BM (11-3-15) Mètode d'anàlisi experimental de la topologia del DNA (2015)

Vista previa del texto

→Mètode d’anàlisi experimental de la topologia del DNA.
En aquesta imatge tenim el resultat d’una electroforesi en la qual s’analitzaven diferents topoisòmers de DNA. En el carril de l’esquerra tenim el DNA lineal.
Respecte aquest, al carril contigu, tenim l’extrem oposat: el DNA circular amb un alt grau de superenrotllament. Al carril de l’extrem dret tenim DNA circular relaxat, és a dir, nicat. Aquest presenta un seguit de bandes que tenen una distància comparable entre elles. El DNA lineal migra a poc a poc respecte el DNA superenrotllat, però no és així respecte el DNA nicat.
DNA QUE CORRE MOLT → supercoiled DNA QUE CORRE POC → nicat Les bandes corresponen a diferents topoisòmers. Totes elles difereixen en un increment unitari de L. Per què hi ha aquesta discriminació en la velocitat de migració de les molècules en el gel? Hidrodinàmicament la forma de la molècula influeix en la velocitat de migració. Per tant els topoisòmers que migrin més seran els que tenen un W més gran, perquè tindran una forma més compacta. Recordem la fórmula de L=W+T. Si canviem L, forçosament W o T han de canviar. Si canviés el twist no podriem apreciar diferències electroforètiques, doncs tots els DNA tindrien la mateixa forma. Per tant tota la tensió estructural cau sobre W.
Una altra tècninca que ens ha ajudat a analitzar experimentalment la topologia del DNA és l’ús d’agents intercalants. La substància més utilitzada és el bromur d’etidi (EtBr), però se n’utilitza una gran varietat. El mecanisme de funcionament dels agents intercalants és que s’intercalen, com el seu nom indica, entre els parells de bases, i n’augmenta la fluorescència. Això ens permet, per exemple, apreciar en un gel electroforètic les bandes si l’irradiem amb raigs UV. Un altre agent intercalant molt utilitzat és la cloroquina.
En analitzar la mescla de dos dinucleòtids complementaris en presència de bromur d’etidi per cristal·lografia de raigs X, i es va obtenir una imatge en la qual s’apreciava clarament que les molècules de l’agent estaven posades paral·lelament entre les bases: intercalades. Això és possible perquè la molècula de bromur d’etidi té una part plana formada per tres anells aromàtics heterocíclics. Té un fenil unit per un enllaç senzill que no forma part del bloc, i es posa fora del pla a 90º respecte aquest. No afecta a les parelles de bases perquè no arriba a xocar amb elles.
Quan posem el bromur d’etidi entre les bases, s’omple l’espai buit que hi ha entre aquestes. Llavors la doble hèlix no pot fer el mateix gir, ha de canviar l’angle de twist. Sabem que aproximadament el nombre de parells de bases per volta del DNA és de 10. Quan hi afegim aquest agent, aquest nombre augmenta fins a 13: el DNA s’ha desenrotllat. Aproximadament es desenrotllen 26º per cada molècula de bromur d’etidi intercalada.
En total, a més, la longitud de la doble hèlix augmenta. Per demostrar-ho, es va fer un experiment en el qual es tenia el DNA enrotllat al voltant d’un complex proteic: experimentalment es va demostrar que a més concentració de EtBr més llarga era la llaçada. La corba de la gràfica que relaciona la llargada del loop en nanòmetres i la concentració de bromur d’etidi augmenta fins arribar a un màxim: aquest punt és la concentració de bromur d’etidi a partir de la qual la longitud del DNA no augmentarà més perquè la molècula estarà saturada. En aquestes condicions de saturació, la longitud del DNA ha augmentat un 50%.
Això equival a que per cada dos parells de bases hi ha una molècula de bromur d’etidi.
La imatge b ens mostra un DNA de 13 bases i 6 molècules de EtBr, que són aproximadament 1 molècules de EtBr/parell de bases com ja hem dit. Això té repercussions en el DNA. El twist és el nombre de parells de bases multiplicat pel nombre de parells de bases per volta d’hèlix. La T baixarà perquè el denominador augmentarà: passarem de tenir 10 pbs/volta a 13 pbs/volta, si considerem el DNA de W i C. Com que L es manté constant, W ha de pujar. Per tant, en presència de EtBr un DNA circular covalentment tancat li estem donant un nombre extra de voltes superhelicoïdals. El DNA de l’experiment del qual hem parlat ha d’estar nicat, perquè si haguessim posat EtBr hagués adquirit tant superenrotllament que no haguessim vist les llaçades.
Com van demostrar que l’addició d’agents intercalants augmentava el grau de superenrotllament de les molècules? Ho van fer a través de determinar la velocitat de sedimentació en un gradient preformat de sacarosa.
Els gradients preformats de sacarosa, com el seu nom indica, s’han de fer abans de dur a terme l’experiment.
Als tubs de centrífuga es posa al tub un gradient de sacarosa, que va de menys a més concentració a mesura que ens apropem al fons del tub (del 5 al 20%). La mostra de DNA és col·locada a dalt de tot. En el nostre cas, és una mostra de DNA circular. Després es posarà el tub en un rotor subjectat verticalment amb una nansa de titani, dins de la màquina de centrífuga. Quan comenci a girar, els tubs es posaran horitzontals i el gradient de DNA es formarà en sentit horitzontal, seguint el gradient de sacarosa. Quan es pari la centrífuga els tubs tornaran a posició vertical.
Per entendre què li ha passat al DNA, imaginem-nos una corba parabòlica amb un mínim al centre, els eixos de la qual representen la velocitat de sedimentació i la concentració de bromur d’etidi. Partim de DNA circular natural, que té un dèficit de linking number (és negatiu). Si la tensió es produeix en forma de superenrotllament (és a dir que recau sobre W) i aquest es dóna cap a la dreta vol dir que té un valor de W<0. En afegir EtBr el grau de superenrotllament augmenta, i amb ell el valor de W, que s’apropa a 0. Passem per un mínim (W=0), que correspon al DNA circular sense superenrotllament. Després entrem a la regió de W>0, amb superenrotllament però cap a l’esquerra. Tenim les mateixes superhèlixs que en la banda esquerra però trenades al revés. Com més compacte és el DNA (i, per tant, com més superenrotllament té) més alta és la velocitat de sedimentació. El gradient de sacarosa ens permeten demostrar el rol de la concentració de bromur d’etidi sobre la superhelicoïdalitat.
Per discriminar entre topoisòmers va millor l’electroforesi, doncs transforma els canvis de W en canvis en la velocitat de migració. En l’experiment, es va partir de DNA circular covalentment tancat del fag M13. Aquest va ser tractat amb topoisomerasa I, de manera que se li va tallar una cadena i el DNA va passar a estar “relaxat”.
Després del tractament es posa la mostra en electroforesi. S’esperava obtenir una banda que corria poc, doncs el DNA era relaxat, però en comptes d’això es va trobar una banda a l’alçada del DNA relaxat control i un seguit de bandes més fines a sota seu. Es va repetir l’experiment, però aquest cop amb DNAasa I i després amb lligasa per tancar covalentment el DNA, però van obtenir pràcticament el mateix.
Trobem una banda principal que correspon que respecte la forma nativa no té increment de L. A part d’aquesta, apareixen altres bandes que corresponen a formes amb una migració més ràpida perquè no estan del tot relaxades, estan superenrotllades. Tenim una segona banda que pot ser increment de L positiu o negatiu (∆L=±1), perquè en hidrodinàmicament és el mateix estar superenrotllat cap a la dreta o cap a l’esquerra. La tercera banda que ens trobem té un ∆L=±2, i així successivament. L’increment de twist (∆T) en totes les bandes és 0; tota la tensió estructural recau sobre W. Com discriminem, de cadascuna de les bandes, quins topoisòmers són positius i quins negatius? Si ara fem una electroforesi en presència d’agents intercalants (nova electroforesi amb la mateixa mostra, però al gel a més hi posem EtBr). Sabem que en presència d’agents intercalants, ∆W del DNA >0, però no sé el seu valor exacte. Com més alta sigui la concentració de EtBr més gran serà ∆W. La nova electroforesi ens dóna 5 bandes en lloc de tres. Ara la banda 0 té com a ∆W el valor que tenia inicialment i l’increment que ha guanyat, que és la incògnita (x). Fem el mateix amb la resta de bandes, tal i com indica el dibuix.
Si fessim una densitometria del gel, podriem calcular l’energia per a cada mol de superhèlix. Les corbes que n’obtenim són distribucions de Boltzmann, i sabem que per cada volta de superhèlix hem d’aportar 4 kcal.
Els nombres W i T poden ser nombres fraccionaris; L només pot prendre valors enters.
...