serà utilitzada per la síntesi d’ATP. Com a conseqüència de la cadena de transport electrònic, es veu que la matriu mitocondrial es va perdent càrregues positives de manera que el pH es manté al voltant de 8,4 mentre que a l’espai intermembrana els valors estan a prop del 7. Hi ha 1,4 unitats de diferència pel que fa al pH de la matriu mitocondrial i l’espai 1,4 intermembrana. Recordem que es tracta d’una escala logarítmica de manera que la diferència real és de 10 , una diferència de protons important. A la vegada hi ha una diferència de càrregues que és d’ aproximadament 0,14 V. Això és el que contribueix a que es generi la força protó motora que permet la síntesi d’ATP.
MODEL QUIMIOSMÒTIC Els factors que contribueixen a la formació del gradient és el pas de protons a partir dels complexos: I, III i IV. Per cada dos electrons que són transferits des del NADH fins l’oxigen es bombegen 10 protons: 4 al complex I, 4 al complex III i 2 al complex IV.
La força per la síntesi d’ATP vindria donada per la diferencia de potencial químic i a la vegada pel potencial elèctric entre l’espai intermembrana i la matriu mitocondrial.
20 Judith Gonzàlez Gallego Bioquímica T7 ATP SINTASA Els protons entren cap a dins del mitocondri a través del complex de l’ATP sintasa en el qual trobem dues parts:  Part que forma el canal de protons  Part on hi ha l’activitat ATP sintasa Se sap que els protons, normalment, passen només pel canal de protons i per tant no travessen tota la ATP sintasa.
Quan es van aïllar els components es va veure que si s’aïllaven les membranes internes mitocondrials,a questes tenien el complex relacionat amb la síntesi d’ATP. Si aquestes membranes després es tractaven amb ultrasons es podien separar en dos components. Aquestes membranes es trencaven donant vesícules membranoses on quedaven uns components a la membrana i altres solubles.
 Components solubles. Els components solubles són els que estan relacionats directament amb el procés de síntesi d’ATP. Se sap que quan estan solubles degraden ATP. Són denominats com factor d’acoblament energètic : F1.
 Components de membrana. L’altre component que estava unit a les vesícules no sintetitza ni hidrolitza ATP, es va veure que actuava com un transportador de protons. Així doncs, permetia el pas de protons i també es va veure que venia inhibit per la presència d’un compost: la oligomicina. Per aquest motiu va ser denominat com factor inhibible per la oligomicina : F0.
Per tant, tenim dos components diferents: un que permet el pas de protons i l’altre que està relacionat amb el procés de síntesi d’ATP. Es va veure que cadascun d’aquests components estaven formats per cadenes polipeptídiques diferents: Els F o es van denominar com ABC i els F1 es van denominar com alfa, beta, gamma...
21 Judith Gonzàlez Gallego Bioquímica T7 Estructura del complex ATPsintasa A partir de l’estructura d’aquestes proteïnes i d’anàlisi en la síntesi i hidròlisi d’ATP es va acabar proposant un model de funcionament per l’ATP sintasa que està àmpliament acceptat.
En l’estructura de l’ATP sintasa hi hauria una part que formaria un carril de 10 cadenes polipeptídiques del tipus C. Aquestes són les que estan implicades en el transport de protons. Després trobem una cadena a que esta contactant amb el barril de cadenes C i a la vegada està contactant amb un dímer de cadenes b que forma una prolongació que surt de la membrana. Totes les C i les A estan associades a la membrana. Pel que fa a les b podem dir que estan integrades a la membrana i un tros que surt.
En aquest barri de subunitats c hi ha unida la subunitat epsilon de l’altre component que està contactant amb una altra proteïna, gamma, que al associar-se puja fins a dalt. La subunitat gamma travessa un altre barril que està constituït per tres heterodímers de subunitats alfa i beta. Aquest barril està unit físicament a la subunitat delta que està unida al dímer de les b.
La síntesi d’ATP es dóna en el barril alfa – beta de manera que en cadascun d’aquests dímers, en el beta hi ha un lloc on es pot produir la síntesi d’ATP a partir de la unió de ADP i Pi. Es considera que en cada moment ens podem trobar que d’aquests 3 dímers hi hagi un que estigui buit, altre que tingui unit ADP i Pi però que no hagi sintetitzat ATP i un altre que ja hagi sintetitzat ATP.
La seqüència en la que es dóna la síntesi d’ATP és: 1.
Hi ha un lloc buit degut a la alliberació d’un ATP.
2.
Aquest lloc passa a unir ADP i Pi.
3.
Se sintetitza ATP.
4.
L’ATP s’allibera de manera que queda un nou lloc buit per poder tornar-se a donar la síntesi.
Es considera que en cada una de les etapes un dels dímers està en la conformació O (buit), un altre en la conformació L (ADP i Pi units de manera feble: light) i un altre en el qual hi ha un interacció forta: conformació T (ATP format).
El fet que el dímer estigui en una conformació o en una altra ve donat per el contacte, és a dir, el cop que li dóna la tija central (gamma) va girant el barril. A la imatge es veu que aquesta subunitat és més o menys recta però això no és correcte ja que aquesta està una mica torta de manera que únicament es produeixi el contacte amb un dels dímers alfa – beta. El contacte provoca que el dímer separi l’ATP, és a dir, li proporciona energia.
22 Judith Gonzàlez Gallego Bioquímica T7 Catàlisi rotacional En qualsevol reacció si tenim síntesi d’ATP per un enzim en dissolució, partiríem d’un nivell energètic baix i acabaríem en un nivell energètic molt alt de productes, de manera que s’ha de proporcionar una gran quantitat d’energia (gràfic blau). En el cas de l’ATP sintasa no és així, sinó que es produeixen una sèrie de canvis energètics que podem veure al gràfic vermell.
Es va veure que els canvis que es produeixen segueixen la cinètica del gràfic. El fet que es produeixi la unió d’ATP i fosfat no requereix energia. En la següent etapa es genera quasi ATP però aquest no s’allibera sinó que queda dins de l’enzim. En el pas següent hi ha un canvi energètic molt fort que permet l’alliberament d’ATP, això també permet que es produeixi el gir de la cadena gamma.
Per veure que realment la cadena gamma gira i es produeixen contactes, el que es va fer és expressar in vitro un complex ATP sintasa. Això es va fer expressar les cadenes alfa i beta i que s’assemblessin. fer-ho es van fer proteïnes recombinants que contenien el tag per la cua d’histidines. Una de les maneres per purificar proteïnes recombinats és que en el cDNA se li addiciona en un dels extrems un tros de DNA més que codifiqui per una marca que posteriorment ens permeti seleccionar aquella proteïna, una de les marques molt utilitzades és la cua de histidines que tenen la peculiaritat que interaccionen amb el níquel.
Per tant, si estem en un suport que tingui níquel quelat, la proteïna amb la cua d’histidines quedarà unida i es podrà separar de les altres. Es van expressar també les altres cadenes polipeptídiques del components i es van deixar que s’assemblessin. En el barril de les c, en una de les subunitats es va fer codificar perquè presentés avidina, una proteïna que té molta tendència a interaccionar amb els filaments d’actina. Els filaments d’actina estaven marcats amb un compost fluorescent, per tant tota la cua d’actina quedava fluorescent. Això es va posar sobre un suport i va queda immobilitzat, es va mirar la hidròlisi de l’ATP (ja que al no trobar-se en la membrana mitocondrial no es s’esperava que actues com a ATPsintasa), concretament es va mirar que passava amb el filament fluorescent d’actina.
A la imatge podem veure com el filament d’actina va donant voltes, la qual cosa demostrava que la subunitat gamma anava girant i canviant els contactes.
23 Judith Gonzàlez Gallego Bioquímica T7 Complex ATP sintasa i transport de protons A la síntesi de l’ATP, quan està a la membrana mitocondrial, es denomina com un procés de catàlisi rotacional: canvia quina és la subunitat on es fa la funció i a la vegada hi ha una mobilitat física.
S’ha vist que a l’ATP sintasa és molt important l’estructura de les cadenes C que són les que s’uneixen protons. Concretament és un barril de cadenes C que estan inserides dins de la bicapa lipídica, és a dir, dins d’un ambient hidrofòbic.
En cada unes de les subunitat C, trobem en el centre quan està replegada dins de la membrana un aspàrtic, que és el que intervé en el transport de protons.
L’aspàrtic pot estar dissociat però si hi ha una concentració elevada de protons al seu entorn es protonarà. Cal tenir present que si en la situació torna a disminuir la concentració de protons, es dissociarà. Aquest procés és el que es creu que passa durant el transport de protons: es van captant protons del lloc on hi ha molts (espai intermembrana) i es van deixant on hi ha pocs (matriu).
En aquest transport intervé l’estructura de la subunitat a. La subunitat a és una subunitat transmembrana i està unida al barril de C, la seva estructura forma com dos solcs, dos canals que arriben fins a la meitat de cadascun. En aquests forats poden entrar o sortir protons en funció de la concentració de protons que hi hagi en l’espai en el qual estan encarat.
Quan la subunitat C està a la membrana sabem que l’aspàrtic estarà protonat ja que d’aquesta manera no té càrrega i té major tendència a quedar-se. Quan l’aspàrtic arriba protonat passa d’un entorn hidrofòbic a interaccionar amb el canal que hi ha dins de la subunitat a, que no és hidrofòbic, i per tant en aquest punt es pot permetre la dissociació. Si resulta que en l’espai on està obert el canal, la concentració de protons es baixa, aleshores al dissociar-se el protó sortirà.
En l’etapa següent aquest barril gira i l’aspàrtic cap a la posició esquerra de l’esquema lila, de manera que si la concentració de protons és alta, l’aspàrtic es protonarà. Per passar a la posició dreta cal que hi hagi un gir, això també farà que la subunitat adjacent estigui en posició esquerra. Cal tenir present que un cop ha passat de posició esquera a dreta no té tendència a tornar cap a la dreta ja que està protonat i la tendència a inserir-se a la bicapa lipídica és gairebé nul·la.
24 Judith Gonzàlez Gallego Bioquímica T7 La pressió de protons és el que fa que tot això es vagi movent i girant sempre en la mateixa posició. Per tant, el gir no és en qualsevol sentit, concretament en el sentit de les agulles del rellotge. No pot girar al revés ja que per fer-ho el glutàmic que hi ha dissociat s’hauria d’inserir dins la bicapa lipídica i no hi ha tendència.
Aquest és un dels sistemes més caracteritzats, i ens permet que a partir d’una força (gradient de protons) es passi cap a la síntesi d’un compost químic que tingui enllaços rics en energia i que posteriorment podran ser utilitzats per al manteniment de diferents processos cel·lulars. Aquest fenomen de síntesi d’ATP és molt similar al procés de la fotosíntesi, tot i que en aquest cas també es necessita poder reductor.
Depenent el dibuix les cadenes C poden estar representades en la part superior de la membrana i en altres casos en la inferior.
Aquest fet ens pot confondre i pensar que giren en sentits diferents però cal tenir present que únicament giren en el sentit de les agulles del rellotge.
Consideracions Pel que fa a com està assemblada l’ATP sintasa encara hi ha certes discussions i això es reflecteix en els esquemes que es fan.
Recordem que el barril únicament gira en el sentit de les agulles de rellotge, però podem trobar esquemes on giri cap a l’esquerra, això és degut que depenent cap a on estiguin orientades les alfa i les beta a la imatge sembla que diguin coses contràries. Realment volen dir el mateix.
Als esquemes també trobem diferències quan s’indica per on entren a la ATPsintasa els protons que van a la matriu. El que es creu és que la subunitat a és la que participa en el procés i per tant el que tenim és una idealització gràfica.
Per una altra banda, tampoc se sap exactament quin és el contacte entre la subunitat gamma i la epsilon, l’únic que se sap és que estan contactant entre elles i amb el barril C.
ATP sintasa Per cada volta que dóna tot el barril sencer es produeix la síntesi de 3 ATP. A l’esquema de les posicions podem observar que per poder sintetitzar cada ATP necessitem 3 protons, de manera que per donar una volta sencera calen 9 protons. Realment calen 10 protons ja que hi ha 10 subunitats i ha de passar un per cada subunitat.
Si comencem des del NADH, es transporten cap a l’espai intermembrana 10 protons. Per tant, els electrons cedits a partir del NADH donen suficients protons per tal que es pugui produir una volta sencera a l’ATP sintasa. Així doncs, es considera que 1 NADH formarà 3 ATP. Si es comença des del complex II o des d’altres vies, només es bombegen 6 protons, de manera que es formen menys ATPs, un promig de 2 ATPs.
25 Judith Gonzàlez Gallego Bioquímica T7 SISTEMES DE TRANSPORT MITOCONDRIAL Sistema nucleòtid d’adenina transslocasa i sistema fosfat translocasa Aquestes consideracions de l’apartat anterior es van haver de modificar perquè quan es va revisar es va veure que el valor era inferior. Això era degut al sistema que per un costat era de síntesi d’ATP i per l’altre era de transport de nucleòsids entre matriu mitocondrial i espai intermembrana.
Dintre de la matriu mitocondrial es va sintetitzant ATP, de manera que necessitem ADP i fosfat inorgànic. L’ATP podrà ser transportat a l’espai intermembrana per un sistema de transport. Concretament aquest sistema de transport és un antiport que comporta una sortida d’ADP a una entrada d’ATP. Per cada ATP que surt es dóna un ADP que podrà ser utilitzat de nou amb una entrada de fosfat inorgànic.
Per tal que es transporti un fosfat inorgànic a l’interior de l’espai intermembrana cal un altre transportador paral·lel (simporter) a partir del qual entrarà fosfat inorgànic associat a una sortida de protons. Aquest fet atenua el gradient entre la membrana interna mitocondrial i l’espai intermembranós. Cal un protó per cada fosfat inorgànic que surt, de manera que caldran 3 protons per tal que l’ATP sintasa doni una volta complerta.
Sabem que necessitem 10 protons perquè l’ATP sintasa elabori el gir sencer i 3 protons perquè es transporti el fosfat inorgànic. Això ens fa arribar a la conclusió que per cada parell d’electrons transferits des del NADH, el rendiment en quant a síntesi d’ATP és d’aproximadament 2,5 ATP. Recordem que el NADH es troba dins el mitocondri.
La cadena de transport electrònic i la fosforilació oxidativa són processos acoblats però que no estan totalment units. De manera que no ha d’existir una estequiometria directa sinó que es pot produir una pèrdua del gradient per altres circumstàncies.
Llançadora de malat – aspartat Dintre del mitocondri hi ha moltes reaccions metabòliques en les quals es genera NADH, com ara la betaoxidació dels àcids grassos. Aquest NADH pot ser cedit directament al complex I. Per una altra banda, en el citosol hi ha moltes reaccions metabòliques amb les que s’obté NADH i que no serà transportat com a tal dins del mitocondri, sinó que s’utilitzaran sistemes de transport de poder reductor. En trobem diversos sistemes però el més modèlic és el transportador de malat – aspartat.
La llançadora del malat aspartat implica una sèrie de reaccions tant dins del mitocondri com en el citosol i també el transport de diferents metabòlits. Aquests transportadors són del tipus antiport, és a dir, un entra i l’altre surt.
26 Judith Gonzàlez Gallego Bioquímica T7 Es produeix un cicle on no hi ha pèrdua de carbonis, el compost de partida (oxalacetat) dóna una volta al cicle i el tornem a obtenir. La diferència està que des del primer oxalacetat del citosol, per actuació de la malat deshidrogenasa, obtenim malat que entra al mitocondri per un sistema d’antiport. En el mitocondri el malat és utilitzat per la malat deshidrogenasa mitocondrial, fent que obtinguem de nou l’oxalacetat. Per tant, tenim un sistema que permet el transport d’oxalacetat fins a l’interior.
El que hem aconseguit és que el NADH que hi havia en el citosol es trobi ara en el mitocondri, és a dir, ens permet el transport del poder reductor del NADH. Per cada NADH citosòlic transportat al mitocondri per la llançadora del malat – aspartat també es poden generar 2,5 ATPs ja que no hi ha un consum energètic en el procés.
Llançadora glicerol 3 – fosfat En el cas de la llançadora glicerol 3- fosfat, el que succeeix és que a partir de NADH citosòlic i utilitzant la dihidroxiacetona com a substrat, obtenim el glicerol 3-fosfat mitjançant la glicerol 3- fosfat deshidrogenasa citosòlica.
Com ja havíem comentat en alguns esquemes anteriors, també hi ha altres vies d’entrada d’electrons a la cadena mitocondrial i que no impliquen el complex I o II. Un exemple és a partir de la glicerol 3- fosfat deshidrogenasa que trobem a la cara externa de la membrana mitocondrial i que fa la reacció inversa, és a dir, obtenim dihidroxiacetona fosfat. La deshidrogenasa citosòlica no utilitza NAD+ sinó que utilitza FAD+, que cedirà els electrons directament a la ubiquinona, és a dir, complex II.
El rendiment de generació d’ATPs no és el mateix ja que el primer complex no està implicat, en aquest cas per cada FADH2 es generen aproximadament 1,5 ATPs.
Quan elaborem el càlcul de rendiment energètic per NADH que es genera en el mitocondri sempre és la mateixa però si aquest NADH és generat en el citosol, sabem que el rendiment pot variar en funció de la llançadora que utilitzi.
27 Judith Gonzàlez Gallego Bioquímica T7 INHIBIDORS DE LA FOSFORILACIÓ OXIDATIVA Hi ha diferents punts que actuen com a reguladors del flux de la via en particular. En el cas de la fosforilació oxidativa hi ha alguns mecanismes de control que són molt senzills. En la fosforilació oxidativa i en la cadena de transport electrònic es coneixen molts compostos que actuen com a inhibidors selectius d’algunes etapes i això ha permès conèixer com es produeix el transport electrònic.
Dintre d’aquests compostos en trobem alguns que condueixen a que no hi hagi síntesi d’ATP ni transport d’electrons, és adir, que no funcioni ni la fosforilació oxidativa ni el sistema de transport electrònic. En són exemples:  Monòxid de carboni i cianur que actuen inhibint la citocrom oxidasa.
 Rotenona que inhibeix la transferència d’electrons des dels centres ferro sofre (complex I) fins la ubiquinona.
Hi ha altres que actuen directament sobre l’ATP sintasa com ara la oligomicina que bloqueja el transportador de protons a través del component Fo.
Trobem també altres compostos que desacoblen els dos processos, és a dir, permeten que hi hagi transport d’electrons sense que hi hagi fosforilació oxidativa. Un exemple és el dinitrofenol que es tracta d’un compost que es pot dissoldre fàcilment a través de la bicapa lipídica, de manera que s’insereix entre la membrana interna mitocondrial. Quan la forma dissociada està encarada a l’espai intermembranós (que és molt ric en protons) capta el protó i se’n va cap a l’altra part de la membrana on el deixa. Així doncs, actua com un transportador de protons i el seu efecte és la disminució del gradient de protons entre l’espai intermembrana i la matriu mitocondrial.
Gràfic 1 Al gràfic podem veure que el cianur para la cadena de transport electrònic mitocondrial ja que bloqueja el complex IV. Així doncs, no es generarà gradient de protons i tot i haver-hi ADP i Pi no es produirà la síntesi d’ATP.
Veiem la representació gràfica d’una preparació de mitocondris intactes en la qual s’addiciona directament ADP i Pi. No hi haurà consum d’oxigen si no hi ha cap compost reduït que cedeixi electrons a la cadena de transport electrònic i que generi el gradient de protons, de manera que no hi haurà sínetsi d’ATP.
En el moment en el què s’addiciona succinat, proporcionem la font d’electrons, és a dir, comença a funcionar la transferència d’electrons i la síntesi d’ATP.
Quan addicionem cianur es para tant la cadena transport com la síntesi d’ATP ja que els dos processos estan acoblats.
28 Judith Gonzàlez Gallego Bioquímica T7 Gràfic 2 Es tracta de la mateixa situació però es canvia l’ordre d’addició dels compostos per veure que si addicionem poder reductor i no poder inorgànic, tampoc sintetitzarem ATP.
Es forma un gradient de protons tan gran que serà poc probable que es continuïn bombejant protons, de manera que el procés si no tenim ADP i Pi s’atura. En el moment en què addicionem ADP i fosfat es reprèn la transferència d’electrons i en aquest moment sí que hi ha síntesi d’ATP.
Si afegim oligomicina, la transferència d’electrons pot continuant produint-se però l’ATP sintasa no funciona ja que el canal de retorn de protons està blocat. Una altra vegada es crearà un gradient de protons molt gran fins el punt que s’aturi la transferència d’electrons.
Si en aquesta situació afegim dinitrofenol, el gradient es dissiparà i es podrà tornar a produir la transferència electrònica. Mitjançant una despesa de poder reductor que no té utilitat ja que el DNP eliminarà el gradient que es crea.
Regulació de les vies productores de ATP La cadena de transport electrònic i fosforilació oxidativa també estan regulades.
L’únic que s’ha vist que regula la cadena de transport electrònic és la sensibilitat a la presència de compostos reduïts.
Pel que fa a la regulació de l’ATP sintasa, és la presència d’ADP i Pi el que afavoreix que funcioni. Així doncs, la velocitat de la fosforilació oxidativa depèn de les necessitats energètiques de la cèl·lula.
A l’esquema podem veure la regulació de les diferents etapes en les que hi ha control des de la glucosa fins on es produeix la descarboxilació total a nivell del cicle de Krebs.
29 Judith Gonzàlez Gallego Bioquímica T7 METABOLISME OXIDATIU DE LA GLUCOSA: BALANÇ GLOBAL Obtenim que el balanç global de la glucosa és: El poder reductor en forma de NADH es forma la gran majoria en el mitocondri, però els de la glucolisi es produeixen en el citosol de manera que el seu rendiment depèn de la llançadora per la qual entren al mitocondri. Depenent de quina sigui,e l rendiment de la glucòlisi canviaria a 30 o 32 ATPs per molècula de glucosa.
30 Judith Gonzàlez Gallego Bioquímica T7 PROTEÏNES DESACOBLANTS I TERMOGÈNESI En els animals s’ha vist que hi ha dos tipus de teixit adipós ben diferenciats. Un d’ells es coneix com teixit adipós marró degut al seu aspecte. Aquest aspecte terrós és causat perquè tenen una elevada quantitat de mitocondris, de manera que s’espera que aquest sigui un teixit molt actiu en la síntesi d’ATP. En realitat s’ha vist que no sintetiza molt ATP sinó que està relacionat amb la temperatura coroporal.
En les reaccions químiques que es produeixen en els éssers vius contribueixen a la temperatura corporal, però el mecanisme que es posa en marxa per mantenir el calor corporan en un determinat nivell és bàsicament per les reaccions que es donen en el teixit adipós marró.
Així doncs, en el teixit adipós marró hi ha molts mitocondris, molt actiu en la cadena de transport electrònic mitocondrial, però no tenen una gran síntesi d’ATP. No és gaire eficient perquè en el teixit adipós marró s’expressa una proteïna que s’insereix a la membrana interna mitocondrial i que actua com a transportador d’electrons. El que fa és que quan funciona la cadena de transport electrònic mitocondrial, es bombegen protons cap a l’espai mitocondrial i aquests en comptes de retornar per l’ATP sintasa, retornen per aquesta proteïna. En aquest procés es desprèn molta calor i la proteïna que intervé és coneguda com termogenina.
Aquest procés no és l’únic exemple de proteïna que serveix per regular i proporcionar calor. Les plantes també tenen un mecanisme i tot i no ser igual que en els animals, hi ha sistemes alternatius en la membrana mitocondrial interna. En aquests complexos es transfereixen els electrons a un transportador que els cedeix directament a l’oxigen, és a dir, sense passar per tots els complexos Hi ha sistemes alternatius en algunes plantes on es permet la transferència de protons no lligada a la síntesi d’ATP sinó lligada a la producció de calor.
31 ...