Apunts. Temari complert (2009)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Ciencias Ambientales - 1º curso
Asignatura Fisio. vegetal
Año del apunte 2009
Páginas 23
Fecha de subida 25/05/2014
Descargas 4

Vista previa del texto

Aleix puig Morillo Primer de CCAA 29-5-2006 Practiques de Fisiología Vegetal Tècniques experimentals de Biologia II (Fisiologia Vegetal) Practica 1: Determinació del potencial hidric en els vegetals // Practica // Fonament: El terme potencial hídric (Ψ) s’utilitza per expressar les relacions hídriques de les plantes i els seus components determinen l’estat termodinàmic de l’aigua continguda en el seu interior. Es distingeixen tres components de Ψ que corresponen a: potencial de pressió (Ψp), potencial osmòtic (Ψπ) i potencial matricial (Ψm). El potencial hídric Ψ és la suma dels tres potencials (Ψp + Ψπ + Ψm). En el cas de els vegetals, el valor de Ψ és, generalment, negatiu.
El gradient de potencial en el sistema sòl-planta-atmosfera determina els moviments d’aigua de la planta. L’aigua tendirà a moure’s espontàniament de zones de major a zones de menor Ψ; per aquest motiu, quan submergim una mostra de teixit vegetal en un solució (en aquest cas de sacarosa) que té un Ψ més negatiu que les cèl·lules del teixit, aquest teixit perdrà aigua i, per tant, pes. En canvi si la solució externa presenta un major Ψ que la mostra de teixit, aquest guanyarà pes. La concentració de sacarosa en la qual la mostra no experimenti cap variació de pes indicarà que el teixit és troba en equilibri amb el medi que l’envolta (∆Ψ=0), en aquest estat Ψteixit=Ψsolució, per tant el Ψ de la solució corresponent subministra el valor de Ψ al teixit. Sabent que el potencial osmòtic d’una solució (Ψπ) és igual a a-π, i que π es la pressió osmòtica de la solució, la qual té el valor π= R·T·Ci es possible trobar el valor del potencial hídric del teixit.
Objectiu: Determinar el potencial hídric (Ψ) de un teixit vegetal (tubercle de patata), establint-lo gravimétricament, es a dir, mitjançant les variacions de pes que experimenten las mostres front a diferents potencials osmótics externs.
Material: Un tubercle de patata.
Portaobjectes.
“Sacabocados” de 1 cm de diàmetre.
Paper mil·límetrat.
6 tubs d’assaig de 25 ml.
- Paper de filtre.
- Pipetes de 10 ml.
- Bisturí.
- Balança.
- Solució de sacarosa 1M.
Mètode: - Preparar 6 tubs d’assaig de 25 ml i marcar-los, senyalant les concentracions de sacarosa que si introduiran.
- A partir d’una solució de sacarosa 1M, preparar 20 ml de las següents concentracions: 0.10,0.20,0.30,0.40, 0.50. i 0.60 M - Escollir un tubercle de patata i, utilitzant un “sacabocados” de un 1 cm de diàmetre, extraure un cilindre. Disposar-lo sobre un portaobjectes.
- Col·locar paper mi·límetrat sota del portaobjectes i tallar el cilindre transversalment para obtenir un cilindre de 4 cm de longitud.
- Tallar el cilindre de 4 cm en secciones transversals de 2 mm, rentar-les amb aigua destil·lada, assecar l’aigua destil·lada, pesar-les, i submergir-les en una de las soluciones de sacarosa. Anotar el moment de la immersió i deixar-les en aquestes condiciones 90 minuts.
- Repetir la seqüència anterior per cada una de las restants soluciones de sacarosa, utilitzant un cilindre per cada una de elles.
- Passat el temps assenyalat, i seguint el mateix ordre inicial, extraure les mostres de cada solució, rentar-les, assecar-les i pesar-les de nou. Procurar que el tractament de rentat i assecat sigui similar en totes las mostres per evitar errors de pesada.
1 Aleix puig Morillo Primer de CCAA 29-5-2006 Practiques de Fisiología Vegetal Notes - El Ψ i Ψπ s’expressen mitjançant unitats de pressió. La unitat de pressió actualment adoptada por el Sistema Internacional (S.I.) modificada es el Pascal (Pa), establint la següent relació amb altres unitats (atmosferes -atm-), utilitzades anteriorment: 1 atm = 1.01325 x105Pa. No obstant, en el nostra caso resulta mes manejable utilitzar un múltiple d’aquesta unitat, el MPa (1MPa=106Pa).
- Al utilitzar la equació n = RTQ, hem de considerar que: C¡ es la concentració de solut.
T = Ta absoluta ambiental (considerar 20°C).
R = 8.20568 x 10° atm m3 mol-1 K-1 ó R = 0.83 x 10-2 MPa L mol-1ªK -1 Càlculs: a) Omplir la taula en la que figuren, por una banda les concentracions de sacarosa utilitzades y, per l’altre, els resultats obtinguts amb las diferents mostres i referits a: - Pes inicial (Pi).
- Peso final (Pf).
- Diferencia de Pesos (Pf-Pi).
- Variació percentual de pes (Pf-Pi/Pi ·100).
Concentració de Sacarosa (ML-1) 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 0,60 Ψ (MPa) Pi (mg) Pf (mg) Pf-Pi ∆P (%) 0,24319 0,48638 0,72957 0,97273 1,21595 1,45914 4827 4002 4080 4691 4501 4607 5307 3996 4001 4399 3903 3697 480 -6 - 69 - 292 - 598 - 910 9.94 - 0,15 - 1,7 - 6,225 - 13,28 - 19,75 b) Calcular el ψπ de las soluciones; expressar els resultats en Megapascals (MPa). Representar gràficament les variacions de pes (%) para cada mostra de teixit respect al potencial osmotic de las soluciones corresponents.
Ψπ = -R·T·Ci Ψπ Ψπ Ψπ Ψπ Ψπ Ψπ dissolució dissolució dissolució dissolució dissolució dissolució 0,1 M: -0,0083 MPa·L/(mols· ºK) · 293,15 ºK · 0,1 mols/L = -0,243 0,2 M: -0,0083 MPa·L/(mols· ºK) · 293,15 ºK · 0,2 mols/L = -0,486 0,3 M: -0,0083 MPa·L/(mols· ºK) · 293,15 ºK · 0,3 mols/L = -0,730 0,4 M: -0,0083 MPa·L/(mols· ºK) · 293,15 ºK · 0,4 mols/L = -0,973 0,5 M: -0,0083 MPa·L/(mols· ºK) · 293,15 ºK · 0,5 mols/L = -1,216 0,6 M: -0,0083 MPa·L/(mols· ºK) · 293,15 ºK · 0,6 mols/L = -1,459 2 Aleix puig Morillo Primer de CCAA 29-5-2006 Practiques de Fisiología Vegetal Potencial hidric (MPa) Representació grafica de les variacions del pes (%) -2 -1,5 -1 -0,5 15 10 5 0 -5 0 -10 -15 -20 -25 y = 22,6x + 14,043 2 R = 0,9699 Serie1 Lineal (Serie1) Increment de pes (%) c) Determinar el estat d’equilibri osmòtic i calcular el ψ del teixit i el ψπ de la solució corresponent. Comentar detalladament el gràfic, explicant els diferents estats osmotics de las cèl·lules front a las diferents condicions osmòtiques del entorn.
% ∆P = 22,6· Ψπ + 14,043 Estat d’equilibri → %∆P = 0 → Ψπ = Ψteixit = - 14,043 / 22,6 = -0,6213 MPa Comentari // En el gràfic és representa l’increment del pes que han patit els teixits de la patata en funció del potencial osmòtic (sempre depenen del medi en que es trobaven i la concentració de sacarosa, que aquest contenia. El primer que podem observar és que com més diluïda era la dissolució (com les dos primeres) aquesta tenia un major potencial que els teixits de la patata, per aquest motiu l’aigua porta a terme un procés osmòtic per equilibrar les concentracions. En resum l’aigua penetra a l’interior dels teixits i per aquest motiu es produeix un increment del pes de caire positiu. Per altre banda com més concentració de sacarosa hi ha en el medi, la dissolució tindrà menys potencial osmòtic que els teixits del tubercle, i per tant la cèl·lula perdrà aigua del seu interior per tal d’arribar a l’equilibri amb el medi, aquest fet donarà lloc a un increment de pes de caire negatiu. En conclusió, com més concentrat sigui el medi més gran és l’increment de pes que pateix el teixit de patata.
A partir de l’equació de la recta de regressió obtinguda en el gràfic, hem pogut calcular l’estat d’equilibri entre el potencial del medi i el potencial del teixit, es a dir que els dos potencials siguin iguals i les concentracions s’igualin. Per tant en aquest punt no és produiria cap intercanvi osmòtic d’aigua a través de les membranes cel·lulars en un únic sentit, sinó que es produeix en els dos sense que el pes del teixit vari. En el meu cas aquest fet es produeix en un potencial osmòtic de la dissolució de sacarosa de -0,6213 MPa, per tant teòricament el potencial hídric del tubercle de patata hauria de ser també -0,6213 MPa.
3 Aleix puig Morillo Primer de CCAA 29-5-2006 Practiques de Fisiología Vegetal Practica II: Estudi qualitatiu i quantitatiu de pigments liposolubles // Teoria // Cromatografia: la tècnica de la cromatografia permet separar i identificar substàncies amb propietats físiques i químiques semblants. Les substàncies a separar s’introdueixen a l’interior d’un sistema compost per una fase mòbil i una fase estacionaria. Les molècules es separen en funció de les diferencies entre les dues fases, és a dir, per afinitat dels substrats. Existeixen diversos tipos de cromatografies: 1.-Cromatografia de distribució: les dues fases és troben en contacte i en una de les dues o en les dos afegim la substància que volem estudiar. A aquesta substància és distribuiran en concentracions diferent entre les dues fases. S’utilitza principalment per molècules de baix pes molecular. Distingim dos tipus de cromatografia de distribució: - En paper.
De capa fina Totes dues tenen un fase estacionaria formada per un líquid contingut en un sòlid ( matriu). Com més llarga sigui la fase estacionaria, més bona serà la resolució de la nostra cromatografia. També es important triar una fase estacionaria adequada depèn de si volem separar substàncies no polars (dissolvents hidròfobs com el benzè) o si volem separar substàncies polars (dissolvents hidròfils com els alcohols).
- Cromatografia de distribució en paper: s’utilitza un full de cel·lulosa. No és molt emparada en els laboratoris. La fase mòbil tant pot ser ascendent com descendent.
Cromatografia de distribució de capa fina: en aquest cas s’empara solvent uniforme sobre vidre o plàstic. La fase mòbil només pot experimentar moviment ascendent. La distancia entre el solut i el front del solvent depèn de les característiques concretes de cada substància. Aquest tipus de cromatografia i és mes resolutiva que en paper per: o Té més velocitat de separació.
o Pots utilitzar diversos soldis com a fase estacionaria.
o Separacions més evidents i en quantitats més petites.
Usos: s’utilitza principalment per cromatografiar aminoàcids, sucres, polisacàrids, lípids, esterols i molècules petites.
4 Aleix puig Morillo Primer de CCAA 29-5-2006 Practiques de Fisiología Vegetal 2.-Cromatografia en gel: separa les substàncies pel seu tamany molecular. S’utilitza una columna plena d’una substància inerta i de carrega neutre constituïda de partícules molt petites que formen una xarxa porosa Les substàncies més grans precipiten abans ja que no perden temps introduint dins dels porus (ja que no hi caben), mentre que les substàncies més petites precipiten més tard ja que s’introdueixen dins la xarxa porosa. L’interval de filtració depèn del tipus de gel. Els gels més utilitzats són: o o o - Dextrá: polisacàrid de sobres de glucosa.
Agarossa: polimer lineal de la D-galactossa.
Gel de poliacrilamida.
Cromatografia en gel de capa fina: similar a l’anterior, l’única diferencia és que la fase estacionaria és un líquid. El moviment de la fase mòbil es únic i descendent.
Usos: s’utilitza principalment per cromatografiar proteïnes, peptids, àcids nucleids, nucleotids i substàncies hidròfiles de gran tamany.
3.-Cromatografia d’adsorció: utilitza un líquid per la fase mòbil, mentre que la fase estacionaria és un sòlid. Es pot duu a terme en forma de columna o de capa fina (és basa en que la superfície fina té molts punts d’unió). La quantitat de molècules unides depèn de la concentració.
Materials Alumina Gel de silici Carbó activat Gel de fosfat càlcic Hidroxiapatit - Substàncies separades Molècules orgàniques petites i proteïnes Esterols i aminoàcids Péptids, aminoàcids i glúcids Proteïnes i polinucleòtids Àcids nucleics HPLC: Les dues fases, l’estacionaria i la mòbil, són líquids s’utilitza per cromatografia substàncies no volàtils. Separen les substàncies però no permet la seva identificació. Per aquest motiu desprès del procés s’utilitzen sistemes com l’espectroscòpia de masses per identificar les substàncies.
5 Aleix puig Morillo Primer de CCAA 29-5-2006 Practiques de Fisiología Vegetal - Cartografia de gasos: La fase mòbil d’aquesta cromatografia és un gas i la fase estacionaria és un líquid dins un solut gasos. S’utilitza per mostres volàtils o volatilitzades barrejades amb gasos com l’heli, l’argó i el nitrogen i escalfades. Com més llarga sigui la columna per la qual és desplaça el gas hi ha un millor separació de components (hi ha columnes de fins a 2km). Al final de la columna hi ha diversos sensors que detecten les propietats de les substàncies.
Usos: separa alcohols, esters, àcids grassos i aminas. Molt útil pel l’estudi de pesticides i enzims.
6 Aleix puig Morillo Primer de CCAA 29-5-2006 Practiques de Fisiología Vegetal 4.-Cromatografia d’intercanvi d’ions: Variant de l’absorció. La fase estacionaria és solida i esta carregada i amb presencia de grups enllaçats. Les substàncies s’uneixen de forma reversible i els enllaços depenen del pH i la força iònica. Per trencar els enllaços reversibles produïts només cal variar aquestes condicions (ph i força iònica).
Usos: Molècules petites orgàniques, ions metàl·lics.
Material: Cel·lulosa, desxtrá, poliacrilamida.
Practica // Fonament: La extracció de clorofil·les i carotenoides a partir de una mostra vegetal se basa en la seva liposolubilitat, utilitzant dissolvents orgànics. La quantificació de les clorofil·les i carotenoides es realitza per espectrofotometria i d’acord amb els seus espectres d’absorció. La determinació de las clorofil·les a i b en el extracte vegetal es realitza per el mètode de Lichtenthaler depenent dels valors de absorció obtinguts en els seus respectius màxims d’absorció, amb l’addició d’uns factors que corregeixin el solapament dels espectres d’absorció dels diferents pigments presents en el extracte.
De manera similar es determinen els carotenoides totals.
Objectiu: Quantificació de les clorofil·les a i b i dels carotenoides totals a partir de un extracto vegetal fresc. Separació cromatogràfica de las clorofil·les i els carotenoides.
Material: 1g de vegetal fresc.
Tisores.
Morter Terra rentada.
Paper de filtre.
Acetona 80% - Embut de vidre.
- Tub aforat de 10ml - 1 tub d’assaigs de vidre (16 x 100) - Pipetes (2x1 ml, 2x2ml, 2x5ml i 1x10ml).
- Cubetes colorímetre.
Mètode: Obtenció de l’extracte.
- Pesar 1 g de fulles d’espinacs (Spinacea olerace L.) lliures de pecíol i de nervis principals, tallar-les en trossos petits i introduir-los al morter. Tritura fins a l’homogenització.
- Afegir al triturat 4ml d’acetona 80% i triturar fins obtenir una correcte homegenització. Deixar reposar 10 min a 4ºC.
- Preparar un filtre circular de paper, col·locar-lo a l’embut i humitejar-lo amb acetona 80%. Siturar l’embut sobre el tub aforat.
- Decantar el líquid del morter al embut, afegir 1ml d’acetona 80% al morter i tornar a barrejar.
Rentar les parets del morter amb 1ml d’acetona 80% i abocar-ho sobre l’embut. Deixar que és filtri tota la mostra del embut afegint entre 1 o 2ml d’acetona 80% a sobre. Anivellar la mostra filtrada amb acetona 80% fins arribar a 8 0 10ml.
7 Aleix puig Morillo Primer de CCAA 29-5-2006 Practiques de Fisiología Vegetal Determinació quantitativa de les clorofil·les a i b i dels carotenoides totals - Agafar l’extracte inicial i dissoldre amb acetona 80% (deu cops) per passar a la lectura espectrofotométrica . Anotar els valors d’absorció del extracte a 660,645 i 470nm.
- Realitzar els càlculs de clorofil·les i carotenoides totals. Aplicar la formula de lichtenthaler et col, resultat de la qual s’expressa amb mg/l: Cla= (12,12 · A660) – (2,81 · A645) Clb= (20,13 · A645) – (5,03 · A660) Car.tot= (1000 · A470) – (3,27 · Cla) – (104,4 · Clb) 229 - En el cas de que s’hagin diluït els pigments prèviament a la seva lectura, s’ha de multiplicar els valors anteriors per el factor de dissolució utilitzat.
- Per obtenir el contingut de pigments del material, espresat en mg/g pes fres, aplicar la seguent formula de factors de conversió: mg pigment = mg pigment · Volum d’extracte (ml) ·10-3 g pes fresc L solució Pes frec (g) Resultats: - Determinar el contingut de clorofil·les a i b i de carotenoides totals. Calcular la relació de CLa/Clb.
Pes de la mostra (g) 1 mg/l 79,7 Comentari Cla Mg/g P.F 0,39455 A660 0,734nm mg/l 34,1387 Clb A645 0,353nm mg/g P.F 0,169003 Cla/Clb 2,3346 A470 0,785nm Carotenoides mg/l Mg/g P.F 15,5777 0,08782 // En aquesta practica no hi ha res rellevant a comentar. Simplement hem aprofitat la liposolubilitat de la mostra vegetal per poder calcular l’absorbància a diferents longitud d’ona i poder aplicar la formula matemàtica de Lichtenthaler per trobar la quantitat de clrofil·las a i b i de carotenoides present en la nostra mostra.
Practica III: Estudi de la reacció de Hill en cloroplasts aillats i la seva inhibició per DCMU // Teoria // Espectrofotometria: la espectrofotometria és la mesura del espectre de llum. La llum es considerada com un ona o com una partícula. L’ona crea un camp elèctric integrat perpendicular entre si amb oscil·lacions sinusoïdals i propagació en l’espai. La distancia entre els màximes sinusoïdals s’anomena longitud d’ona.
8 Aleix puig Morillo Primer de CCAA 29-5-2006 Practiques de Fisiología Vegetal Les ones poden interaccionar amb les partícules, aquestes interaccions dependran de l’energia. La llum té un ample ventall de longituds d’ona que va desde 1 a 106nm i el mètode per estudiar-los també és diferent.
Nosaltres treballarem amb l’espectre de llum visible i el mètode d’estudi d’espectroscopia d’absorció normal. Quan una ona entre en contacte amb una partícula és podem produir tres fets: - Dispersió: és canvia la direcció de la ona.
Absorció: l’ona transmet la seva energia a la particula.
No interacció.
L’energia associada a l’ona prové de E= hv/λ. Quan és produeix l’absorció l’energia aportada per l’ona provoca la transició entre diferents nivells electrònics. L’energia transmesa és l’energia necessària per moure un electró d’òrbita. Aquestes energia és sol convertir en calor hi algunes provoquen fluorescència. La probabilitat de és produeixin interaccions entre un foto i una partícula, ve determinada per la fórmula: I=I0 10-Edc.
I= intensitat que través la mostra.
E= coeficient d’extensió molar.
c= concentració.
I= intensitat de llum incident.
d= distancia que recorre la llum dins la mostra (gruix).
Quant d=1cm, s’anomena densitat òptica que és igual a EC. Partint de certes dades podem crear un espectre d’absorció, ja que cada substància absorbeix unes determinades longituds d’ona i per tant cada partícula té el seu espectre d’absorció. Per mesurar l’absorció utilitzem un espectrofotòmetre, que analitza l’absorció de la llum per part de mostres liquides.
Usos: s’utilitza principalment per la determinació de concentracions i per quantificar reaccions químiques.
9 Aleix puig Morillo Primer de CCAA 29-5-2006 Practiques de Fisiología Vegetal Tipus de espectroscòpia de llum.
1.-Infraroigs: utilitza la llum infraroja. Mesura la freqüència de vibració i les transicions de nivells electrònics de les partícules que es deformen i vibren a causa de la irradiació. No és poden utilitzar solucions aquoses, ja que aquesta absorbeix fàcilment la llum infraroja.
2.-RAMAN: utilitza llum infraroja. Mesura la dispersió per alteració de la freqüència de moviment i vibració.
3.-Feix de llum Polaritzada: S’eliminen els plans de moviment de la molècula excepte un, aquests son capaços de rotar en el pla. La llum només treballa en un sol pla i mitjançant ser patrons s’identificarà la substància. Hi ha substàncies (sucres per exemple) que s’han de situar en un cert angle, ja que sinó absorbeixen tota la radiació.
4.-Fluorescència: Necessita molta poca quantitat de mostra per analitzar. S’utilitza principalment per determinar concentracions i fer anàlisis.
5.-Ultraviolada: utilitza llum UV. S’obté la conformació. Els llocs d’unió la distancia intermolecular, es a dir informació estructural sobre la mostra. Utilitza recipients de quars.
6.-RMN (ressonància magnètica nuclear): el nucli esta constituir per protons amb carrega, massa i moment angular. Es genera un camp magnètic, la molecular s’orienta cap al camp contrari al seu ( 0º o 180º). L’absorció de microones fan variar el pla i les fan entrar en ressonància. Es a dir varia el spin dels protons del nucli. S’utilitza per obtenir informació sobre l’estructura de polímers i moviments de la molècula.
7.-Visible: utilitza la part de l’espectre visible. Les mostres han de tenir color.
10 Aleix puig Morillo Primer de CCAA 29-5-2006 Practiques de Fisiología Vegetal Teoria (centrifugació): és útil per caracteritzar i separar els components d’una mescla. Es poden separa per: - Pes molecular.
Densitat.
Forma molecular.
Quan una partícula es troba sota l’influencia de la força centrifuga pateix un força sobre si mateix(si la partícula no esta en el vuit o dissolt produeix oposició, força de fregament) que deriva de: Força de sedimentació sobre una partícula F = Massa x camp centrífug ó F = mw2r On w= velocitat angular del rotor (radians/sec) r = radi (distància de la partícula a l’eix de rotació.
Força centrífuga relativa (RCF) RCF = 1.119 x 10-5 x (rpm)2 x r RCF Es refereix com a n x g, on g és l’acceleració de la gravetat a la superfície terrestre.
Forces que interaccionen amb la centrifugació (s’hi oposen) 1. Força de flotació (Llei d’Arquímedes) mw2rvp on: v = volum parcial específic (volum desplaçat per 1g de partícules en sedimentació) p = densitat de la solució.
La força resultant és F = mw2r(1-vp) 2.Resistència friccional (deguda al moviment en el fluid).
F = f.v on: f = coeficient de fregament v = velocitat de la partícula 3.Difusió El balanç resultant és un equilibri entre les anteriors forces.
La velocitat de sedimentació d’una partícula en una solució es proporcional a la velocitat del gir i al radi de gir i inversament proporcional al volum. Per tant la velocitat de sedimentació és proporcional a la densitat de la partícula i inversament proporcional a la viscositat.
Coeficient de sedimentació (S)= m(1-vp) F Tipus de centrifugadores - - Ultra centifugadores: molt especialitzades arriben a velocitats de 40.000G.
Centrifugadores preparatives: molt simple. Poden ser d’angle fix, on sedimenten material anomenat pellet, o bé d’angle variable, centrifugadores per zones i depenent de l’angle de rotació.
Centrifugadores analítiques: similars a les preparatives, però incorpora un feix de llum que analitza el grau de sedimentació 11 Aleix puig Morillo Primer de CCAA 29-5-2006 Practiques de Fisiología Vegetal Practica // Fonament: Robert Hill observa en 1.937 que al il·luminar preparacions acel·lulars que contenien cloroplasts en presencia d’algun acceptor artificial d’electrons, es produïen despreniments d’oxigen i reducció del acceptor d’electrons segons la reacció: llum 2A +2H2O-----Æ 2AH2 + ½ O2 Aquesta es la anomenada reacció de Hill, on A = acceptor d’electrons.
En condicions naturals, els principals acceptros naturals d’electrons son la ferredoxina i el NADP, però s’inactiven durant el procés d’aïllament dels cloroplasts. Aquest acceptors naturals poden se substituïts in vitro per el DPIP compost que en solució i en estat oxidat presenta un intens color blau, amb un màxim d’absorbància a 590nm, que disminueix al se reduït el compost.
Objectiu: estudiar la reacció de Hill en una suspensió de cloroplasts (prèviament aïllats) utilitzant DPIP (2,6-diclorefenol idofenol) com acceptor artificial d’electrons. Paral·lelament es determinarà la inhibició de la fotólisis de l’aigua a nivell del fotositema II, utilitzant l’inhibidor sintètic DCMU (3(3,4-diclorofenilc)-1,1-dimetil urea), utilitzar en agricultura com herbicida (conegut comercialment com Diuron).
Material: 30g d’espinacs.
Centrífuga i 4 tubs de centrifuga de 50ml de plàstic amb taps prerefredats.
- Morter prerefredat.
Reactius: DPIP 0,2 mM.
DCMU: 0.5, 1, 2 i 3 μg/ml 21 tubs d’assaig de 10 ml ( 7 d’aquests negres).
- Sorra de quars - Espectrofotómetre - Banyat en gel - Embut Büchner, dos gasos i kitasatos.
prerefredat.
- Sacarosa 0,5 M freda.
- Tampó fosfat 0,2 M pH 6,5 fred.
12 Aleix puig Morillo Primer de CCAA 29-5-2006 Practiques de Fisiología Vegetal Mètode: Extracció de cloroplasts: - Pesar 30g de fulles d’espinacs sense pecíols ni nervis principals.
- Rentar amb aigua destil·lada i tallar a petits trossos.
- Tritura el material en un morter prerefredat, al qual s’afegirà 10ml de sacarosa 0,5M i un xic de sorra de quars abrasiu. Mantenir en condicions fredes amb un bany de gel.
- Filtrar la mostra amb un embut Büchner a través de dos gasses, afegir al morter 40ml de sacaros 0,5M fins aconseguir la recuperació total del triturat.
- Recollir el filtrat en un Kitasatos prerefredat.
- Distribuir volums igual del filtrat en dos tubs de centrifuga prerefredats, equilibrant-los posteriorment.
- Centrifugar a 1000 r.p.m durant 1 min para eliminar la sorra i trossos grans del teixit, parets cel·lulars.
- Decantar cada sobrenedant, el qual conté els cloroplasts, en cada tub de centrifuga prerefredats.
- Centrifugar a 3500 r.p.m durant 5 min, per sedimentar els cloroplasts.
- Decantar el sobrenedant i resuspendre el sediment de cada tub amb 12ml de tampó fosfat 0,2M pH 6,5 ben fred en cada tub. Reunir en un sol tub las suspensions, barrejar i guardar sota refrigeració.
Reacció de Hill. Aplicació del inhibidor: - Prepara 3 series de 7 tubs d’assaigs casa una, marcats per cada serie: Sc (sense cloroplasts), SA (sense acceptos), DCMU 0, 0.5, 1, 2 i 3 μg/ml.
- Una de las series, que estarà formada per tubs negres. Las dos series restants constitueixen un duplicar. Els tres tubs 0 representar els contrlos respectius de llum o fosxor.
- Afegir a cada un dels 21 tubs: 1ml de tampó fosfat o,2M pH 6,5 i 2ml de H2O destil·lada.
- Pipetejar 1ml de DPIP en cada un dels tubs, excepte en els 3 tubs marcats SA, a els quals s’afegiran 1ml d’aigua destil·lada.
- Aplicar el DCMU pipetejant 1ml de cada una de les quantitats en els corresponents tubs de les 3 series, EN 0, SC i SA afegir 1ml d’aigua destil·lada.
- Finalment, afegir de 0,5 a 1ml de la suspensió de cloroplasts en cada un dels tubs, excepte en els tubs SC, per tant és substituirà el volum de solució per aigua destil·lada.
- Tapar la sèrie de tubs negres i preservar de llum. Exposar las dos series restants a la llum, durant 10min.
- Mesurar l’absorbància de cada una de les solucions a 590nm. (blanc d’aigua destil·lada).
Resultats: - Anotar els resultats d’absorbància dels diferents tractaments. Utilitzar la mitjana de les dos series.
Amb llum Sense llum SC 0,843 0,765 SA 0,899 0,875 Absorbància mitjana (densitat òptica) 0 0,5 1 0,839 1,301 1,379 1,350 1,340 1,299 2 1,404 1,377 3 2,165 1,362 13 Aleix puig Morillo Primer de CCAA 29-5-2006 Practiques de Fisiología Vegetal - Representar en una mateixa gràfica els resultats obtinguts.
Absorbància mitjana en funció de la quantitat d'inhibiodor (DCMU) y = 0,3466x + 0,9836 2 R = 0,8516 Absorbància (nm) 2,5 Absorbància amb llum 2 Absorbància sense llum 1,5 Absorbància sense cloroplasts 1 Absorbància sense acceptor 0,5 Lineal (Absorbància amb llum) 0 0 1 2 3 4 Concentració (M) Comentari // Durat la fotosíntesi s’allibera oxigen per incorpora l’energia en compostos carbonatats. En presencia de llum les diferents reaccions fotosintètiques donen oxigen lliure i matèria orgànica a partir del CO2. A més a més permet transformar matèria inorgànica en matèria orgànica.
La fotosíntesi es la conversió d'energia lluminosa en energia química estable. La primera molècula en la qual queda emmagatzemada aquesta energia química es l'ATP. Posteriorment, l'ATP s'utilitza per sintetitzar altres molècules orgàniques mes estables. La fotosíntesi es possible gràcies a l’existència d'unes molècules especials, anomenades pigments fotosintètics.
Quan un foto (hv) es absorbit per un elector d'un pigment fotosintètic, aquest electró capta l'energia del foto i ascendeix a posicions mes allunyades del nucli atòmic, i pot sortir de l’àtom i deixar-lo ionitzat. El pigment que conté aquest àtom queda amb un defecte d'electrons (oxidat). La molècula que els reposarà s'anomena primer donador d'electrons.
Els electrons perduts, carregats amb l'energia del foto, passen a una molècula anomenada primer acceptor d'electrons i, després, a una sèrie d’acceptadors que es redueixen i s'oxiden successivament, quan capten i després alliberen aquests electrons. Així es forma l'anomenada cadena transportadora d'electrons. Durant aquest procés s'allibera l'energia captada que, gràcies als enzims ATP-sintetases, s'aprofita per a la síntesi d'ATP, en els enllaços del qual queda emmagatzemada.
La fotosíntesis te diverses fases: Fase lluminosa acíclica El procés s’inicia amb l'arribada de fotons al fotosistema II. Això provoca l'excitació del pigment diana, que perd tants electrons com fotons absorbits. Els electrons son captats per la feofitina i altres acceptors i finalment a la plastoquinona. Per reposar aquests electrons de la clorofil·la, es produeix la hidròlisis de molècules d'aigua, fet que s'anomena fotólisi de l'aigua.
14 Aleix puig Morillo Primer de CCAA 29-5-2006 Practiques de Fisiología Vegetal Aquest procés es duu a terme a la cara interna de la membrana dels tilacoides. Els dos electrons alliberats per cada molècula d'aigua son transferits a la molècula diana pel donador Z, i els dos protons H+ s'acumulen a l'interior del tilacoide. La plasloquinona quan rep els dos electrons, s'activa i capta dos protons de l'estroma. Després, quan transfereix els seus electrons al complex citocrom b-f introdueix els dos protons al tilacoide. Aquests. afegits als protons procedents de la fotolisi, creen una diferencia de potencial electroquímic a les dues bandes de la membrana. Amb la sortida de protons a través dels enzims ATP-sintetases, es produeix la síntesi d'ATP, que s'acumula a l'estroma. Es el que s'anomena fosforilació de l’ATP.
Quan incideixen dos fotons en el fotosistema I, la clorofil·la P700 perd dos electrons que son captats per la ferredoxina a través de l'acceptor A0. Els electrons perduts per la clorofil·la P700 son reposats per la plasiocianina, que els rep del complex citocrom b-f. La ferredoxina passa els dos electrons a l’enzim NADP+ -reductasa. que s'activa, capta dos protons de l'estroma i elstransfereix.
juntament amb dos electrons, a un ió NADP+ de l'estroma. que es redueix a NADPH + H+; es el que s'anomena fotoreducció del NADP +.
Fase lluminosa cíclica En la fase lluminosa cíclica intervé únicament el fotosistema I, on es crea un flux d'electrons que a cada volta dona lloc a síntesis d'ATP. Com que no hi intervé el fotosistema II, no hi ha fotólisi de l'aigua i, en conseqüència, no hi ha reducció del NADP+ ni es desprèn oxigen. Tan sols se s'obté ATP. La finalitat d'aquesta fase cíclica es solucionar el dèficit d'ATP obtingut en la fase acíclica per poder dur a terme la fase fosca posterior. Quan s’il·lumina amb llum de longitud d'ona superior a 680 nm, tan sols es produeix el procés cíclic.
Fase fosca En la fase fosca s'utilitza l'energia (ATP) i el NADPH obtinguts a la fase lluminosa per sintetitzar matèria orgànica a partir de substàncies inorgàniques. Com a font de carboni s'utilitza el dióxid de carboni; com a font de nitrogen s'utilitzen els nitrats i els nitrits; i com a font de sofre es fan servir els sulfats.
En aquesta practica hem utilitzat la reacció que Robert Hill observa en 1.937 que al il·luminar preparacions acel·lulars que contenien cloroplasts en presencia d’algun acceptor artificial d’electrons, es produïen despreniments d’oxigen i reducció del acceptor d’electrons segons la reacció: llum 2A +2H2O-----Æ 2AH2 + ½ O2 Aquesta es la anomenada reacció de Hill, on A = acceptor d’electrons.
En condicions naturals, els principals acceptros naturals d’electrons son la ferredoxina i el NADP, però s’inactiven durant el procés d’aïllament dels cloroplasts. Aquest acceptors naturals poden se substituïts in vitro per el DPIP compost que en solució i en estat oxidat presenta un intens color blau, amb un màxim d’absorbància a 590nm, que disminueix al se reduït el compost.
Com que el que ens interessa per la practica es simular les reaccions químiques produïdes durant la fotosíntesi a més d’afegir DPIP per substituir l’acceptor d’electrons natural inactivat, tamb é hem d’afegir aigua per que a través de la seva fotolisi s’obtingui l’energia necessària per oxidar el pigment.
2H2O Æ H + O2 + 4é.
llum 2A +2H2O-----Æ 2AH2 + ½ O2 15 Aleix puig Morillo Primer de CCAA 29-5-2006 Practiques de Fisiología Vegetal llum 2NADP+ + 2H2O --Æ 2NADPH + 2H+ + O2 llum Co2 +H2O --Æ O2 + MO Planta Els reactius que s’afegeix als tubs d’assaigs tenen diverses funcions.
DPIP: acceptor d’electrons artificial.
DCMU: inhibeix l’acceptor d’electrons, per tant bloqueja la cadena de transport d’electrons i no es produeix la fotolisi de l’aigua.
SA: absorbància dels cloroplast.
SC: Absorbància de l’acceptor En la fase lumínica com més quantitat d’inhibidor hi ha més absorbància té la mostra, ja que no es pot acabar la reacció i per tant el pigment no s’oxida i la mostra manté part del seu color. La situació ideal a de és el tub 0, ja que no hi ha presencia d’inhibidor i per tant la reacció s’assoleix de forma correcta oxidant tot el pigment. Per tant com més quantitat de DCMU hi ha en la mostra aquesta té un valor més elevat d’absorbància ja que ha pogut oxidar menys quantitat d’inhibidor.
En la fase fosca en canvi no és pot produir la reacció. Per utlim hem d’afegir que el valor d’absorció del tub SA sumat al valor del tub SC ha de ser igual a 0 Practica IV: Determinació del punt isoelèctric de proteïnes vegetals // Teoria // Mesura del pH: el pH és defineix com pH= -log [H+). Absolutament totes les reaccions bioquímiques depenen del pH. S’utilitza principalment per substàncies orgàniques compostes fàcilment ionitzables, els canvis de pH afecten: Capacitat de ressonància.
Camp elèctric.
Absorció.
Antigament s’utilitzava la neutralització mitjançats àcids i bases per determinar els valors del pH (indicador de color la fenofaleina).Una altre tècnica més avançada va ser la del paper d’elaboració.
Aquest es una tira de paper que conté substàncies reactives, que quan entren en contacte amb un substància varien de color. Aquesta tècnica és molt útil ja que es possible mesura el pH amb molta poca quantitat de substància i a més és no varia en cap moment l’integrat i qualitats de la mostra Aquests papers tenen un escala del 0-14.
Tot hi així la tècnica més avançada és el Phmetre. Mesura el ph de la mostra, és una tècnica no destructiva. El pHmetre és un aparell constituït per un vidre de Bor o silicat permeable als ions H+ que crea un camp electric a causa de les diferencies de potencial entre l’interior de l’aparell i la mostra. L’elèctrode de referència tanca el circuit electrònic 16 Aleix puig Morillo Primer de CCAA 29-5-2006 Practiques de Fisiología Vegetal Factors que influeixen en la mesura del pH: - Temperatura: varia la permeabilitat del vidre.
- Força iònica: varia la constant de dissuasió del tampó segons la concentració. Canvi no lineal.
- Contaminació: absorció de substàncies que bloquegen el vidre. Netejar amb lleixiu (organiques) o amb izoensims (proteïnes).
- Ions Sòdics: son permeables al vidre del pHmetre i a molta concentració alteren el valor real del pH. S’han d’utilitzar vidres més selectius, o utilitzar KOH en comptes de NaOH.
Tipus d’elèctrodes de pH: - No combinats: l’elèctrode del pH i el de referència és troben separats.
Combinats: Hi ha tres elèctrodes que estan junts, el de lectura de pH, el de referència i la sonda de temperatura. Necessita menys volum de mostra que el no combinat, Selectius: aprofiten les propietats d’altres membranes permeables, es a dir, mesuren les concentracions d’altres ions (però només un).
Micro elèctrodes: igual que els combinats però de tamany molt reduït. És situa dins de capil·lars i s’utilitza per mesurar pH molt petits (fins el tamany d’una cèl·lula). També poden ser selectius Importància del pH en les proteïnes: La raó per la qual los proteïnes mantenen la seva estructura (primària, secundaria o terciària) es deu a: Interaccions hidrofóbiques.
Ponts d’hidrogen Interaccions salines.
Ponts de sulfur.
Al varia el pH les interaccions varien i les proteïnes corren el risc de perdre l’estructura (desnaturalitzar-se). La variació del pH, augment de temperatura, o alguns agents desestabilitzants implica arribar al punt isoelectric: és perd la carrega i per tant la proteïna ja no és pot dissoldre en aigua i precipita. Així s’ajunten totes les cadenes d’aminoàcids desplegades de les estructures formant agregats, o inclòs es pot perdre el centre actiu. Els agregats varien la densitat òptica de la mostra.
Practica // Fonament: les proteïnes, al igual que els péptids i aminoàcids, posseeixen valors característiques de pH isoelèctric en el que es condueixen com ions híbrids i no presenten cap carrega elèctrica neta.
Quan ajustem el pH d’una mescla de proteïnes al pH isoelèctric d’un dels seus components , gran part o tot el component precipitarà i només quedarà en solució aquelles proteïnes que posseeixin valors de pH superiors o inferiors, d’aquest pH. Les llavors de les lleguminoses contenen una gran quantitat de proteïnes de reserva. Aquestes proteïnes son del tipus globulina i constitueixen un component majoritari de la llegumina i la vicilina, i es localitzen en els grans de aleurona de les cèl·lules.
Objectiu: determinar el punt isoelèctric de proteïnes vegetals.
17 Aleix puig Morillo Primer de CCAA 29-5-2006 Practiques de Fisiología Vegetal Material: - Recipient de 100ml.
Llavors de llenties.
Provetes de 50ml.
Morter.
NaCl 10%.
2 recipients de 100ml.
Proveta de 100ml - 7 tubs d’assaigs de 10ml (10x16).
- 2 pipetas de 2ml.
- 2 tubs de centrífuga de 50ml de plàstic amb tap.
- Barra de vidre.
- Bany de 100ºC.
- Solucions de pH (3, 3.5, 4 ,4.5, 5, 5.5, 6).
Mètode: - Omplir un recipient de 100ml amb 30ml d’aigua destil·lada.
- Introduir 8 llavors de llentia al recipient i deixar reposar 24 hores.
Extracte de proteïnes.
- Recollir les llavors preparades i escórrer l’accés d’aigua, - Moldre les llavors fins obtenir una constància pastosa. Afegir 40ml de NaCl al 10% i homogeneïtzar, fins obtenir un aspecte lletós i sense grumolls. Transferir a un vas de precipitats de 100ml i deixar reposar 15min.
- Centrifugar a 3000 r.p.m durant 10min.
- Decantar el sobreflotant en un vas de precipitat i col·locar-lo al bany maria durant 15min.
- Refreda el vas de precipitats amb aigua.
- Transferir la mostra a un tub de centrifuga de 50ml.
- Centrifugar a 3.000 r.p.m durant 15min.
- Decantar el sobreflotant en una proveta i ajustar el volum a 50ml amb NaCl 10%.
Preparació de les solucions de pH.
- Prepara una sèrie de 7 tubs d’assaig. Marcar-los amb valors de pH amb els que es treballarà.
- Pipetejar 5ml de cada una de les solucions tampó, ja preparades, i introduir-les en el tub corresponent.
Determinació del pH isoelèctric.
- Afegir a cada un dels tubs d’assaigs 1ml del extracte de proteïnes.
- Deixar incubar els tubs a temperatura ambient durant 20 o 30min.
- Llegir l’absorbència dels tubs a 100nm utilitzant aigua destil·lada com a blanc.
Resultats: - Anotar els valors d’absorbància de cada una de les series de tubs preparats.
pH Abs400 3 0,289 3,5 0,375 4 0,345 4,5 0,361 5 0,361 5,5 0,246 6 0,232 - Representar gràficament els valors obtinguts.
Abs400 Valor d'absorció segons el pH 0,4 0,35 0,3 0,25 Serie1 0,2 0,15 0,1 0,05 0 0 2 4 pH 6 8 18 Aleix puig Morillo Primer de CCAA 29-5-2006 Practiques de Fisiología Vegetal - Calcular el valor de pH per el que la torbació es màxima. Anotar-lo a continuació.
pH isoelèctric = 3,5 Comentari // El que hem fet en aquesta practica és determinar el punt isoelèctric de les proteïnes de reserva de les llavors de les llenties. Tota proteïna té un punt isoelèctric, que és el moment en el qual la proteïna per tota carrega elèctrica i per tant ja no és pot dissoldre en aigua i aquesta precipita. El procediment que hem utilitzat per aconseguir arribar a el punt isoelèctric ha sigut dissoldre les proteïnes en diferents dissolucions de pH. El canvi de pH a produït que les interaccions que mantenien unida l’estructura de la proteïna és trenquessin eliminant-ne la carrega i produint la seva precipitació (accelerada pe la centrifugació). Per tant les diferits dissolucions de pH i mostra de proteïnes han augmentat el seu valor d’absorció a causa de la precipitació dels components proteics.
Per tant com més absorbància té un dissolució més quantitat de proteïna a precipitat, per tant aquella dissolució de pH que representa un absorbància més elevada representarà el punt de pH isoelèctric, es a dir aquell valor de pH (en el cas de la practica 3,5) on precipita més quantitat de material proteic.
Cal destacar que durant el procediment seguit per realitzar la practica han sorgit diferents problemes. El primer problema és que la dissolució de pH 4 tenia un color fora de lo normal i vam haver de restar -0,014 al valor d’absorbància obtinguda en aquesta dissolució. El segon afer fora de lo normal és que ha tots els grups s’ha li disparava el valor d’una de les dissolucions de pH (a tots els grups una dissolució diferent), fet que no ha premés fer un línia de tendència per determinar de forma més acurada el punt de pH isoelèctric ja que el coeficient de correlació era menor a 0,4.
Practica V: Mesura de relacions hìdriques. Metode de la plasmolisis incipient // Teoria // Observació microscòpica: és basa en un sistema de lents que permet observar imatges ampliades.
Quan un feix de llum travessa una lent biconvexa aquesta varia els feixos de llum e direcció i els ajunta en un sol punt de tal manera que forma una sola imatge invertida. L’índex de refracció no es total a totes les zones hi apareixen aberracions: - Cromatica: L’índex de refracció no és constant per a totes les longituds d’ona. Resultat; dona colors al voltant de l’imatge. Se soluciona amb l’aplicació de dos lents.
Esferica: es la llum refractada en funció de l’angle d’incidència i l’índex de refracció, segons l’angle d’incidència, la llum surt de la lent refractada sobre diferents punts i s’obté una imatge borrosa. Per solucionar-ho és pot utilitzar una lent amb un únic angle d’incidència o una lent convexa combinada amb un lent còncava.
Resolució: distancia mínima en la qual podem veure dos punts perfectament separats. Com més petita és la resolució millor.
Resolució = 0,61λ/nsinu n: índex de refracció del vidre (millor com més dens sigui).
u: angle d’incidència de la llum.
λ: longitud de onda (millor com menor sigui) n Sin u: obertura numèrica(AN) -> com més alta més resloució 19 Aleix puig Morillo Primer de CCAA 29-5-2006 Practiques de Fisiología Vegetal Els microscopis poden ser: Microscopi simple: microscopi format per una sola lent o grups de lent que corregeixen les aberracions. L’exemple més simple és una lupa.
microscopi Microscopi compost: format per més d’un grup de lent que corregeixen les aberracions i augmenta el poder de resolució. Hi ha tres tipus de visualització; la llum es reflectida per l’objecte, la llum través la mostra, si aquesta no te prou contrast aquesta s’ha de tracta (tinció).
Parts d’un microscopi.
- - - Ocular: amplia la imatge del objectiu, és la base d’una bona resolució.
Platina i Peu: suport físic.
Cargol macromètric: per enfocar prèviament de la mostra Cargol micromètric: per enfocar de forma apurada.
Mirall: dirigeix la llum al condensador.
Font de volum: amb filtra blau que les aberracions elimina cromàtiques.
Condensador: concentra els raigs de llum i es col·loca paral·lels.
Objectius: formen l’imatge primaria augmenta per l’ocular, com mes augment, més AN i més qualitat d’imatge.
20 Aleix puig Morillo Primer de CCAA 29-5-2006 Practiques de Fisiología Vegetal Tipus de microscopis òptics.
- - Camp clar: la llum passa a través de la mostra. Si la mostra te poc contrast és necessari l’us de colorants (és un tècnica destructiva).
Camp fosc: la llum incideix lateralment sobre la mostra i entra a l’objectiu. Té un bon contrast, és un tècnica no destructiva, però dona la imatge en blanc i negre.
Contrast de fase: variació de la fase de propagació de la llum, la desdobla i desprès la torna a junta tot i que un dels raigs arriba amb retard. Permet veure mostres amb diferents densitats optiques, la imatge és amb blanc i negre i té un bon contrasts. Com més densa és la mestra més lenta anirà la llum.
Fluorescència: la llum ultraviolada incideix sobre la mostra i es veuen figures amb diferents intensitats de color. Si la mostra és fluorescent per si sola emetrà llum sinó s’ha de tractar amb antigens.
Tipus de microscopis electrònics.
Els electrons tenen funcions d’ona i longituds d’ona molt petits, per lo qual tenen una gran resolució (òptic: 200, electrònic: 0,5 um). S’utilitzen electrons per il·luminar la mostra que ha d’estar al buit (per tal de permetre el moviment d’electrons) i tractada amb metalls ja que aquest tenen massa i densitat suficient per dissipar els electrons i ha de ser molt fina.
- Microscopi de transició: els electrons passen a través de la mostra.
Microscopi d’escombrat: els electrons son refractats per la mostra. Dona el relleu de la mostra.
Raigs X.
Difrecció de raigs X.
Confocal (laser).
21 Aleix puig Morillo Primer de CCAA 29-5-2006 Practiques de Fisiología Vegetal Practica // Fonament: el moviment de l’aigua es realitza sempre a favor del potencial hídric. En una cèl·lula vegetal, aquest potencial ve determinat tant per el potencial osmòtic com per el potencial de pressió segons l’expressió Ψw = Ψπ + Ψp. Quan una cèl·lula vegetal es posa en contacte amb una solució que contingui un solut per el qual la membrana cel·lular sigui impermeable, aquella guanya o perd aigua en funció del gradient de potencial que s’estableixi. Quan la cèl·lula perd aigua, el potencial de pressió disminueix i, si aquesta pèrdua es suficient, el citoplasma deixa de pressionar contra la paret cel·lular, moment en que el potencial de pressió es igual a zero. En aquest punt denominat plasmólisi incipient, i determinat pràcticament com aquell valor de potencial osmòtic de la solució que provoca la plasmólisis del 50% de les cèl·lules del teixit, l’únic component del potencial hídric cel·lular es el potencial osmòtic. Mitjançant una observació del comportament de les cèl·lules front a diferents concentracions de un solut no permeable en el medi es pot determinar el potencial osmòtic cel·lular.
Objectiu: observació del fenomen de la plasmólisis en cèl·lules epidèrmiques de bulb ceba (Allium cepa) i calcula el potencial osmòtic de les mateixes.
Material: Bulb de ceba.
6 cubreobjectes.
6 portaobjectes.
Microscòpic - 6 tubs d’assaigs de 15ml.
- Sacarosa 1M.
- Pipetes (1x10ml, 1x15ml i 1x2ml).
-1 pipeta Pasteur amb tetina.
Mètode: Preparació.
- Prepara 6 tubs d’assaigs i marcar-los de la segunt manera: 0, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6 i 0.7.
- Prepara 6 portaobjectes i marcar-los iguals que els tubs anteriors.
- A partir d’una solució de sacarosa 1m prepara 10ml de les concentracions següents: 0, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6 i 0.7.
- Barrejar bé els tubs fins que la solució obtinguda sigui perfectament homogènia.
- Dipositar en cada portaobjectes una gota de la solució de sacarosa corresponent.
- Prendre un bulb de ceba, pelar-lo i separar una de les fulles.
- Separar 6 fragment d’epidermis d’aproximadament 1 cm de costat i dipositar-los sobre els porta objectes.
- Cobrir la preparació amb un cubre.
- Deixar-los reposar durant 15min.
Observació microscòpica.
- Comencem per la màxima concentració de sacarosa.
- Posar la solució a la platina.
- Observar les cèl·lules i contar les plasmolitzades qeu hi ha dins d’un camps (unes 50 cèl·lules per camp aprox.).
- Calcular el percentatge de cèl·lules plasmolitzades per a cada preparació.
Resultats: - Tabular els valors de percentatge de cèl·lules plasmolitzades front al potencial osmòtic de les solució de sacarosa.
Sacarosa (M) Ψπ (MPa) % cèl·lules plasmolitzades 0 0 2 0,3 -0,72957 30 0,4 -0,97273 46 0,5 -1,21596 52 0,6 -1,45914 59 0,7 -1,70233 70 22 Aleix puig Morillo Primer de CCAA 29-5-2006 Practiques de Fisiología Vegetal %cèl·lules plasmolitzades Relació entre el percentatge de cèl·lules plasmolitzades i potencial hosmotic y = 39,853x + 2,7841 R2 = 0,9902 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Serie1 Lineal (Serie1) 0 0,5 1 1,5 2 Potencial hosmotic (MPa) % plasmòlisi = 39,853 · Ψπ + 2,7841 r = 0,9902 50% plasmòlisi = - 1,15 MPa Comentari // En aquesta practica hem tornat a experimentar amb el potencial hídric. Com ja hem dit anteriorment quan una cèl·lula vegetal entra en contacte amb un dissolució amb un solut permeable a la membrana cel·lular, aquesta guanya o perd aigua depenent del gradient de potencial que es produeixi. Si la cèl·lula experimentat un pèrdua suficient d’aigua, el citoplasma deixa de presionar contra la paret cel·lular (el potencial de pressió en aquest punt es igual a zero) i és produeix l’anomenada plasmólisi incipient.
Com més concentració de solut (en aquest cas sacarosa) tingui el medi, més quantitat d’aigua perdrà la cèl·lula, per tant quan observem les mostres al microscopi, el major nombre de cèl·lules plasmolitzades es trobaran a la solució més concentrada de sacarosa, i en la solució on hi ha sacarosa s’espera trobar un valor molt pròxim a zero de cèl·lules plasmolitzades (de la dissolució més concentrada a la menys concentrada, és produeix un baixada de percentatge de cèl·lules plasmolitzades).
Per últim i gràcies a la gràfica hem pogut aproximar el valor de potencial necessari per que és produeix la plasmolització d’un 50% de les cèl·lules, es a dir, que el potencial sigui capaç de treure aigua de la meditat de les cèl·lules del teixit. En aquest cas el potencial osmótic és aproximadament del 1,15MPa.
23 ...