Tema 6 - Anàlisi productes PCR (II) - Detecció de mutacions per PCR (2016)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Genética - 3º curso
Asignatura Diagnòstic Genètic Molecular
Año del apunte 2016
Páginas 11
Fecha de subida 10/04/2016
Descargas 21
Subido por

Vista previa del texto

Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 DETECCIÓ DE MUTACIONS PER PCR PCR – RFLP Es tracta d’una PCR on s’amplifica una seqüència que conté possibles polimorfismes o RFLPs.
De manera semblant al Southern blot, podem analitzar mutacions que afecten a la seqüencia estudiada (amplificada). Procedirem a l’anàlisi de mutacions en el fragment amplificat.
Per Southern, podem detectar la presència d’una mutació si aquesta modifica una diana de restricció. En el cas de la PCR, faríem una primera amplificació, seguida d’una segona amplificació aniuada d’una alíquota de la primera. Sobre aquest producte, faríem una digestió amb enzims, com pot ser el BstXI. Si l’enzim no digereix, obtindrem una banda d’una mida determinada. Si el digereix observarem una banda més petita.
Diagram of the CD24 Gene and Genotyping of Four Polymorphic Sites by PCR-RFLP En aquest cas no utilitzem sondes; el que observem és la quantitat de DNA marcat amb un colorant fluorescent. Els fragments més petits retindran menys colorant i donaran una intensitat menor, encara que hi hagi més còpies. Això ho fem per cada seqüència concreta.
És una eina molt senzilla i molt més ràpida que el Southern perquè amplifiques la seqüència que t'interessa a partir de mostres més petites. Té una limitació, i és que si la mutació no afecta al fragment de restricció no podem detectar-ho per Southern, perquè si és una mutació puntual que no afecta la diana no ho veurem. Per PCR si que podem detectar mutacions que no afecten a dianes de restricció. Per això utilitzem PCR específiques d’al·lel, on s’utilitzen encebadors específics de l’al·lel.
152 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Diana MstII en l’anèmia falciforme S’amplifica la regió d’interès, es digereix, i s’observen en el gel les bandes que corresponen a cada al·lel.
Recordem tema intensitats: aquestes bandes de l’heterozigot esperem que siguin de la mateixa intensitat, perquè detectes la sonda. En cas del gel d’agarosa, les intensitats són diferents; tu observes el colorant fluorescent.
Com més colorant, més intensitat lluminosa. Tu esperes que en el producte de la PCR hi hagi el mateix nombre còpies dels dos al·lels. Les còpies digerides queden repartides en dues bandes més petites. La major quantitat de colorant que queda retinguda en la banda superior és major que en les altres dues bandes. Es perd intensitat a mesura que els pb de base disminueixen. Per tant, les intensitats són diferents si analitzes sondes en Southern o colorant retingut en un gel d’agarosa.
Així doncs, els anàlisis de RFLP es poden fer per PCR; amplifiques un fragment que porti tots els punts d’interès i després fas una segona PCR dels punts que t’interessa analitzar del fragment. Cada producte es digerirà amb l’enzim corresponent.
153 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 PCR ESPECÍFICA D’AL·LEL – ASA 31/03/16 En Southern detectes variacions en la llargada del fragment de la restricció, per tant la mutació ha d’afectar la diana o la grandària. Les mutacions que no afecten la diana es poden detectar amb una PCR especifica d’al·lel. Si hi ha present una determinada variant al·lèlica, posaràs l’encebador corresponent i amplificarà o no en funció de si hi es i podràs detectar la variant.
La base del funcionament de l’ASA (allele specific amplification) és l’estabilitat de l’extrem 3’ hidroxil que necessita encebar la polimerasa. Si l’extrem 3’ no aparella correctament, es desestabilitza l’estadi inicial de la polimerasa, no pot encebar correctament i no hi ha síntesi.
Per tant dissenyarem 3 encebadors: els encebadors 1 i 2 seran específics d'al·lel, el seu extrem 3’ coincidirà amb un nucleòtid de la regió a amplificar, el 1 per la forma salvatge i el 2 per la forma mutada; l’encebador 3 serà comú a les dues variats i serà el que permetrà l’amplificació del fragment (hem de posar un encebador que amplifiqui la regió tingui o no la variant).
Tindrem un amplicó d’una grandària determinada. Llavors fem 2 PCRs: una amb els encebadors 1 i 3, i una amb els encebadors 2 i 3. La PCR 1+3 és específica per l’al·lel 1, i la PCR 2+3 és específica per l’al·lel 2. Si en la PCR 1 hi ha amplificació, estarà present la variant de l’al·lel 1. Si no, aquesta variant està absent. De la mateixa manera, si en la PCR 2 hi ha amplificació, estarà present la variant de l’al·lel 2. Si no, aquesta variant està absent.
Si nomes hi ha amplificació en la PCR1 1 o en la PCR 2, l’individu és homozigot. Si amplifiquen les dues PCRs, l’individu és heterozigot.
El primer 1 (P1) hibrida amb l’al·lel 1 però no hibrida amb el 2, no són complementaris, i el mateix pel P2.
154 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Exemple del que acabem d’explicar: - Utilitzem l’encebador específic per l’al·lel 1 (P1) + R (reverse, encebador comú).
Utilitzem l’encebador específic per l’al·lel 2 (P2) + R (reverse, encebador comú).
Si només amplifica amb un dels encebadors podem suposar que és homozigot per un dels al·lels. Si amplifica pels dos casos, serà heterozigot.
Les ASA van bé en els casos de sistemes bial·lèlics (la majoria de polimorfismes son bial·lèlics).
Podem tenir un fals positiu en el cas que l'encebador s'uneixi de manera no específica a l'al·lel que no és. Si el nucleòtid està a l'extrem 3' i no desestabilitza suficientment la polimerasa ens pot donar un fals positiu. És per això que en el penúltim/últim nucleòtid introduïm expressament un base pair error, un error d'aparellament per incrementar les desestabilitzacions en l’extrem 3' en cas que no hagi hibridat amb l’al·lel que li correspon.
Quan l’encebador és l’específic, l’extrem 3 aparella encara que hi hagi un missmatch en el nucleòtid final. Si no és l’específic, no hi ha un nucleòtid que no aparella, sinó que n’hi ha dos, i això és suficient perquè es desestabilitzi totalment l'extrem 3'.
155 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 En aquesta taula tenim grau de desestabilització: el màxim és el canvi de G-C per A-T. Si el canvi és de G-T per A-C, l’aparellament és encara prou fort per tal que no hi hagi una desestabilització que impedeixi la síntesi.
Control de l’amplificació En l’ASA, el resultat que esperem és presència o absència de resultat; amplificació o no amplificació. Per controlar que hem fet bé el procediment, a part del producte analitzat s’amplifica un amplicó conservat. Si amplifica el control i el nostre no, és perquè el nostre no està present, però la PCR sabem que no ha fallat, i viceversa. Si el control no amplifica hem de tirar la PCR a la basuri.
El control normalment es fa fent una PCR dúplex en la qual introduïm un nou parell d’encebadors per una regió conservada del genoma. Hem de mirar que la grandària de l’amplicó generat sigui diferent a la del amplicó de la seqüència problema.
En aquest cas ens podem trobar bandes que correspondran a dímers d’encebadors.
156 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Identificació d’una mutació que confereix susceptibilitat a l’hemocromatosi.
Tenim identificat el punt polimòrfic: dissenyem un encebador específic per una cadena on el seu extrem 3’ coincideixi amb la mutació, i un altre encebador en l’altra cadena on l’extrem 3’ també coincideix amb la mutació. A més necessitem dissenyar un reverse per cadascun d’ells per poder amplificar la seqüencia determinada.
Una manera de no haver d’afegir una regió conservada com a control és fer la reacció amb 4 encebadors enlloc de 3 (posaríem 2 de reverse). Com estan presents els dos encebadors reverse, es donarà un tercer amplicó més llarg, que serà el que ens serveixi com a control.
D’aquesta manera en una sola reacció tens la fiabilitat que els resultats indiquen si l’al·lel està present o no. Això és més econòmic que dissenyar diferents encebadors pels controls.
Recordem que per poder amplificar necessitem els R1 i R2. Per tant tindrem 2 encebadors per cadena. Perquè amplifiqui amb l’al·lel 1 present, els primers 1 i R1 són necessaris. Perquè amplifiqui amb l’al·lel 2 present, els primers 2 i R2 són necessaris. Per tant tindràs dos productes de PCR, i la seva grandària ha de ser diferent.
Si només està l’al·lel 1, tindràs un producte de X pb, i el mateix per 2. Els heterozigots presentaran les dues bandes. A més d’això, com R1 i R2 estan dissenyats en cadenes diferents, amplificaran un producte comú que sempre amplificarà, i aquest serà el teu control.
Com veiem a la imatge, les dues bandes de l’heterozigot són molt properes; hi ha una diferència de bases molt petita.
Conclusió: és més fiable un anàlisi dels RFLPs que un ASA.
157 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 HIBRIDACIÓ ESPECÍFICA D’AL·LEL – ASO A la PCR, podem utilitzar oligos específics d’al·lel per determinar la presència de mutacions. Cada encebador és un oligonucleòtid, i és específic perquè es dissenya de manera que hibridi o no amb una variant al·lèlica en l’extrem 3’.
Ara bé, aquests oligos els podem utilitzar com a encebadors (en el cas que hem vist, ASA) o com a sondes (en el cas que veurem, ASO).
ASO ve d’allele specific oligonucleotide. És una espècie de Southern blot però sense electroforesi.
Amplifiquem per PCR la seqüència que ens interessa analitzar, a on possiblement estigui present la mutació, desnaturalitzem el producte amplificat i ho transferim a un filtre. Afegim solució alcalina, dipositem sobre el filtre, i fixem. El producte hibrida així en sondes específiques d’al·lel.
Estabilitat dels híbrids d’àcids nucleics En sondes grans hi poden haver errors de complementarietat, però generalment hibrida de manera estable, ja que un error d’un nucleòtid passa més desapercebut que en una sonda petita. Fins i tot pot suportar un cert grau de no complementarietat sense afectar greument l’estabilitat. potser baixarà una mica l’estabilitat de l’híbrid, però pots arribar a tenir sondes grans amb un grau de missmatch elevat. Es manté estable perquè el nombre de polihidrògens costa de desnaturalitzar.
Treballant amb oligonucleòtids, un missmatch genera prou inestabilitat en l’estructura híbrida com perquè es mantingui. El punt màxim de desestabilització dels oligos és la part central de l’oligonucleòrid. Si desestabilitzem l’extrem, la desestabilització és dèbil. Però si la desestabilització té lloc en el centre, tot el bloc queda desestabilitzat.
Al llarg de la sonda trobem diferents dominis amb diferent composició de bases, i l’estabilitat de cada un és diferent, amb la qual cosa la Tm de cada un és diferent també. Si es desestabilitza la part central, baixa molt la Tm de l’estructura híbrida, i per tant es desnaturalitzarà amb més facilitat.
158 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Per tant, si utilitzem oligos com a sondes de manera que la mutació estigui al punt central, podrem discriminar molt bé la hibridació perfecta de la imperfecta (missmatch). Si incrementem molt la severitat, es desnaturalitza tant si l’aparellament és perfecte com si no, però hi ha un rang de severitat on es mantindrà unit si està perfectament aparellat i on es desnaturalitzarà si hi ha un missmatch, i així podrem discriminar. Es tracta de trobar les condicions on la hibridació és perfecta. Si ho és, es manté la hibridació amb l’oligonucleòtid, si no, no es manté.
159 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 ASOH Allele specific oligonucleotide hybridization. Característiques: - L’anàlisi es fa per dot-blot directe.
El DNA motlle és DNA amplificat per PCR corresponent a les seqüències a analitzar.
Les sondes són oligonucleòtids de 19-21nt.
Anem a veure un exemple en l’anèmia falciforme.
Volem detectar un canvi en un aminoàcid, produït per una mutació. Els oligos que dissenyarem seran els següents: - Un oligo hibridarà amb l’al·lel salvatge, de manera que ens permetrà determinar la presència de l'al·lel salvatge. Es donarà hibridació en l’individu normal i l’heterozigot.
L’altre oligo hibridarà amb l’al·lel que conté la mutació. Al hibridar-lo amb el filtre, hibridarà en l’heterozigot i en l’homozigot per l'al·lel mutat.
En el filtre afegim un control positiu i un control negatiu. En el positiu hi ha d’haver hibridació, i en el negatiu no. Així ens assegurem que la hibridació s’ha donat correctament.
Després de la hibridació s’han de fer rentats de relativa severitat.
160 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Hi ha dues opcions: - - Podem hibridar, deshibridar i tornar a hibridar, és a dir, fer totes les mostres en un filtre. Cada mostra tindrà unes coordenades en el filtre, de manera que podrem analitzar moltes mostres. En cada hibridació posarem una sonda per un al·lel diferent i llavors analitzarem el resultat d’una mostra sabent les seves coordenades (si ens dóna positiu per les dues sondes, és heterozigot).
Fer un filtre per cada mostra.
La fotografia següent mostra un ASOH per individus afectats per fibrosi quística.
DOT BLOT Directe Fixem sobre el suport sòlid el DNA a analitzar i aquest hibrida amb sondes marcades. Amb aquest tipus de Dot blot podem analitzar una mutació den diferents pacients.
Revers Partim d’un suport sòlid on hi ha les sondes sense marcar fixades usades en l’anàlisi. El que marcarem són els productes que hagin amplificat per PCR (la mostra que analitzem). Amb aquest tipus de Dot blot podem analitzar la presència de diferents mutacions en un mateix individu.
161 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Si tenim 5 possibles mutacions, dissenyarem una sonda que aparelli perfectament amb l’al·lel mutat i el normal per cada mutació, de manera que tindrem 10 sondes; 5 específiques de l’al·lel normal i 5 específiques per l’al·lel mutat.
Posem les 5 parelles de sondes al Dot blot.
Si hibriden totes les sondes normals vol dir que l’individu és normal per aquestes 5 sondes que analitzes. De les imatges següents, la 2a foto correspon a un heterozigot per la 4a mutació; hibriden tots perfectament però en la 4a apareixen dos blots. La 3a correspon a un individu mutant per la primera mutació, i té els al·lels salvatges de les altres. La 4a correspon a un doble heterozigot.
La intensitat és menor en els heterozigots que en els homozigots pel número de còpies.
Aquests dot blots es venen de manera comercial.
162 ...