TEMA 2. Tècniques de cultiu (2014)

Apunte Español
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Biología - 2º curso
Asignatura ampliiació biologia cel·lular
Año del apunte 2014
Páginas 8
Fecha de subida 24/11/2014
Descargas 29
Subido por

Descripción

Apunts realitzats amb el suport de classe i les anotacions del docent.

Vista previa del texto

AMPLIACIÓ BIOLOGIA CELULAR Tania Mesa González 2º CURS BIOLOGIA UAB TEMA 2: TÉCNIQUES DE CULTIUS CONDICIONS FÍSIQUES: 1. Temperatura d’inclusió  normalment a la temperatura del l’organisme original.
1. Mamífers: 36,5-37 2. Aus: 38,5 3. poiquiloterms: tº ambient –2ºC 4. Excepcions: a) Cèl·lules testiculars (32ºC) b) Cèl·lules epidèrmiques ratolí (33ºC)  Amb un excés de temperatura les cèl·lules moren, en canvi en fred es conserven.
2. pH fisiològic  7,0 – 7,7 (7,4). Es controla amb un indicador anomenat Roig de fenol, que canvia de color en funció de la variació de pH. El color taronja es el de 7,4.
 L’àcid mata els organismes en poques hores. Aquest indicador no modifica res del cultiu.
3. Constitució de fase gasosa  El CO2 és un producte que es dissol en aigua en funció de la temperatura. Si es barregen el medi aquós amb l’aigua, augmenta la presencia de CO2, es poden produir protons en excés i llavors s’acidifica el medi i pot ser perjudicial pel cultiu.
En l’incubador amb una atmosfera amb només de 5-10 % de CO2 (depèn de la línea cel·lular i del medi de cultiu). Es mantenen les condicions gasoses. El 5% es per a mantenir el pH a 7,4 i perquè en l’incubadora hi ha menys oxigen.
 En el cas de que es modifiqui un valor d’un gas es modifiquen els altres per a que siguin equivalents.
 En alguns casos augmenten la quantitats de N2, per a que hi hagi menys O2.
El CO2 és molt important perquè les cèl·lules respiren i el van alliberant.
a) Si el cultiu està tancat la concentració de CO2 va augmentant, al mateix temps que ho fa el cultiu. Això produeix la formació de protons i per tant de l’acidesa (bomba sodi i protons).
La super producció de CO2, també pot originar lactat.
b) Si baixem la quantitat el CO2 el pH augmenta, es basifica, que és el que passa en el cas dels cultius oberts.
Els cultius tamponats o en incubadores tenen una petita obertura que permet garantir que es mante el CO2 en el nivell més o menys correctes.
 En altres casos se li diposita una solució tampó que permet anar eliminant els protons per a que no s’acidifiqui  bicarbonats sodis (NaHCO3-CO2), fosfats (H2PO4-HPO4) i HEPES, (són bons però poden resultar tòxics en una alta concentració).
4. Tipus de substrat: a) Cels. que creixen en suspensió  tot el que ve de la sang (línies hematopoiètiques).
Algunes cels. tumorals, gàmetes, etc.
b) Cels. adherides al substrat  majoria de les línies.
i.
Semi-sòlid (amb matriu)  col·lagen, agar o gelatina ii.
Sòlid  vidre o plàstic c) Cels. en cocultiu  Cels. d’interès (Cels. mares embrionàries) creixen sobre una capa de cels. nodrides (cultiu de cels. que no es poden dividir) permetent que les cèl·lules de dalt, mitjançant factors de creixement o nutrients, puguin créixer.
5. Tipus de flascons: El tipus de flascons depèn del tipus del cultiu i de la quantitat que necessitem d’aquest.
a) Plaques de petri b) Flascó  en produccions molt grans c) Roller bottles  molta producció = gran superfície. Tenen fons arrugats, microcarries (boletes per a que creixin més) , etc.
d) Multiplaques  per fer moltes mostres però petites.
e) Tub  en el cas de material com la sang.
Roller bottles CONDICIONS BIOLÒGIQUES Solucions salines Medis de cultius  segons la composició: a) Medis indefinits  extractes embrionaris, sèrums.
b) Medis definits  composició coneguda.
1. Solucions salines equilibrades  H2O + sals inorgàniques. Lo més important és l’aigua que utilitzem, que no tals sols ha de ser destil·lada, sinó que ha d’estar desionitzada. Perquè ha de ser químicament pura.
La solució salina es isotònica, permetent que les nostres cèl·lules estiguin en una solució que no les farà petar ni encongir-se, però en ella no podran créixer. Per tant no es un medi de cultiu, sinó de transport o per elaborar els rentats.
 Les cèl·lules en questes condicions poden estar aproximadament 4 dies només.
 Hi ha algunes que porten roig de fenol, per a controlar el pH i n’hi ha que no.
2. Medi de cultiu  ha de substituir el medi i l’ambient natural de l’organisme. Per tant com que les cèl·lules poden venir de diferents llocs, el medi tenen lleugerament diferents components.
Ha de ser un medi nutritiu per a facilitar el creixement. Han de ser isotònics, han de tenir tampons per a conservar el pH i han de ser estèrils.
 Els medis poden ser més senzills (basal) o més específics, si millorem els medis basals per a obtenir el medi òptim per als diferents cultius.
 Tots, excepte molt pocs cultius, necessiten sèrum i altres un medi químicament definit, sense sèrum.
2.1 Medis amb sèrum (Indefinits) MEM: 1. Amb amino àcids  afegeixo els essencials i aquells que necessita. També es subministren d’altres que in vitro no poden fer.
No essencials:  Cisteïna: in vitro no a partir de Met  Tirosina: in vitro no a partir de Phe  Glutamina: font extra carboni i energia (inestable) 2. Vitamines  sobre tot del grup B, perquè actuen com a cofactors d’enzims.
3. Sals inorgàniques:  Na+, K+, Ca2+, Cl-  potencial membrana  Ca2+  adhesió cèl·lules i unions  HCO3-  tampó de pH, paper nutricional  PO43-  síntesi d'ATP 4. Glúcids  glucosa, galactosa, fructosa (com a font de carboni = font d’energia).
5. Suplements orgànics  sèrum (10-20%). A la sang per a que puguin rebre els factors que porten.
6. Antibiòtics  impedeixen que hi hagi contaminació o que no surti tan aviat la contaminació. No sempre són utilitzats.
 Sèrum  el sèrum l’extraiem del fetus de vedella, de cavall o d’humans. Els sèrums però, no són iguals, per això fan barreges de diferents vedelles. Per aquest motiu és convenient comprar sèrums suficients com per a no haver-ne de canviar de tipus i que es contamini.
S’agafen fetus per a que hi hagin més factors de creixement. El sèrum s’inactiva si està 30 min o més a 56ºC.
Formats per:  Proteïnes, pèptids  Molècules adhesió  GFs, hormones  Inhibidors proteases  Lípids 2.2 Medis químicament definits (sense sèrum)  medi on s’afegeix tot lo anterior i a més s’afegeixen factors d’adhesió, hormones, altres nutrients, inhibidors de proteases, factors de creixement, proteïnes i poliamides.
 2.3 Sempre és conegut exactament, però encara no està extès a tot el tipus de cultiu cel·lular.
Matrius 3D  on el cultiu deixa muntanyes, a causa de que les cels. creixen formant volums. En aquest cas l’inhibició per contacte costa molt menys.
 Utilització de matrius tridimensionals a) Materials sintètics b) Materials naturals (fibronectina, col·lagen...) CONTAMINACIÓ I ESTERILITZACIÓ: Tot ha d’estar esterilitzar per a no ser contaminats per: 1. Fongs  per la mala destinació del destinatari.
2. Llevats  es difícil que es produís, malgrat que hi hagi un contacte amb alè.
3. Bacteris  quan el medi o qualsevol altre objecte de recerca no està del tot esterilitzat.
 Amb els llevats i els bacteris es noten per acidifiquen molt aviat els cultius.
4. Microplasmes i virus quan veus que no creixen del tot be. Costa molt de veure-ho.
Mètodes d’esterilificació: a. Tèrmics  Esterilitzem per calor amb materials termoresistents.
 Calor sec (forn pasteur)  Calor humit = No es poden utilitzar en medis de cultiu amb sèrum perquè tenen proteïnes i es desnaturalitza. (Autoclau) b. No tèrmics  esterilitzem físicament amb materials termolàbil.
  γ  Es treballa amb campanes de fluix vertical.
CRIOPRESERVACIÓ Preservació de les cèl·lules a -196ºC.
Motius:  Evitar a) Deriva genotípica per inestabilitat genètica b) Senescència c) Transformació d) Inestabilitat fenotípica e) Contaminació o contaminació creuada  Estalvi de temps i material  Necessitat de transport  Mal funcionament aparells 1. Congelació ràpida  La congelació forma cristalls tant dins com fora de la cèl·lula. Els cristalls tenen arestes que lisien les membranes (causen la mort de la cèl·lula), per això intentem disminuir la formació de cristalls almenys dins de la cèl·lula.
2. Congelació lenta (-1ºC/min)  Fa que es formin cristalls primer fora. Com a conseqüència la quantitat d’aigua ha disminuït i el medi es torna hiperiònic, la cèl·lula s’encongeix i treu aigua fora. Llavors es formaran menys cristalls interns.
Un altre forma de congelar es afegint un crioprotector DMSO o Glicerol, que es un anticongelant que entra a la cèl·lula a favor de gradient i el que provoquen es una baixada del punt de congelació (interaccionant amb les molècules d’aigua) i per tant disminueix la formació de cristalls de gel a l’interior.
Amb els congeladors del lab, no es fan servir per a cèl·lules, sinó només per elements reproductius.
El que es fa servir per a les cels. és un Nalgene “Mr. Frosty”, que a les parets tenen com una esponges mullades en isopropil alcohol on es fiquen els criotubs. Desprès es fiquen a un congelador de -80 ºC, provocant una congelació lenta. Més endavant ja es podrà posar a -180 ºC.
 Amb Nitrogen líquid representa que es podria fer i es poden tenir molts anys congelats a 196ºC.
Descongelació  Ràpida a 37ºC amb agitació constant. Cal diluir el crioprotector o centrifugar la mostra per eliminar-ho. S’ha de fer amb cura perquè el crioprotector es tòxic.
QUANTIFICACIÓ: Si fem estudis respecte la toxicitat o elements malignes per a les cèl·lules si hem de comptar les cèl·lules.
A més amb la quantificació també s’estudia la quantitat de síntesis de DNA i de proteïna.
 Càmera de Neubauer Es fa una regla de tres. Es compta en un espai molt petit i es calcula la relació en espais més grans.
Ens permet saber si les cèl·lulesestan mortes o vives mitjançant el blau de tripà, ja que aquest colorant només pot entrar si les cèl·lules tenen la membrana feta malbé i que per tant estan mortes.
 Comptador electrònic  compta les cèl·lules automàticament.
 Citometria de flux  fa passar la barreja per un capil·lar molt prim, per on només poden passar les cèl·lules d’una a una. Es posa un colorant per diferenciar les cèl·lules vives de les mortes.
a) Facs  compta la cèl·lula segons la seva fluorescència, mitjançant el colorant que li hem afegit. Producte verd = calceina fluorescents a les cèl·lules vives, ja que la fluorescència es crea quan un cop el colorant entra a la cèl·lula l’activitat enzimàtica el talla activant-lo.
b) El iodur de pepidi, entra en les mortes i tenyeix el nucli de vermell.
Dona un histograma amb núvols cel·lulars segons el seu estat. Permet comptar moltes cèl·lules. A part l’aparell té el Sorter, que mitjançat la càrrega que aporten els colorants es poden separar els individus.
...