Tema 8 - Protocols d'anàlisi (2014)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Genética - 2º curso
Asignatura Citogenètica
Año del apunte 2014
Páginas 6
Fecha de subida 26/12/2014
Descargas 13
Subido por

Vista previa del texto

CITOGENÈTICA PARCIAL 2 BLOC V: Tècniques d’anàlisi i identificació cromosòmica TEMA 8 – Generalitats dels protocols d’ana lisi citogenetica CULTIU CEL·LULAR 5/11/14 Es basa en l’especificitat que requereixen les cèl·lules que contenen. Poden contenir aminoàcids, vitamines, sals, glucosa, sèrum, factors de creixement, antibiòtics i roig de fenol – tot el que la cèl·lula necessiti per reproduir-se. Sempre a una temperatura, pressió i [CO2] adequada.
Diferenciem dos tipus de cultius: - Primaris – a partir d’una biòpsia o suspensió cel·lular.
Secundaris – es fan a partir d’una fracció d’un cultiu primari, és un procés de subcultiu.
MITÒGENS Habitualment el punt de partida és el cultiu de les cèl·lules. Generalment, a citogenètica, es pretén utilitzar metafases. Per tant, si fas servir teixits amb una taxa de proliferació baixa, necessites estimular el creixement, i això s’aconsegueix amb unes molècules anomenades mitògens, que estimulen la divisió cel·lular. A citogenètica, un dels tipus tissulars més usats per cariotipar són els limfòcits de sang perifèrica.
Exemple 1 – la fitohemaglutinina (PHA) estimula la divisió dels limfòcits T – fa que hi hagi una reacció antigen-anticòs i comença una reacció immunològica per generar immunoglobulines.
Aquesta capacitat és la que s’utilitza per tenir més cèl·lules disponibles per l’anàlisi.
Exemple 2 – En ratolins funciona molt bé la Concavalina A, que estimula també els limfòcits T.
Exemple 3 – el Pokeweed mitogen (PWM) s’usa per l’estimulació preferent dels limfòcits B.
1 CITOGENÈTICA PARCIAL 2 INHIBIDORS ANAFÀSICS Els inhibidors anafàsics són drogues que s’uneixen a la tubulina inhibint la polimerització dels microtúbuls. Com a conseqüència les cèl·lules s’acumulen en l’estadi de metafase: c-mitosi, cromosomes més curts amb les cromàtides més separades La colcemida i la colxicina són les mes utilitzades.
El procediment és el següent: El resultat final són C-mitosis – no són iguals que els cromosomes metafàsics in vivo ja que porten un temps bloquejats a metafase, estan drogats. Tot aquest temps produeix un increment de la condensació de la cromatina. Per tant, una de les característiques d’aquests cromosomes és que són molt petits, curts, amb les cromàtides separades i altament condensats.
SINCRONITZACIÓ CEL·LULAR Per enriquir un cultiu en diferents fases d’un cicle cel·lular, s’utilitzen mètodes de sincronització cel·lular.
Qualsevol manera de dur-ho a terme es basa en la utilització de molècules que interfereixen de diferents formes la síntesi de desoxiribonucleòtids durant la fase S (quan es replica el DNA que requereix dels desoxiribonucleòtids C,G,A i T). En bloquejar-ne la síntesi, bloquegen la fase S i deixen les cèl·lules bloquejades durant la replicació per després fer que totes les cèl·lules reprenguin el cicle alhora.
2 CITOGENÈTICA PARCIAL 2 Trobem diferents molècules que comporten un bloqueig de la cèl·lula en fase S: 1. Excés de timina – això el que fa és bloquejar el pas en vermell.
2. Metotrexat (Ametopterina) – inhibeix l’enzim dihidrofolat reductasa que catalitza la reacció en blau.
3. Fluorodesoxiuridina – FdU, bloqueja el pas en verd.
L’efecte final en és que en un cultiu cel·lular les cèl·lules quedaran bloquejades en fase S i per tant si coneixem el timing de diviso de les cèl·lules sabem que al cap de tantes hores de tractament ja estaran bloquejades. Una vegada les tenim bloquejades aquestes cèl·lules reprendran la divisió cel·lular en el moment en que eliminem els inhibidors de la fase S.
D’aquesta manera es reinicia la fase S i aquest reinici es produeix de forma sincrònica en totes les cèl·lules, de manera que si coneixem el timing de divisió de cada fase de la mitosi, simplement controlant el temps i fent extraccions a diferents temps tindrem poblacions enriquides en diferents tipus cromosòmics.
Imatge – exemple de cromosomes profàsics i prometafàsics.
3 CITOGENÈTICA PARCIAL 2 SOLUCIÓ HIPOTÒNICA Quan sotmetem les cèl·lules a solucions hipotòniques, incrementem el volum cel·lular (entrada massiva d’aigua, s’usen soluts no permeables).
Aquest procés, en el cas de cèl·lules animals que no tenen paret cel·lular, s’ha d’anar en compte i buscar un equilibri entre inflar la cèl·lula per tal de realitzar una bona extensió i passar-nos d’inflament i acabant lisant la cèl·lula. Normalment s’utilitza KCl 0’075M, però també són freqüents NaCl (0’9%), etc.
En el moment en que el globus explota en el portaobjectes, com més grans és el globus, més gran és l’extensió dels cromosomes i menys solapaments i més individualitzats i dispersos i més xaxi tot.
FIXACIÓ CEL·LULAR La única finalitat de la fixació és passar d’una estructura cel·lular dinàmica a una estructura molecular estàtica (preservem l’estructura cel·lular).
Normalment s’utilitza una solució formada per 3 parts de metanol i una part d'àcid acètic coneguda amb el nom de Carnoy. El procés de fixació te lloc mitjançant dues reaccions: - Canvi de pH que provoca la desnaturalització (fixació) permanent de macromolècules (pH=2).
Mecanisme de deshidratació que substitueix l’H2O per metanol afectant la configuració de les proteïnes i el DNA i, per tant, fixant-les.
L’efecte final és la deshidratació i la consegüent desnaturalització proteica.
Les primeres gotes s’han de tirar poc a poc i en la paret del tub i en constant moviment per evitar agregats.
Generalment els portaobjectes de vidre utilitzats poden tenir diferents tipus de superfícies. La manera en que la cèl·lula s’enganxa determina la manera en que tu després pots accedir al material i la potència de la unió també determina la preservació del material.
Els portaobjectes estan format de sílice amb grups OH. Aquests grups tenen una càrrega neta negativa. Teòricament, aquesta càrrega negativa interacciona amb la càrrega neta negativa dels grups fosfat de la cromatina i aquesta repulsió de càrregues facilita l’extensió.
Trobem diferents sistemes que incrementen la càrrega neta negativa de la superfície del porta: 1. Fregament 2. Mantenir els portaobjectes al congelador 3. Emmagatzemar els portaobjectes en un dissolvent fixador (metanol).
4 CITOGENÈTICA PARCIAL 2 No està demostrat que res d’això funcioni. Es fa perquè funciona. La 3ª és la que té més lògica perquè quan es tallen els portaobjectes potser que es creï una capa de greix que amagui les càrregues negatives, i el metanol la treu.
MÈTODES DE PREPARACIÓ D’EXTENSIONS CROMOSÒMIQUES S’han de tenir en compte una sèrie de variables a l’hora de triar una tècnica: - Quantitat de cèl·lules que disposem; els protocols complexes impliquen la pèrdua de material.
Possibilitat de repetir l’anàlisi.
Informació que volem obtenir.
Totes les tècniques existents s’agrupen en dos grans grups: ASSECAMENT A L’AIRE L’impacte contra el vidre produeix el trencament de la membrana plasmàtica i l’alliberament del contingut. Si és una cèl·lula en metafase, s’alliberen cromosomes..
Per tant, com més distància posem entre nosaltres i el portaobjectes, més fort és l’impacte, més dràstic és el trencament i més bona és l’extensió.
- Les cèl·lules en suspensió tractades amb solució hipotònica i fixador es deixen caure sobre un portaobjectes.
La membrana cel·lular es trenca i els cromosomes s'estenen a sobre de la superfície de vidre.
Permet obtenir preparacions permanents de cromosomes i l’aplicació de diferents tècniques d’identificació cromosòmica.
Hi ha derivacions d’aquest mètode per quan tenim un menor nombre de cèl·lules.
AIXAFAMENT O SQUASH Per un anàlisi més a l’engròs, es fa servir squash (mètode fàcil i ràpid que dóna molta informació).
5 CITOGENÈTICA PARCIAL 2 Exigeix la presència de cèl·lules en divisió. El protocol consta de tres etapes diferents: 1. Partim de cèl·lules en divisió (incubació del teixit en solució hipotònica) i s’aixafa sobre la superfície del portaobjectes.
2. Tractament amb fixador acídic.
3. Tinció.
Això acaba permetent observar cèl·lules en diferents fases de la mitosi.
6 ...