Informe prácticas 8,00 (2017)

Trabajo Español
Universidad Universidad Rovira y Virgili (URV)
Grado Biotecnología - 3º curso
Asignatura Metabolismo de microorganismos
Año del apunte 2017
Páginas 12
Fecha de subida 18/07/2017
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Informe de prácticas Metabolismo de microorganismos Elia Martínez Esteve, Víctor Manuel Chapero Ciurana, Franziskus Hauth 12.05.2017 Facultad de Enología Departamento de Bioquímica y Biotecnologia Profesora: Nuria Boronat Figuerola Informe de prácticas Metabolismus de microorganismos (2017) Parte | I Índice Índice .................................................................................................................................................................................... I 1.
Práctica 1: Respiración aerobia/fermentación (O/F) ...................................................................................... II 1.1 Objetivos ...................................................................................................................................................................... II 1.2 Fundamentos ............................................................................................................................................................... II 1.3 Resultados .................................................................................................................................................................... II 1.4 Discusión de resultados ............................................................................................................................................ IV 2.
Práctica 2: Actividad enzimática extracelular microbiana ............................................................................ IV 2.1 Objetivo ...................................................................................................................................................................... IV 2.2 Fundamento ............................................................................................................................................................... IV 2.3 Procedimiento ............................................................................................................................................................ IV 2.4 Resultados y discusión ................................................................................................................................................V 3.
Práctica 3: Fermentación heteroláctica .......................................................................................................... VII 3.1 Introdución ............................................................................................................................................................... VII 3.2 Materiales y métodos.............................................................................................................................................. VIII 3.3 Resultados ................................................................................................................................................................... IX 3.4 Discusión ..................................................................................................................................................................... X Bibliografía ........................................................................................................................................................................ XI Informe de prácticas Metabolismus de microorganismos (2017) Parte | II 1. Práctica 1: Respiración aerobia/fermentación (O/F) 1.1 Objetivos El objetivo de la práctica era determinar la capacidad respiratoria aerobica o fermentativa de diferentes tipos de bacterias en medios con glucosa o lactosa, observando la producción de gases en forma de pequeñas burbujas o ácidos. 1.2 Fundamentos Con el medio Hugh-Leifson seremos capaces de de evaluar de forma visual el metabolismo oxidativo y/o fermentativo de el microorganismo en presencia o ausencia de los distintos sustratos. La bacteria cultivada por nuestro grupo es E. Coli, es una bacteria gram-negativa, anaerobia facultativa y ampliamente estudiada y conocida. Se puede encontrar en el tracto intestinal de casi todos los mamíferos sanos, donde establece una relación de comensalismo. En un medio semisólido con agar se simulan tres condiciones: Control negativo del crecimiento a 4ºC y en presencia de oxigeno; Condicion de respiración a 37º y finalmente condición de anoxia (Conseguida con un tapón de agar y vaselina) a 37ºC. Además, cada condición tendrá tres medios distintos: Uno sin azúcares, uno suplementado con glucosa y otro suplementado con lactosa. Se caracterizará el metabolismo energético (Oxidativo o fermentativo) del microorganismo y la capacidad de utilizar determinados carbohidratos (Glucosa y lactosa). Para esta caracterización se tendrá en cuenta: El crecimiento en las distintas condiciones, el consumo de azúcares (Observado con un viraje colorimétrico de verde a amarillo debido a la acidificación del medio) y, finalmente, la formación de burbujas de gas en el medio anóxico debido a la generación de CO2 durante la fermentación. 1.3 Resultados La determinación del tipo de metabolismo respecto a los medios y las condiciones de crecimiento se puede observar en las figuras 1, 2 y 3 de forma cualitativa. Los tubos han sido cultivados durante 24h ya que E. Coli es una bacteria de crecimiento rápido. Informe de prácticas Metabolismus de microorganismos (2017) Figura 1: Cultivos del medio sin azúcares a las 24h.
Parte | III Figura 2: Cultivos de E. coli con glucosa y sin azucares. De izquierda a derecha: Control, aerobiosis y anoxia. Figura 3: Cultivos de E. coli con Lactosa y sin azucares. De izquierda a derecha: Control, aerobiosis y anoxia. Tabla 1: Resultados a tiempo 24h de cultivo de E. coli. pH Crece Gases Ø Básico - Control G Básico - L Básico - Respiración Ø G L Básico Ácido Ácido + + - Fermentación Ø G L Básico Ácido Ácido -* + + + + Ø Los resultados de control son correctos al no detectar viraje en el pH, crecimiento ni aparición de burbujas. Ø Por otra parte, en presencia de oxigeno vemos crecimiento y viraje colorimétrico en los medios suplementados con glucosa y lactosa, aunque no se aprecia un crecimiento significativo en el medio sin azúcares. Ø En condiciones de anoxia observamos crecimiento en los medios de glucosa y lactosa. En el medio sin azucares se aprecia un leve viraje colorimétrico que puede indicarnos un crecimiento a niveles bajos. Asimismo observamos la formación de pequeñas burbujas en el medio de glucosa y de lactosa, aunque mucho más apreciables en el medio de glucosa. Informe de prácticas Metabolismus de microorganismos (2017) Parte | IV 1.4 Discusión de resultados El microorganismo estudiado presenta una amplia variabilidad catabólica que le permite vivir en diferentes hábitats y bajo diferentes presiones abióticas, ya que es capaz de vivir con y sin oxígeno a partir de diferentes fuentes de carbono. Estas capacidades son debidas a los hábitats naturales de estas bacterias, es decir, los tractos intestinales de los mamíferos. 2. Práctica 2: Actividad enzimática extracelular microbiana 2.1 Objetivo Determinar la capacidad de secreción de exoenzimas hidrolíticas capaces de degradar polisacáridos, como el almidón, o proteínas, como la caseína, en los microorganismos Escherichia coli y Bacillus megaterium mediante un ensayo visual. 2.2 Fundamento Los microorganismos están rodeados por una membrana semipermeable que no puede ser atravesada por algunas macromoléculas, como es el caso de polisacáridos, lípidos o proteínas. Algunos de estos compuestos, como por ejemplo la caseína o el almidón, son utilizados como sustrato para el crecimiento celular. Para ello, los microorganismos presentan exoenzimas, que son secretadas al exterior de la célula. De esta forma la macromolécula es degradada y sus monómeros, moléculas más simples, serán transportados al interior celular, donde serán utilizados como alimento. 2.3 Procedimiento Se evaluará la actividad enzimática extracelular tanto en E. coli como en B. megaterium. Para ello, inoculamos ambos microorganismos en dos tubos diferentes con 5 mL de medio TSB. Incubamos durante 24h en la estufa a 30oC. Posteriormente, sembramos por estría ambos microorganismos en placas de Petri agar-almidón y agar-caseína. Las cuatro placas fueron incubadas durante 48h en la estufa a 30oC. Una vez pasado este tiempo, se procedió a la observación de los resultados Informe de prácticas Metabolismus de microorganismos (2017) Parte | V 2.4 Resultados y discusión Tras incubar las placas 48h, se observaron para determinar la presencia o ausencia de zona de proteólisis. Hidrólisis de la caseína En el caso de las placas agar-leche, es posible observar la presencia de actividad enzimática extracelular de forma directa, ya que alrededor de la zona de siembra aparecerá un halo transparente. Figura 4: Placas agar-caseína con inóculos de E. coli y B. megaterium respectivamente. Encontramos la etiqueta ‘midó’ en ambas debido a una confusión a la hora de rotularlas. Tal y como muestra la figura 1, sólo hubo proteólisis de la caseína debida a la liberación de exoenzimas en el caso de las colonias de Bacillus megaterium. Informe de prácticas Metabolismus de microorganismos (2017) Parte | VI Hidrólisis del almidón Para valorar la actividad proteolítica en las placas de agar-almidón es necesario teñir previamente con lugol. Figura 5. Placas de agar-almidón con inóculos de B. megaterium y E. coli respectivamente.
Tras esperar 30’ y retirar el exceso de reactivo, observamos un halo transparente únicamente alrededor de las colonias de B. megaterium, hecho que nos permite comprobar la existencia de degradación enzimática del almidón que contiene el medio de cultivo. Tabla 2: Resumen de los resultados obtenidos de la observación de las placas. Microorganismo E. coli B. megaterium Hidrólisis del almidón Hidrólisis de la caseína Aspecto del Resultado Aspecto del medio Resultado medio Oscuro Blanco opaco Halo amarillo + Halo transparente + Informe de prácticas Metabolismus de microorganismos (2017) Parte | VII 3. Práctica 3: Fermentación heteroláctica 3.1 Introdución Leuconostoc mesenteroides fue aislado por primera vez en 1878 por van Tieghem y pertenece al grupo de las bacterias lácticas. Es un coco sin movilidad y no forma esporas. Es anaerobio facultativo y normalmente catalasa y oxidasa negativo. Como un típico requerimiento de las bacterias lácticas, necesita un medio muy complejo con suplementación de factores de crecimiento y aminoácidos en cultivos. Por eso también crecen muy lento. L. mesenteroides utiliza una combinación de las vías pentosa fosfato y phosphoketolase y por eso es heterofermentativo y interesantemente es capaz de convertir azúcares como manitol y dextrano (Cogan und Jordan 1994). Leuconostoc no presenta en su metabolismo el ciclo de krebs o una sistema citocromo y por eso no pueden obtener energía por fosforilación oxidativa. Por eso ganan energía utilizando la fermentación de azúcares (como glucosa, fructosa, galactosa, sacarosa o maltosa) a ácido láctico, etanol o acetato y CO2. Asombrosamente no puede utilizar lactosa fácilmente. En figura XY se encuentra un esquema del metabolismo primario de L. mesenteroides (Dols et al. 1997; Cogan und Jordan 1994). La temperatura óptima de un cultivo de Leuconostoc mesenteroides está entre 20 y 25°C y por eso pertenece a los organismos mesófilos. El pH óptimo para el crecimiento está entre 6,2 y 6,5, pero es un organismo ácido-tolerante. En 2009 el genoma de la cepa Leuconostoc mesenteroides ssp. cremoris (ATCC 19254) fue secuenciado completamente. Informe de prácticas Metabolismus de microorganismos (2017) Parte | VIII En cuanto a la aplicación industrial, Leunostocs se utiliza en la fermentación de vegetales, leche, vino y carne porque produce diacetyl y por eso da sabores especiales. También algunos miembros del grupo son utilizados como probióticos (Eitinger et al. 2007). El objetivo de la práctica fue conocer el básico del metabolismo de L. mesenteroides y aprender el manejo de microorganismos en el laboratorio. 3.2 Materiales y métodos Las materiales y métodos utilizados y el procedimiento es el indicado en las instrucciones de las prácticas de metabolismo de microorganismos del año 2016-2017. Para empezar una solución de L. mesenteroides fue entregado por los coordinadores de las prácticas. La absorbancia óptica (OD600nm) fue medida por métodos espectroscópicos y el pH por un pH-metro. De una serie de diluciones, las diluciones 10-4, 10-5, 10-6 fueron sembrados en placas de medio MRSA. Una muestra del cultivo inicial fue incubado por 48 horas a 30°C y después el mismo proceso fue aplicado. En este caso las diluciones 10-6, 10-7 y 10-8 fueron sembradas. Por la fórmula 1 el número de las unidades formando colonias por mililitro (UFC/ml) fue determinada. 𝑛𝑑𝑙∗𝑉 (1) n es el número de colonias contadas, dl la dilución y V el volumen de la muestra sembrada. Con un kit comercial de la empresa alemana Roche (Boehringer Mannheim/R-Biopharm) fue determinado el contenido de D- y L- ácido láctico después de las 48 horas de incubación siguiendo los pasos del kit. La fórmula para evaluar el contenido se encuentra en la guía del kit comercial: 𝑐'()*+,-+ *+-/ = 1.345 𝑐:(𝑙𝑎𝑐𝑡𝑖𝑐 *+-/ = 1.3>? 6 6 ∗ 𝛥𝐴4,1 ∗ 𝑑𝑙 (2) ∗ 𝛥𝐴1,> ∗ 𝑑𝑙 (3) ε es el coeficiente de extinción de NADH que es un producto de la reacción del kit comercial. 𝛥𝐴 es la diferencia de absorción entre los diferentes pasos de la reacción indicado en la guía. dl es el factor de dilución utilizado de la solución bacteriana. Informe de prácticas Metabolismus de microorganismos (2017) Parte | IX 3.3 Resultados En la Tabla 1 se muestran los resultados obtenidos. La densidad óptica después de 48 horas fue determinado por una dilución 10-1 ya que la OD600nm se encontró fuera del rango de sensibilidad del espectrofotómetro. Tabla 3: Valores de DO y pH medido inmediatamente y después de 48 horas de cultivos de L. mesenteroides. t DO pH 0h 0,011 6,99 48 h 2,92 4,63 La cantidad de UFC se refiere a las células sembradas sobre la superficie de una placa de cultivo. Por éste método se necesitan en una placa más de 25 colonias para obtener valores significativos. En las placas sembradas con la solución de 0 horas solo se encontraron suficientes colonias en la dilución de 10-6. Con la fórmula 1 la UFC fue determinado: 𝑛 65 𝑈𝐹𝐶 = (? = 6,5 ∗ 10? 𝑑𝑙 ∗ 𝑉 10 ∗ 0,1 𝑚𝑙 𝑚𝑙 En las placas después de 48 horas (véase Figura 1) no se encontraron suficientes colonias para determinar la UFC. -6 Figura 6: Placas de L. mesenteroides después de 48 horas de crecimiento. 100 µl de diferentes diluciones (10 , 10 7 -8 , 10 ) de una solución bacteriana fueron sembrado. - Informe de prácticas Metabolismus de microorganismos (2017) Parte | X Las absorciones y el contenido determinado por fórmula 2 y 3 de D- o L- ácido láctico se muestra en tabla 2. El factor de dilución fue 25. Tabla 4: Absorciones espectroscopios en 365 nm y contenidos calculados de ácido láctico. Absorción [365 nm] A1= 0,115 D-ácido láctico [g/L] 2.018 3.4 A2= 0,672 ∗ (0,672 − 0,115) ∗ 25 L-ácido láctico [g/L] 2.036 3.4 = 8,26 ∗ (0,680 − 0,672) ∗ 25 = 0,11 A3= 0,680 3.4 Discusión Como podemos ver del aumento de la densidad óptica de 0,11 a 2,92 L. mesenteroides ha crecido muy rápido durante la cultivación. Eso va en acuerdo con los resultados del pH, el cual ha bajado de 6,99 a 4,63. Durante su crecimiento L. mesenteroides produce más y más ácido láctico a causa de su metabolismo fermentativo. Las placas sembradas presentan resultados contradictorios. En las placas sembradas con las diluciones de 10-4 a 10-6 con el cultivo inicial sólo se encontraron suficientes bacterias para calcular un valor representativo en la placa de la dilución 10-6. Aparte de eso tampoco se encontraron suficientes bacterias en las diluciones después de 48 horas, lo cual es opuesto al aumento de la densidad óptica. Los resultados del cálculo del contenido del D- o L- ácido láctico están de acuerdo con los resultados mencionados. Por la producción del ácido el pH baja. Como L. mesenteroides no es capaz de formar la isoforma L el contenido calculado está cerca de zero. La cantidad producida se calcula por el error del espectrofotómetro que no es suficiente sensitivo, así que las absorciones A2 y A3 (0,672 y 0,680) pueden ser aceptadas como igual. Informe de prácticas Metabolismus de microorganismos (2017) Parte | XI Bibliografía Cogan, Timothy M.; Jordan, Kieran N. (1994): Metabolism of Leuconostoc Bacteria. In: Journal of Dairy Science 77 (9), S. 2704–2717. DOI: 10.3168/jds.S0022-0302(94)77213-1.
Dols, M.; Chraibi, W.; Remaud-Simeon, M.; Lindley, N. D.; Monsan, P. F. (1997): Growth and energetics of Leuconostoc mesenteroides NRRL B-1299 during metabolism of various sugars and their consequences for dextransucrase production. In: Applied and environmental microbiology 63 (6), S. 2159–2165.
Eitinger, Thomas; Fuchs, Georg; Schlegel, Hans Günter (2007): Allgemeine Mikrobiologie. 8., vollst. überarb. und erw. Aufl. Stuttgart, New York: Thieme.
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