10. Naturaleza de los virus y metodología virológica (2016)

Apunte Español
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Biología - 3º curso
Asignatura Diversitat funcional de microorganismes
Año del apunte 2016
Páginas 5
Fecha de subida 13/06/2017
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Usuario: julesdms Júlia de Mas Naturaleza de los virus y metodología virológica.
Virus como entidad biológica.
 En la fase extracelular o virión los virus poseen pocas o ninguna enzima y no puede reproducirse fuera de la célula huésped.
 En la fase intracelular, existen principalmente como ácidos nucleicos replicativos, que inducen al metabolismo del huésped a sintetizar componentes del virión; finalmente, se liberan los nuevos viriones al exterior.
Estructura y complejidad de los genomas víricos.
La composición y estructura de los genomas víricos es más variada que ninguna encontrada en cualquiera de los reinos animal, vegetal o procariota.
En cualquiera de estos casos el genoma vírico ha de cumplir una condición: el código genético vírico ha de ser reconocido y decodificado por el organismo huésped.
En nuestro caso tenemos DNA de doble cadena, entonces el material genético tendrá que ser DNA de doble cadena, aunque si es un RNA de una cadena y puede ser leído por los ribosomas no hace falta que pase a DNA.
Ciclo vírico.
Para replicarse, el virus ha de inducir a la célula huésped a sintetizar todos los componentes esenciales necesarios para producir más viriones. Estos componentes han de autoensamblarse en nuevos viriones, que han de salir de la célula. La replicación vírica consta de 5 etapas: 1. Unión (adsorción).
2. Penetración o inyección. Hay virus que solo liberan el material genético y la cápside se va, mientras que en otros casos entra directamente en la célula.
3. Síntesis de ácidos nucleicos y proteínas víricas.
4. Ensamblaje.
5. Liberación de viriones.
Usuario: julesdms Júlia de Mas Metodología virológica.
Obtención de partículas víricas: los inicios.
Si siembran células en césped y se introduce un virus y entonces este va entrar en alguna célula y entonces vamos a ver una zona sin crecimiento (apocalipsis) Luis Pasteur (1885) Louis Pasteur desarrolló la primera vacuna viral atenuada, concretamente para erradicar la rabia. La rabia se transmite a través de la mordedura de animales.
Pasteur infectaba conejos con la rabia, y usaba liquido espinal de dichos conejos para infectar a otros conejos, y así en sucesivos pases. Con esto, conseguía atenuar la capacidad infecciosa del agente causante.
La preparación vírica resultante causaba una enfermedad muy leve en las personas inoculadas, pero estas quedaban protegidas frente a la rabia.
Dimitri Iwanosky (1892) Dimitri Iwanosky observó que el agente causante de la enfermedad del mosaico del tabaco no quedaba retenido en filtros cerámicos de un poro tan pequeño que deberían retener cualquier bacteria.
Hizo un experimento muy sencillo, machacó hojas de tabaco, y se quedó con el líquido.
Seguidamente lo filtro en unos filtros de cerámica, que tenían un poro muy pequeño, más pequeño que las bacterias. Entonces el líquido filtrado lo utilizaba para infectar una planta de tabaco.
Si esta enfermedad fuera causada por bacterias, la planta no tendría que enfermase. Pero si lo hacía.
Walter Reed (1890).
Demostró que el virus causante de la fiebre amarilla se transmitía por la picadura de los mosquitos.
Max Theiler (1937).
Desarrolló el cultivo de un virus en embriones de pollo (huevos) y así pudo producir una vacuna atenuada, la cepa 17D, que ayudó a controlar la epidemia de fiebre amarilla y que aún es la que se usa hoy en día.
Esto llevó entre los años 30 y 50 al estudio y desarrollo de modelos animales para identificar, propagar y estudiar diversos virus.
Obtención de partículas víricas: sistemas animales.
El uso de animales como “fábricas” de virus presenta ventajas:  Obtención de virus que no pueden producirse por otros métodos.
 Estudio de la patogenia de los virus infecciosos.
 Testado de posibles vacunas.
Usuario: julesdms Júlia de Mas Sin embargo, también presenta algunos problemas:  Mantener e infectar animales con virus patógenos es caro (y peligroso).
 Los animales son sistemas complejos, dentro de los cuales es difícil a veces discernir “qué pasa” (“caja negra”).
 Los resultados no son siempre reproducibles, debido a variaciones entre diferentes individuos.
 El uso de animales para usos experimentales puede comportar problemas éticos.
 Han podido ser reemplazados por otros sistemas (cultivo celular, biología molecular, etc.) Obtención de partículas víricas: cultivos celulares.
El uso de cultivos celulares empezó a inicios del siglo XX, con el cultivo de órganos enteros. En los primeros experimentos, se aisló un pequeño trozo de un riñón de mono, el cual se mantuvo durante algunos días en una solución salina con nutrientes. Esto abrió las puertas al cultivo celular tal y como lo entendemos hoy en día.
Tipos de cultivo celular:  Cultivos primarios: aquellos que provienen directamente de un organismo. Solo pueden mantenerse por un número limitado de “pases”. Solo las células cancerosas pueden crecer indefinidamente a partir de un cultivo primario ya que tienen mutaciones que hacen que sean inmortales. Un ejemplo de las células cancerosas son las células de HeLa, del año 1951.
 Cultivos de células “inmortalizadas”: células que han sido modificadas, mutadas, para poder mantenerse “indefinidamente” en el laboratorio.
John Enders (1949) Propagó poliovirus en un cultivo primario de células humanas. Esto abrió las puertas al aislamientos e identificación de numerosos virus en la década de los años 50.
Renato Dulbecco (1952) Fue el primero en cuantificar una preparación de virus usando la técnica de “plaque assay”.
Efectos citopáticos.
Cambios visuales en la célula huésped debidos a la infección viral. Usados para detectar y cuantificar células infectadas.
Efectos citopáticos más comunes:       Formación de cuerpos de inclusión citoplasmáticos.
Redondeamiento o contracción de las células.
Fusión o formación de sincitios.
Agregación de las células.
Pérdida de la adherencia.
Lisis y muerte celular.
Usuario: julesdms Júlia de Mas Métodos más habituales para el estudio/cuantificación de virus en el laboratorio.
Básicamente, hay 4 métodos usados comúnmente para estudiar los virus en el laboratorio:  Ensayo de placa (plaque assay)  Método del punto final de la dilución o dosis infecciosa TCID 50 (Tissue Culture Infective Dose 50%).
 Ensayos de hemaglutinación.
 Ensayos de transformación (ensayos de “focos”).
Ensayo en placa.
Se diluye la muestra de los virus y se mezcla con las células bacterianas, posteriormente se siembra en el agar. Las bacterias crecerán como cualquier cultivo, en toda la placa hasta dar un crecimiento en césped. En aquellos sitios donde haya caído el virus se observarán placas de transparencia que indican que no hay crecimiento (agujeros).
Cada agujero muestra una infección viral y si lo contamos sabremos cuantos viriones hay en la muestra inicial.
Método del punto final de dilución o la dosis infectiva 50.
Es anterior al desarrollo del ensayo de placas. Aun se usa para estudiar aquellos virus que no forman placas pero que dan efectos citopáticos en cultivos celulares. No es tanto para cuantificar sino para estimar el efecto.
Se infectan cultivos monocapa, y se observan aquellos que presentan efectos citopáticos como signo de infección. Se determina qué dilución resulta en un 50% de las células infectadas.
También se aplica para estudios de virulencia en animales.
Se aplica el mismo criterio que para cultivos: se determina la dosis que causa enfermedad en el 50% de los animales infectados.
Hemadsorción o hemaglutinación.
La hemaglutinación es la aglutinación de los hematíes o glóbulos rojos. Se emplea rutinariamente en técnicas de determinación de cargas vitales.
Se debe a la presencia de antígenos en los eritrocitos capaces de reaccionar con proteínas específicas de algunos microorganismos (entre las que destacan las hemaglutininas). Algunos virus pueden unirse a eritrocitos y aglutinarlos.
No sirve para todos los virus, solo por los capaces de hemaglutinar. Algunos virus tienen moléculas que pueden interactuar con otras moléculas presentes en la superficie de los eritrocitos.
 Si se da hemaglutinación se forma como una especie de malla. Entonces en el pozo se ve todo rojo, la red ocupa todo el pocillo.
 Si no se da hemaglutinación se formará un botón denso en el centro del pocillo.
Nos sirve para detectar la carga vírica, se hacen diluciones del suero y se ponen en pozos con glóbulos rojos, esperamos un tiempo prudencial (minutos) y miramos donde hay hemoaglutinación y donde no. Cuando hablamos del título del suero es aquella dilución que nos da un efecto.
Usuario: julesdms Júlia de Mas Si un paciente no hemaglutina puede ser:  Porque no está infectado.
 Pero si sabemos que tiene el virus, puede ser que tenga una mutación que no le permita aglutinar.
Esto nos permite saber qué pacientes tienen una mayor carga viral.
Ensayo de focos.
Se emplean para determinar si un virus es capaz de transformar o inmortalizar las células. Esto es especialmente importante y notable en los virus que causan tumores como los retrovirus.
Las células transformadas dejan de crecer en monocapa y pierden la inhibición por contacto, apilándose unas sobre otras como focos.
Purificación y estudios ultraestructurales de viriones.
Las medidas físicas de los viriones empezaron en los años 1930. Las primeras determinaciones del tamaño se hacían mediante filtración a través de membranas de diferentes tamaños de poros.
Estas medidas se afinaron en los años 60, mediante estudios de sedimentación por ultracentrifugación. Esto además permite obtener viriones relativamente puros.
Se usan ultracentrifugaciones en gradientes de sucrosa, entonces podremos saber en qué zonas bandea el virus y vamos a saber en qué parte está el virus.
Microscopio electrónico.
Los microscopios electrónicos utilizan electrones para realizar imágenes de las células y las estructuras. La longitud de onda del rayo de electrones es mucho más corta que la de la luz, resultando una mejor resolución.
Existen dos topos de microscopios electrónicos:  El microscopio electrónico de escaneo (SEM), en el que se deposita la muestra, se le rocía con algún tipo de metal y se bombardean con electrones.
 El microscopio electrónico de transmisión (TEM), los electrones pasan a través de la muestra y nos permite ver estructuras internas.
Niveles de biopeligrosidad.
Las agencias han definido cuatro niveles de seguridad dependiente de con que estamos trabajando. Del I al IV, aumenta de menos a más riesgo, siendo el IV el mayor y en el que hay un riesgo individual y comunitario. La diferencia entre III y IV, es si hay sistemas de vacunación.
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