Tema 4 (Transcripció Procariotes) (2014)

Apunte Catalán
Universidad Universidad de Barcelona (UB)
Grado Nutrición Humana y Dietética - 1º curso
Asignatura Biologia Molecular i Genòmica
Año del apunte 2014
Páginas 4
Fecha de subida 29/01/2015
Descargas 45

Descripción

Apunts Biologia del primer i segon parcial (2n Semestre NHD)

Vista previa del texto

Biologia molecular i genòmica 4. TRANSCRIPCIÓ EN PROCRIOTES Transcripció en Procariotes Base de la regulació gènica: interacció específica DNA-proteïna - El solc gran del DNA permet interaccions amb proteïnes, i la lectura de les seqüències de DNA.
- El reconeixement de la seqüència del DNA específica, es fa a través de regions o elements estructurals, que són només una part de l’estructura terciària de la proteïna sencera: Domini d’unió de la proteïna al DNA.
- Canvis conformacions en la proteïna i en el DNA, per poder establir el màxim nombre d’enllaços no covalents, per estabilitzar la unió.
Interacció DNA-proteïnes - L’adenina de la parella T-A es reconeguda per la glutamina o l’asparragina.
- La guanina de la parella C-G es reconeguda per la cadena lateral de l’arginina.
Dominis proteics d’unió a l’DNA - Hèlix-gir-hèlix: hi ha una hèlix d’estabilització i una de reconeixement del solc gran del DNA.
Normalment les proteïnes dimèriques; seqüència palindròmica (simètrica) de reconeixement de les proteïnes d’unió a DNA, separades per 5pb. El repressor de la lactosa, que regula l’expressió de l’operó de la lactosa, és membre d’aquesta família de factors de transcripció.
- Motiu homeodomini: l’hèlix s’encarrega reconeixement del solc gran i el tram sense estructura secundària interacciona amb les bases del solc petit del DNA.
- Hèlix-llaç-hèlix bàsic (bHLH): contactes entre les dues hèlix per aa hidrofòbics; α-hèlix insertades en el solc més gran del DNA (aa bàsics).
- Motiu dit de Zn: està format per uns 30aa i està estabilitzat per la unió d’un ió de Zn a 4 residus de Cys a 2 residus de Cys + 2 His.
Aquestes proteïnes solen presentar múltiples dits, formant una cadena al voltant del solc major del DNA. També es troben en proteïnes d’unió a RNA i regulen la traducció.
- Motiu cremallera de leucines: dues α-hèlix interaccionen hidrofòbicament entre leucines i un superenrotllament. En la regió d’unió al DNA intervenen aa bàsics (Arg i Lys); homodímers i heterodímers.
Recordem les diferències de la molècula de RNA amb la de DNA - L’uracil interacciona per ponts d’H amb l’adenina en la molècula de RNA.
- L’RNA és de cadena senzilla i llavors adopta moltes estructures diferents d’aquest tipus. La mateixa molècula de RNA pot adoptar més d’una estructura tridimensional (amb funcions específiques).
TRANSCIPCIÓ: és la síntesi de la molècula de RNA catalitzada per la RNA polimerasa, utilitzant una cadena de DNA com a motlle, per donar lloc a un “producte gènic”:  RNA funcional: estructural o catalític.
 RNA missatger: que donarà lloc a una proteïna.
Reacció de la RNA polimerasa Característiques de les RNA polimerases: - Necessiten un motlle de DNA, els 4 ribonucleòtids i Mg2+.
Biologia molecular i genòmica 4. TRANSCRIPCIÓ EN PROCRIOTES - Polimeritza el RNA en direcció 5’ a 3’, mitjançant la formació d’enllaços fosfodièster. Llegeix la cadena motlle del DNA en direcció 3’ a 5’ (antiparal·lela i complementària a la nova cadena).
No tenen activitat correctora Alta processivitat Caràcter asimètric No necessiten encebador, s’uneixen a seqüències promotores.
La transcripció produeix una sola cadena de RNA, cadena motlle i codificant.
Direcció de la polimerització de la RNA polimerasa segons quina sigui la cadena motlle, si es desplaça d’esquerra a dreta, utilitzarà la cadena motlle inferior, i si és al revés utilitzarà com a motlle la cadena superior. Les dues cadenes codifiquen missatges diferents.
Estructura d’un gen: la transcripció d’un gen s’inicia en un punt concret, on el promotor és el lloc d’unió de la RNA polimerasa.
- La seqüència de DNA corresponent a un gen també ens diu en quin moment s’ha de fabricar el producte gènic, en quines cèl·lules i en quina quantitats.
TRANCRIPCIÓ A PROCARIOTES: ESTUDIS AMB E.COLI  Transcriu tots els RNAs - Holoenzim: estructura de 500kD amb sis subunitats de 5 tipus (α2ββ’ω), nucli de l’holoenzim(σ).
α: s’uneix a seqüències UP reguladores.
β: forma enllaços fosfodièster.
β’: s’uneix al DNA.
σ: responsable de l’inici de la transcripció; hi ha diferents subunitats.
La síntesi de RNA comença en els promotors: seqüències de reconeixement per a la iniciació de la transcripció.
Les mutacions en els promotors poden variar l’eficiència de la transcripció, a la regió -35 afecten la unió de la RNA polimerasa i a la regió -10 afecten la separació de les cadenes.
Seqüències consens del promotor bàsic procariota: Aquestes dues caixes són elements clau perquè s’hi uneixi la polimerasa, però hi ha altres elements reguladors; promotors forts i febles segons les seqüències. És tant important la conservació de la seqüència com la de la posició relativa dels diferents elements.
La interacció de l’RNA polimerasa amb el DNA: tècnica de footprinting (empremta genètica); la interacció de l’RNA polimerasa amb el DNA es pot visualitzar mitjançant la tècnica de footprinting. En la que es pot veure que la regió protegida es de uns 60-80 bp i inclou ambdues regions -10 i -35.
ETAPES DE LA TRANSCRIPCIÓ: tant en procariotes com a eucariotes la transcripció es dóna en tres etapes  Inici: requereix seqüències promotores. Formació del complex tancat, unió de l’RNA polimerasa, reconeixement σ i unió. El DNA està encara com a doble hèlix.
Biologia molecular i genòmica 4. TRANSCRIPCIÓ EN PROCRIOTES   Complex obert: el DNA té un petit segment desenrotllat de 17pb, la caixa de Pribnow rica en A i T és més fàcil de fondre (obrir). Les subunitats β i σ intervenen en la formació del complex obert.
Elongació: allargament de la cadena de RNA per la RNA polimerasa. És necessària la bombolla de transcripció, híbrid DNA-RNA de 8 nt, síntesi RNA 5’ a 3’, velocitat 40-50 nt/s i RNA pol que no es desenganxa (processiu).
L’elongació produeix una tensió en el DNA i provoca: → Superenrotllament positiu pel davant de la bombolla de transcripció.
→ Superenrotllament negatiu pel darrera la bombolla.
Terminació: requereix de senyals de parada o de factors proteics. El “Harpin” de terminació depèn només de la seqüència. Trobem 2 seqüències palindròmiques riques en CG, i a continuació es troben vàries T. La formació d’aquesta estructura es fa molt a prop de la bombolla, molt estable pel contingut de CG.
Model de terminació de la transcripció independent del factor Rho: disminueix la velocitat de la polimerasa i la transcripció al trobar les CG. Amb l’estructura secundària del RNA i a més les unions febles al motlle U=A, tot plegat fa que la polimerasa es pari i el RNA es desenganxi sortint del complex.
Model de terminació dependent del factor Rho: depèn de la seqüència de DNA i de la proteïna Rho. És una helicasa que té 6 subunitats, s’enganxa a l’RNA, es desplaça per l’RNA de 5’ a 3’, trenca la hibridació RNA-DNA i desfà el complex.
Punts de control de la regulació de l’inici de la transcripció a bacteris - Expressió gènica constitutiva: és la que es dona en tots aquells gens que es necessiten contínuament, factor sigma.
- Expressió gènica regulada: depèn de la influència de proteïnes reguladores (inducció i repressió).
Diferents subunitats sigma, que reconeixen seqüències diferents, són essencials per l’iniciació de la transcripció: σ70 reconeix el promotor estàndard “housekeeping” per les funcions bàsiques de la cèl·lula. Altres subunitats sigma alternatives controlen operons específics que s’activen en determinades condicions d’estrès o de creixement: σ32 reconeix el promotor de xoc tèrmic.
σ54 reconeix el promotor de proteïnes que usen fonts alternatives de nitrogen.
Hi ha variacions de les seqüències promotores respecte de la consens i la utilització de diferents subunitats σ ja és una forma de regulació gènica específica.
EXPRESSIÓ GÈNICA REGULADA EN E.COLI - Regulació a través de proteïnes reguladores → Model regulació positiu: l’activació facilita la transcripció unint-se a la seqüència reguladora.
Una molècula senyal (efector) causa dissociació de la proteïna activadora del DNA, inhibint la transcripció. L’activador s’uneix al DNA si esta associat a una molècula senyal (efector) i llavors activa la transcripció. Quan disminueix la concentració de la molècula senyal causa dissociació de la proteïna activadora del DNA.
→ Model regulació negatiu per proteïnes repressores: el repressor per si sol s’uneix al DNA i inhibeix la transcripció. Una molècula senyal causa la dissociació de la proteïna repressora del Biologia molecular i genòmica 4. TRANSCRIPCIÓ EN PROCRIOTES DNA i permet la transcripció. El repressor s’uneix al DNA només si esta associat a una molècula senyal i llavors inhibeix la transcripció. Quan disminueix la concentració de la molècula senyal causa dissociació de la proteïna repressora del DNA.
- Concepte d’Operó: la majoria de gens procariotes estan agrupats i es regulen en “operons”. Un operó està constituït per un grup de gens estructurals, un promotor i seqüències addicionals que funcionen conjuntament en la regulació. Generalment el transcrit d’un operó és un RNAm policistrònic.
- Operons Iac i triptòfan: models de regulació → La activació de l’operó lac permet la utilització de la lactosa com única font de carboni.
Aquest operó conté: tres gens estructurals (galactosidasa, permeasa i transacetilasa), un promotor per aquests gens, seqüències reguladores i una seqüència que codifica per un repressor “i” i el seu promotor que controla la seva expressió.
L’objectiu de la regulació és modificar la transcripció de l’operó lac amb dues molècules senyal que són clau: alol·lactosa i AMPc.
 Control negatiu: l’element de regulació és una proteïna repressora unida al DNA que quan s’uneix a la alol·lactosa, perd afinitat pel DNA i no permet la transcripció.
 Control positiu: l’element de regulació és un activador, CRP o proteïna receptora d’AMPc que quan s’uneix a l’AMPc activa la transcripció.
Dos dímers del repressor lac s’uneixen a l’operador principal i a un dels dos llocs secundaris, formant un llaç.
Paper del cAMP: acció combinada de glucosa i lactosa en l’operó lac; el repressor sempre esta lligat, perquè hi hagi activació és necessari que hi hagi lactosa i a més la unió del CRP. Per tant, hi ha transcripció quan hi ha poca glucosa, en primer lloc s’aprofita la glucosa i després la lactosa.
→ Operó del triptòfan: la unió del triptòfan augmenta la distància entre les dues hèlix de reconeixement, canvi de conformació i unió al DNA.
Model “dual” de regulació: ...