PROBLEMA 3 (2016)

Ejercicio Español
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Nanociencia y Nanotecnología - 1º curso
Asignatura Biología Celular
Año del apunte 2016
Páginas 2
Fecha de subida 07/10/2017
Descargas 0
Subido por

Vista previa del texto

PROBLEMA 3 La nucleoplasmina, una proteïna pentamèrica de 165 KDa, és sintetitzada en el citoplasma dels oòcits de granota i posteriorment importada dins al nucli a través dels complexes del porus nuclears. Els monòmers de nucleoplasmina poden ser digerits amb un enzim en condicions controlades, obtenint-se un cap (C) i una cua (T). Quan la proteïna pentamèrica nativa es digereix amb l'enzim pepsina, és possible obtenir 5 tipus diferents de pentàmers de nucleoplasmina que contenen els 5 caps però als quals els hi manquen una o més cues: C5T4, C5T3, C5T2, C5T1 i C5T0. Així, per exemple, C5T5 correspon la proteïna pentamèrica nativa amb 5 caps i 5 cues; C5T4 correspon a un pentàmer al qual li manca una cua; i C5T0 correspon a un pentàmer al qual li manquen les 5 cues.
Quan es microinjecten en el citoplasma d'oòcits de granota els pentàmers C5T5 i C5T0 marcats amb 125I, només el C5T5 es localitza al cap d'una estona dins el nucli.
a) Creus que aquesta observació demostra que són necessàries les 5 cues de la nucleoplasmina perquè aquesta pugui ser importada dins el nucli? S'han proposat dues hipòtesis per explicar la funció de les cues de la nucleoplasmina en el procés d’importació de la proteïna al nucli: (I) l'eficiència d'importació de la nucleoplasmina és proporcional al nombre de cues; i (II) l'estabilitat dels caps de nucleoplasmina dins el nucli és proporcional al nombre de cues (és a dir, les cues protegeixen la nucleoplasmina de ser degradada dins el nucli). Per tal de comprovar quina d'aquestes dues hipòtesis és la correcta, dissenyes el següent experiment: marques radioactivament (amb 125I) els sis pentàmers indicats anteriorment (C5T5, C5T4, C5T3, C5T2, C5T1 i C5T0), els ajustes a la mateixa concentració molar, i els microinjectes simultàniament en el citoplasma dels oòcits de granota.
Passats 30 minuts lises els oòcits, separes la fracció nuclear i la citoplasmàtica, i les analitzes mitjançant electroforesi en gels de poliacrilamida-SDS i autoradiografia. Els resultats obtinguts es mostren a la figura següent. Fixa't que no apareixen bandes de baix pes molecular en el gel.
b) Què t'indiquen els resultats que s'observen en el gel sobre la relació entre el nombre de cues i la presència de la nucleoplasmina dins el nucli? Los resultados del experimento nos demuestran claramente la existencia que hay entre las colas y la capacidad de la proteína para entrar al núcleo. Como podemos observar en la banda del C5T0 no aparece ninguna banda en la parte del núcleo indicándonos que ni una sola nucleoplasmina del tipo C5T0 no ha entrado al núcleo. Así progresivamente vemos una correlación entre el grosor de las bandas y el número de colas. Por ejemplo en el caso del C5T1 observamos que la mayoría de la nucleoplasmina no ha podido ser importada o transportada al núcleo, pero que una minima parte si ha sido importada ya que vemos una banda muy fina. Y así sucesivamente hasta que observamos que la nucleoplasmina del tipo C5T5 entra totalmente en el núcleo. Esto nos demuestra que realmente la nucleoplasmina necesita de alguna cola para que pueda ser importada, ya que C5T0 no entra en absoluto al núcleo. El experimento también nos demuestra que no son necesarias todas la colas para que las proteínas puedan ser importadas y transportadas pero si que cada mas mayor sea el numero de colas mayor es la capadidad y eficiencia que tendrá la proteína de entrar al núcleo. Evidencia de este resultado: La mayoría del C5T1 se queda en el citoplasma pero una infima parte entra al núcleo, mientras que todo el C5T5 entra al núcleo.
c) Dibuixa en el gel quins resultats esperaries obtenir si la hipòtesi (I) fos la correcta i comenta'ls breument.
Si la hipótesis (I) fuese correcta, los resultados serían los mismos ya que como hemos dicho se ve claramente que la cantidad de nucleoplasmina (grosor de la banda) dentro del núcleo aumenta progresivamente y que la cantidad de nucleoplasmina (grosor de la banda) en el citoplasma disminuye progresivamente al número de colas.
d) Dibuixa en el gel quins resultats esperaries obtenir si la hipòtesi (II) fos la correcta i comenta'ls breument.
Si la hipótesis (II) fuese correcta, los resultados serían diferentes. Según esta hipótesis, las colas no son necesarias para que la nucleoplasmina sea importada al núceo. Al contrario, las colas son necesarias para proteger las cabezas de la nucleoplasmina una vez dentro del núcleo para que no sean degradadas. Por tanto, no es un requisito que las nucleoplasminas lleven colas para poder entrar a núcleo. Así, la imagen que veriamos sería solo bandas en la parte derecha, esto es, solo aparecerían bandas en la parte del núcleo, ya que todos los tipos de nucleoplasminas entrarían al núcleo. En estas bandas veriamos también una aumento progresivo del grosor de las bandas proporcional al número de colas. Así en el tipo C5T0 no aparecería banda ya que sería totalmente degradada y al contrario el tipo C5T5 aparecería la banda entera, con un grosor grande.
e) Quina de les dues hipòtesis creus que és la més consistent amb els resultats de l'experiment? Creo que la hipótesis (I) es la más apropiada y acertada teniendo en cuenta los resultados del experimento.
Los resultados de la hipótesis (I) son los mismos que los resultados obtenidos al principio. La hipótesis (I) demuestra la relación que hay entre la capacidad de entrar al núcleo con el número de colas, así es factible y veraz el hecho de que aparezcan dos bandas en cada lado, uno en el lado del citoplasma y otro en el lado del núcleo.
f) D'acord amb la hipòtesi escollida, a quina part de la molècula de nucleoplasmina creus que es localitza el senyal d'importació nuclear? De acuerdo con la hipótesis escogida, creo que la señal de importación nuclear se encuentra en las colas de la nucleoplasmina. Se encuentran en la cola ya que hemos dicho que la eficencia de la importación esta relacionada con la señal de importación , ya que sin esta la proteína no puede ser importada al núcleo (el caso de C5T0). Así cuando el número de colas incrementa también incrementa el número de señales de importación nuclear, incrementando al igual la eficiencia que tiene la nucleoplasmina para entrar al núcleo.
g) Per tal d'esbrinar quins són els requeriments energètics del procés d'importació de macromolècules dins el nucli, repeteixes l'experiment anterior però ara microinjectant un inhibidor de GTPases juntament amb els sis pentàmers de nucleoplasmina. Quin creus que serà el resultat de l'experiment i per què? Si repetimos el experimento microinjectando un inhibidor de GTPasas a la vez que microinjectamos los seis tipos de pentameros de nucleoplasmina ( C5T0… C5T5) el proceso sera diferente. Como ya sabemos a la proteina se le une un complejo de imporatción gracias al NLS. Por otra parte, antes de entrar al núcleo mediante los poros nucleares la proteina se une a dos importinas. Una de ellas es la impotina A (alfa) que ayuda a crear el complejo proteina y importina B (beta), por tanto actua como adaptador. Una vez se ha creado el complejo entra al núcleo. Dentro del núcleo la proteina tiene que liberarse de las importinas, Esto sucede gracias al ranGTP., que disocia el complejo y se une a la importina B, para luego salir del nucleo, ya que necesitamos importinas B fuera del nucleo para que actuen como carioferinas en la importación de proteinas al núcleo. Si echamos inhibidores de ranGTPasas, una vez la nucleoplasmina ha entrado en el núcleo los ranGTP seran hidrolizados o inhibidos y así no podrán disociar el complejo ni tampoco unirse a la importina B para sacarlas del núcleo. Por tanto el proceso que veremos al principio sera igual que antes, pero llegados un momento el proceso se detendrá. Esto sgnifica que todas las impotinas beta han sido utilizadas para meter a la nucleoplasmina al núcleo y como el ranGTP esta inhibido dentro del nucleo no deja salir importinas beta. Por tanto los resultados seran los mismos, solo que una parte de la nucleoplasmina se quedara afuera obligadamente y sin importar de que tipo es (C5T0, C5T1…), ya que no hay carioferinas o importinas B que puedan importar la nucleoplasmina dentro del nucleo.
...

Comprar Previsualizar