BM (11-3-15) Mètode d'anàlisi experimental de la topologia del DNA (2015)
Apunte CatalánUniversidad | Universidad Autónoma de Barcelona (UAB) |
Grado | Bioquímica - 2º curso |
Asignatura | Biologia Molecular |
Año del apunte | 2015 |
Páginas | 3 |
Fecha de subida | 14/03/2015 |
Descargas | 8 |
Vista previa del texto
→Mètode d’anàlisi experimental de la topologia del DNA.
En aquesta imatge tenim el resultat d’una electroforesi en la qual s’analitzaven
diferents topoisòmers de DNA. En el carril de l’esquerra tenim el DNA lineal.
Respecte aquest, al carril contigu, tenim l’extrem oposat: el DNA circular amb
un alt grau de superenrotllament. Al carril de l’extrem dret tenim DNA circular
relaxat, és a dir, nicat. Aquest presenta un seguit de bandes que tenen una
distància comparable entre elles. El DNA lineal migra a poc a poc respecte el
DNA superenrotllat, però no és així respecte el DNA nicat.
DNA QUE CORRE MOLT → supercoiled
DNA QUE CORRE POC → nicat
Les bandes corresponen a diferents topoisòmers. Totes elles difereixen en un increment unitari de L. Per què
hi ha aquesta discriminació en la velocitat de migració de les molècules en el gel? Hidrodinàmicament la
forma de la molècula influeix en la velocitat de migració. Per tant els topoisòmers que migrin més seran els
que tenen un W més gran, perquè tindran una forma més compacta. Recordem la fórmula de L=W+T. Si
canviem L, forçosament W o T han de canviar. Si canviés el twist no podriem apreciar diferències
electroforètiques, doncs tots els DNA tindrien la mateixa forma. Per tant tota la tensió estructural cau sobre
W.
Una altra tècninca que ens ha ajudat a analitzar experimentalment la topologia del DNA és l’ús d’agents
intercalants. La substància més utilitzada és el bromur d’etidi (EtBr), però se n’utilitza una gran varietat. El
mecanisme de funcionament dels agents intercalants és que s’intercalen, com el seu nom indica, entre els
parells de bases, i n’augmenta la fluorescència. Això ens permet, per exemple, apreciar en un gel electroforètic
les bandes si l’irradiem amb raigs UV. Un altre agent intercalant molt utilitzat és la cloroquina.
En analitzar la mescla de dos dinucleòtids complementaris en presència de
bromur d’etidi per cristal·lografia de raigs X, i es va obtenir una imatge en la
qual s’apreciava clarament que les molècules de l’agent estaven posades
paral·lelament entre les bases: intercalades. Això és possible perquè la
molècula de bromur d’etidi té una part plana formada per tres anells
aromàtics heterocíclics. Té un fenil unit per un enllaç senzill que no forma
part del bloc, i es posa fora del pla a 90º respecte aquest. No afecta a les
parelles de bases perquè no arriba a xocar amb elles.
Quan posem el bromur d’etidi entre les bases, s’omple l’espai buit que hi
ha entre aquestes. Llavors la doble hèlix no pot fer el mateix gir, ha de
canviar l’angle de twist. Sabem que aproximadament el nombre de parells
de bases per volta del DNA és de 10. Quan hi afegim aquest agent, aquest
nombre augmenta fins a 13: el DNA s’ha desenrotllat. Aproximadament
es desenrotllen 26º per cada molècula de bromur d’etidi intercalada.
En total, a més, la longitud de la doble hèlix augmenta. Per demostrar-ho, es va fer un experiment en el qual
es tenia el DNA enrotllat al voltant d’un complex proteic: experimentalment es va demostrar que a més
concentració de EtBr més llarga era la llaçada. La corba de la gràfica que relaciona la llargada del loop en
nanòmetres i la concentració de bromur d’etidi augmenta fins arribar a un màxim: aquest punt és la
concentració de bromur d’etidi a partir de la qual la longitud del DNA no augmentarà més perquè la
molècula estarà saturada. En aquestes condicions de saturació, la longitud del DNA ha augmentat un 50%.
Això equival a que per cada dos parells de bases hi ha una molècula de bromur d’etidi.
La imatge b ens mostra un DNA de 13 bases i 6 molècules de EtBr, que són
aproximadament 1 molècules de EtBr/parell de bases com ja hem dit. Això té
repercussions en el DNA. El twist és el nombre de parells de bases multiplicat pel
nombre de parells de bases per volta d’hèlix. La T baixarà perquè el denominador
augmentarà: passarem de tenir 10 pbs/volta a 13 pbs/volta, si considerem el DNA
de W i C. Com que L es manté constant, W ha de pujar. Per tant, en presència de
EtBr un DNA circular covalentment tancat li estem donant un nombre extra de
voltes superhelicoïdals. El DNA de l’experiment del qual hem parlat ha d’estar nicat,
perquè si haguessim posat EtBr hagués adquirit tant superenrotllament que no
haguessim vist les llaçades.
Com van demostrar que l’addició d’agents intercalants augmentava el grau de superenrotllament de les
molècules? Ho van fer a través de determinar la velocitat de sedimentació en un gradient preformat de
sacarosa.
Els gradients preformats de sacarosa, com el seu nom indica, s’han de fer abans de dur a terme l’experiment.
Als tubs de centrífuga es posa al tub un gradient de sacarosa, que va de menys a més concentració a mesura
que ens apropem al fons del tub (del 5 al 20%). La mostra de DNA és col·locada a dalt de tot. En el nostre cas,
és una mostra de DNA circular. Després es posarà el tub en un rotor subjectat verticalment amb una nansa de
titani, dins de la màquina de centrífuga. Quan comenci a girar, els tubs es posaran horitzontals i el gradient de
DNA es formarà en sentit horitzontal, seguint el gradient de sacarosa. Quan es pari la centrífuga els tubs
tornaran a posició vertical.
Per entendre què li ha passat al DNA,
imaginem-nos una corba parabòlica amb un
mínim al centre, els eixos de la qual
representen la velocitat de sedimentació i la
concentració de bromur d’etidi. Partim de
DNA circular natural, que té un dèficit de
linking number (és negatiu). Si la tensió es
produeix en forma de superenrotllament (és a
dir que recau sobre W) i aquest es dóna cap a
la dreta vol dir que té un valor de W<0. En
afegir EtBr el grau de superenrotllament
augmenta, i amb ell el valor de W, que
s’apropa a 0. Passem per un mínim (W=0), que correspon al DNA circular sense superenrotllament. Després
entrem a la regió de W>0, amb superenrotllament però cap a l’esquerra. Tenim les mateixes superhèlixs que
en la banda esquerra però trenades al revés. Com més compacte és el DNA (i, per tant, com més
superenrotllament té) més alta és la velocitat de sedimentació. El gradient de sacarosa ens permeten
demostrar el rol de la concentració de bromur d’etidi sobre la superhelicoïdalitat.
Per discriminar entre topoisòmers va millor l’electroforesi, doncs transforma els canvis de W en canvis en
la velocitat de migració. En l’experiment, es va partir de DNA circular covalentment tancat del fag M13. Aquest
va ser tractat amb topoisomerasa I, de manera que se li va tallar una cadena i el DNA va passar a estar “relaxat”.
Després del tractament es posa la mostra en electroforesi. S’esperava obtenir una banda que corria poc, doncs
el DNA era relaxat, però en comptes d’això es va trobar una banda a l’alçada del DNA relaxat control i un seguit
de bandes més fines a sota seu. Es va repetir l’experiment, però aquest cop amb DNAasa I i després amb lligasa
per tancar covalentment el DNA, però van obtenir pràcticament el mateix.
Trobem una banda principal que correspon que respecte la forma nativa no té increment de L. A part
d’aquesta, apareixen altres bandes que corresponen a formes amb una migració més ràpida perquè no estan
del tot relaxades, estan superenrotllades. Tenim una segona banda que pot ser increment de L positiu o
negatiu (∆L=±1), perquè en hidrodinàmicament és el mateix estar superenrotllat cap a la dreta o cap a
l’esquerra. La tercera banda que ens trobem té un ∆L=±2, i així successivament. L’increment de twist (∆T) en
totes les bandes és 0; tota la tensió estructural recau sobre W. Com discriminem, de cadascuna de les
bandes, quins topoisòmers són positius i quins negatius?
Si ara fem una electroforesi en presència
d’agents intercalants (nova electroforesi
amb la mateixa mostra, però al gel a més
hi posem EtBr). Sabem que en presència
d’agents intercalants, ∆W del DNA >0,
però no sé el seu valor exacte. Com més
alta sigui la concentració de EtBr més
gran serà ∆W. La nova electroforesi ens
dóna 5 bandes en lloc de tres. Ara la
banda 0 té com a ∆W el valor que tenia
inicialment i l’increment que ha
guanyat, que és la incògnita (x). Fem el
mateix amb la resta de bandes, tal i com
indica el dibuix.
Si fessim una densitometria del gel, podriem calcular l’energia per a cada mol de superhèlix. Les corbes que
n’obtenim són distribucions de Boltzmann, i sabem que per cada volta de superhèlix hem d’aportar 4 kcal.
Els nombres W i T poden ser nombres fraccionaris; L només pot prendre valors enters.
...