Tema 1 (2013)

Apunte Español
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Bioquímica - 2º curso
Asignatura Tècniques Instrumentals Avançades
Año del apunte 2013
Páginas 12
Fecha de subida 17/10/2014
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Judith González Gallego María Monteserín Cuesta Técnicas instrumentales avanzadas T1 UNIDAD 1: MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA INTRODUCCIÓN A LA MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA La microscopia electrónica no es una técnica en la que la observación sea directa ya que hace falta hacer modificaciones a las muestras para poder observarlas. Además, estas modificaciones son bastante exhaustivas.
Para observar las moléculas biológicas hace falta deshidratarlas previamente i también hay que marcarlas con metales pesados para poder ver su estructura.
Por otra parte, veremos dos técnicas especiales de formación de imágenes: el microscopio de efecto cuántico y el microscopio de fuerza. Ambos microscopios, especialmente el segundo, nos permiten ver la muestra sin teñir ni deshidratar, la cual cosa nos aportará ventajas que posteriormente veremos.
También veremos el microscopio de efecto túnel que tiene unas aplicaciones limitadas pero cada vez más importantes en los ámbitos físicos y nanotecnológicos.
COMPARACIÓN ENTRE MICROSCOPIO ÓPTICO Y ELECTRÓNICO El microscopio es un instrumento que nos permite obtener una imagen aumentada de un objeto.
Por una parte, el microscopio óptico utiliza la radiación electromagnética de la luz visible para obtener la imagen de la muestra biológica. Pero para estudiar estructuras más pequeñas es imprescindible el uso del microscopio electrónico (ME).
Realmente, microscopio óptico y electrónico son muy similares; en ME se utilizan electrones en vez de rayos de luz y como lentes encontramos unos electroimanes.
En la imagen izquierda podemos ver una comparación de las unidades básicas de los microscopios óptico y electrónico de transmisión (TEM).
Tal y como habíamos dicho anteriormente, ambos microscopios tienen muchas unidades básicas en común y realmente, el siguen el mismo esquema general.
En ME, cuando los electrones pasan a través de la preparación, algunos de los electrones son difractados y es en este momento cuando se crea la imagen que es proyectada en una pantalla sensible a los electrones.
1 Judith González Gallego María Monteserín Cuesta Técnicas instrumentales avanzadas T1 La longitud de onda (λ) de la radiación de los electrones es mucho más pequeña que la de la luz visible. Se sabe que el poder resolutivo de un microscopio es inversamente proporcional a λ de manera que, la resolución obtenida con el microscopio electrónico es mucho más grande que la conseguida con el óptico.
Recordamos que el poder de resolución es la capacidad de diferenciar dos puntos que están muy juntos entre ellos, es decir, el grado de detalle de una imagen. Tanto en ME como en MO, el poder de resolución disminuye con la manipulación y la preparación de la muestra. Se sabe que en el caso de ME, la resolución podía llegar a ser subatómica pero debido al funcionamiento de las lentes electromagnéticas esta resolución se ve rebajada.
Características Resolución Magnitud Resolución del ojo humano 0,1 mm 10 Resolución del MO 0,2 µm 10 Resolución ME 0,5 nm 10 -6 -9 Con el MO las estructuras mínimas observables tienen 0,2 µm, es decir, nos permiten observar algunos orgánulos como los cloroplastos (200nm), bacterias (500nm), etc. Con el ME la resolución aumenta hasta el punto de poder ver objetos de 0,5 nm y por lo tanto sustancias de tamaño molecular. Sin embargo, en ME sólo se pueden examinar muestras muy delgadas de manera que hay que elaborar unos cortes ultrafinos y una bacteria ya sería demasiado gruesa para observarla directamente.
EL MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE TRANSMISIÓN: UNIDADES BÁSICAS Dentro del microscopio electrónico podemos diferenciar el de barrido y el de transmisión. Una ventaja que ya habíamos nombrado sobre los ME’s frente los MO es que en los primeros la λ del haz de luz es aproximadamente 1/200, la cual cosa aumenta la resolución.
Los principios básicos para obtener una imagen de una muestra en un microscopio electrónico son: 1.
Encontramos un filamento de tungsteno en forma de horquilla y que emite electrones por un efecto termoiónico, es decir por calor.
2.
Un sistema de lentes electromagnéticas condensadoras focalizan el haz de electrones sobre una zona muy pequeña de la muestra del orden de µm.
3.
El haz de electrones interacciona con el objeto para formar la imagen.
4.
Los electrones transmitidos son focalizados por un sistema de lentes electromagnéticas formadas por el objetivo que origina la primera imagen y a continuación ampliada por las proyectoras. 7 5.
Los electrones inciden sobre una placa de sulfuro de zinc fluorescente o una placa fotográfica y dan la imagen en blanco y negro que es observable.
2 Judith González Gallego María Monteserín Cuesta Técnicas instrumentales avanzadas T1 Fuente de iluminación o cañón electrónico Como hemos dicho anteriormente la fuente de iluminación es un haz de electrones creado por un filamento de tungsteno.
El filamento es el cátodo y la gran mayoría de los electrones que emite no interaccionan con la muestra. Cerca del cátodo encontramos el ánodo, una estructura perforada por donde pasaran los electrones. Con esto conseguimos que se agrupen y se aceleren.
Entre el cátodo y el ánodo hay una cámara de vacío, esto es debido a que el haz de electrones recorre un trayecto de aproximadamente 1 m durante el cual podría interaccionar con el aire ionizándolo, lo que supondría una pérdida de su energía cinética y en consecuencia su capacidad de interacción con la muestra ya que el haz desaparece. De manera que en -4 -5 la cámara se consigue un vacio de entre 10 - 10 mm Hg.
La diferencia de potencia que se aplica entre cátodo y ánodo para crear el haz se encuentra entre los 20.000 y 200.000 V, usualmente es de 50.000 V.
De forma resumida, los pasos que se producen durante el proceso de iluminación son: 1.
Aplicación de un alto voltaje.
2.
Emisión termoiónica de los electrones.
3.
Aceleración de estos electrones.
4.
Formación de un fino haz de electrones.
Lentes electromagnéticas Las lentes electromagnéticas son unas bobinas por las que circula una corriente eléctrica. Se genera un campo magnético radial que puede modificar la trayectoria del haz de electrones. El movimiento de los electrones por el interior de la lente es helicoidal.
Encontramos lentes electromagnéticas muy similares a las que encontramos en microscopio óptico tanto las condensadoras, del objetivo y del ocular.
Esquema general La pantalla fluorescente es la que nos permite formar la imagen. Por otra parte, los chips fotosensibles nos dan la oportunidad de modular la visibilidad, el contraste i la resolución. Por ejemplo, con una buena regulación podemos ver el DNA en perpendicular si realizamos una tinción con acetato de uranio.
Los chips fotosensibles son más cómodos de utilizar y la observación se realiza a partir de un monitor.
Las lentes electromagnéticas nos permiten corregir las aberraciones. Si están correctamente moduladas podemos llegar reducirlas totalmente. Observamos en la imagen como está todo alineado en un eje común.
3 Judith González Gallego María Monteserín Cuesta Técnicas instrumentales avanzadas T1 Una de las causas de las limitaciones de la microscopia de las muestras biológicas es el hecho que, como se tiene que -4 realizar un vacio inferior a 10 mmHg, hace falta deshidratar las muestras y con esto hay una pérdida de la información in vivo. El hecho por el cual no las podemos meter en el microscopio hidratadas es porque explotarían o colapsaría. De manera que hace falta preparar la muestra adecuadamente para mantener al máximo la estructura real de la muestra.
La variación de los aumentos que conseguimos con el microscopio electrónico oscilan entre los 1000X y los 200.000X. Otro motivo por el que el poder resolutivo real es más bajo que el teórico reside en el hecho que las lentes tienen imperfecciones.
Formación de la imagen Cuando el haz de electrones interacciona con los átomos del objeto para formar la imagen, un porcentaje importante de ellos atraviesan la muestra sin ser desviados y el resto son difractados en todas las direcciones. De estos últimos, los electrones dispersados con un ángulo pequeño respecto al eje central interferirán con los no desviados para dar la imagen proyectada de la muestra.
La imagen proyectada está formada por puntos blancos y negros que representan puntos de máxima y nula interferencia de electrones y siguen un patrón u otro en función a la distribución atómica del objeto. Es decir el % de electrones 2 dispersados depende de la densidad de átomos de la muestra i de su tamaño (α =Z , la dispersión es el número atómico al cuadrado). Las zonas más oscuras son las más densas, es decir, donde hay más átomos.
Los átomos de bajo número atómico no dispersan bien las muestras. De manera que, las muestras biológicas están formadas principalmente por: C, N, O, H… es decir, elementos de bajo n° atómico no pueden ser observadas directamente ya que no veríamos nada (dispersión mínima). Es por este motivo por el que hay que tratar la muestra con tinciones específicas de metales pesados como plomo y uranio y así conseguir aumentar su poder de dispersión.
4 Judith González Gallego María Monteserín Cuesta Técnicas instrumentales avanzadas T1 Soporte de la muestra La muestra debe de depositarse sobre un soporte ya que si no lo hiciéramos, cuando los electrones la atravesasen esta se deformaría. Este soporte son unas rejillas de cobre metálicas que contienen 400 casillas de 3 mm de diámetro. Justo encima de ellas se colocan unas fibras de celulosa o bien de carbono de un grueso de unos 10-20nm. Normalmente se emplea el carbono ya que es un elemento muy ligero que no dispersa los electrones, la cual cosa evita que las muestras se rompan, además es un elemento que posee una resistencia mecánica aceptable. Además disminuye la relación señal – ruido. Estos films tienen que estar formados por 2 compuestos de elementos de bajo n ° atómico ya que recordemos: α =Z .
(Formvar es la película del soporte, en clase no parece que se haya nombrado) Las rejillas no se pueden comprar ya que con el tiempo se estropean, de manera que hay que elaborarlas y esto puede llevar mucha faena. Primero hay que preparar el film, de carbono en la gran mayoría de casos, y después unir-lo con la rejilla.
Para preparar el film se utilizan evaporadores que son unas campanas de vidrio que generan -4 un alto vacío (10 mmHg). En el interior encontramos terminales eléctricos que tienen un gran amperaje y una plataforma que suele ser un portaobjetos sobre la cual se forma el film de carbón y que luego será traspasado a la rejilla de cobre. Se produce un arco voltaico entre el carbono y como la superficie de contacto es mínima se crea una gran resistencia. Un aumento de la temperatura en las resistencias (situadas donde el arco voltaico) provocará que el carbono se evapore.
Para separar el film desde el portaobjetos hasta la rejilla se hace con un cristalizador lleno de agua en el cual se obliga al soporte que contiene el film que contacte con el agua y que quede flotando.
Si vaciamos el agua de la cubeta, el film quedará depositado sobre la rejilla. En la imagen de la derecha vemos como a partir de un solo film podemos recubrir más de una rejilla a la vez.
Recordar que el film también puede estar hecho de una fibra de celulosa como parlodion.
5 Judith González Gallego María Monteserín Cuesta Técnicas instrumentales avanzadas T1 MEJORA DEL CONTRASTE Muchas muestras las tenemos que teñir para así aumentar la dispersión de sus electrones y que la imagen que obtengamos sea buena. De manera que veremos la imagen gracias a la distribución de los metales pesados y no de la muestra. Los colorantes más importantes y utilizados para mejorar el contraste son el Platino (Pt), Uranio (Ur), Osmio (Os). Estos metales se pueden aplicar de varias formas: Formación de réplicas Depositar una capa del metal sobre la muestra. Para observar superficies.
Sombreado metálico Multidireccional.
Unidireccional. Nos permite medir alturas y sin esta técnica seria un proceso complejo.
Tinción positiva Tinción negativa Se observa aquello donde no hay muestra.
Tinción de ácidos nucleicos Combina la tinción positiva y negativa.
A veces encontramos limitaciones a la hora de mejorar el contraste. A veces, la distribución del metal pesado no es informativa ya que es poco heterogenia. Además, hace falta deshidratar siempre la muestra.
Por otra parte, encontramos algunas muestras que no se tienen que teñir ya que ya contienen metales pesados. Un 2+ ejemplo son las metaloproteínas como la ferritina que se encuentra unida a Fe .
Las tinciones con metales pesados se realizan con componentes como el acetato de uranio, el tetraóxido de osmio (sobre todo para membranas) o el platino (para realizar sombreado).
Formación de réplicas Las réplicas son finas capas de metal que sirven para observar la superficie de las muestras. Sobre muestras previamente deshidratadas se depositará una fina capa de platino, mediante un evaporador, y además un film de carbono grafito para reforzar la muestra.
Hay que tener en cuenta que el platino tiene que llegar a las superficies más altas de la muestra para obtener una imagen correcta. Por otra parte, la capa de grafito no tiene que ser muy gorda ya que si lo es, después habrá mucho ruido que no permitirá ver una imagen nítida.
Después de tener ambas capas sobre la muestra, trasladamos la réplica a la superficie de una rejilla, siguiendo el mismo método de un recipiente con agua. Para depositar el platino utilizaremos un evaporador de platino (sigue el mismo esquema que el evaporador de carbono de la página 5) de manera que sobre la muestra quedará una fina capa.
Seguidamente, cambiaremos las resistencias de platino por unas e carbón y haremos depositar la capa de carbón.
Tendremos que tener cuidado con el grosor ya que la observación y la dispersión están en función de este.
6 Judith González Gallego María Monteserín Cuesta Técnicas instrumentales avanzadas T1 Deshidratación de la muestra Recordamos que lo primero que debemos hacer es deshidratar las muestras biológicas. Si no lo hiciéramos, cuando platinásemos la muestra la destruiríamos ya que para depositar la capa de platino utilizamos una campana de vidrio al vacío. Tenemos dos métodos que nos permite deshidratar: evaporación al punto crítico y criofractura.
Evaporación al punto crítico En este procedimiento para deshidratar la muestra biológica lo que hacemos es someterla al punto crítico. Definimos punto crítico como la temperatura por sobre de la cual no se puede licuar un gas, sea cual sea la presión ejercida.
El gas que se utiliza para realizar esta evaporación es el CO 2 ya que tiene un punto crítico bajo de manera que es fácil licuarlo a temperaturas inferiores a 32 °C.
El procedimiento a realizar es: 1.
Sustituimos el agua de la muestra por etanol. Este procedimiento se hace de manera escalonada en concentraciones crecientes de etanol. Este es el paso más delicado.
2.
Seguidamente, sustituimos el etanol por CO2 líquido. Con esto conseguimos que la célula mantenga su forma original.
Este parte del procedimiento no suele dar nunca problemas.
3.
A continuación, evaporamos el CO2, manteniendo la presión y subiendo la temperatura a 32 °C.
Este método nos permite, siempre y cuando se realice correctamente, mantener la integridad de la célula y de sus componentes, de manera que posteriormente obtengamos imágenes fidedignas.
Criofractura La congelación con nitrógeno líquido no altera la muestra y además se infiltra en el tejido un crioprotector de glicerol y sacarosa. Nos permite observar superficies con un nivel de detalle extraordinario.
1.
Congelamos la muestra con nitrógeno líquido (-198 °C). De la cual cogeremos el pellet.
2.
Obtenemos un cristal congelado con la muestra en el interior. En este caso observamos en la imagen fagos.
3.
Rompemos el cristal por la mitad con un martillo mediante un golpe seco. Esto da lugar a dos superficies de fractura.
3.1. El fago se podría romper cuando damos el golpe de martillo pero normalmente este queda a un lado u a otro de manera que tendremos la parte positiva (parte donde está el fago) y la negativa (parte donde está la silueta del fago).
7 Judith González Gallego María Monteserín Cuesta 4.
Técnicas instrumentales avanzadas T1 Seguidamente, mediante un evaporador refrigerado al vacio, a unos -80 °C /-90 °C, evaporamos el metal (Pt) sobre el hielo. El evaporador está a bajas temperaturas para mantener así la identidad de las superficies en el hielo.
4.1. Hay un problema y es que cuando introducimos el hielo en el vacio este sublimará. De manera que, no nos podemos entretener mucho para evitar la pérdida de información por sublimación del hielo.
La criofractura es un método muy aplicado en el estudio de bicapas lipídicas. Las bicapas tienen un punto de fragilidad que hace referencia al lugar por donde se tocan los ácidos grasos. De manera que son muy sensibles a las fuerzas de cizalla y la bicapa se abre fácilmente en las dos capas.
Consideramos que la congelación no afecta a la estructura ya que la congelación es muy repentina. Pero por si acaso añadiremos una sustancia persevante: un 5% de glicerol, sacarosa… Sombreado metálico Sombreado unidireccional Para el sombreado metálico unidireccional la muestra se deposita sobre el film de la rejilla y se sitúa en una cámara de vacío para proceder a la tinción evaporando un metal pesado por efecto térmico, como por ejemplo el platino. La evaporación del metal pesado sobre la muestra tiene lugar en unas condiciones de vacío que determinan que los átomos sean proyectados linealmente con un ángulo definido y recubrirán toda la superficie de la rejilla – soporte y la muestra, excepto la sombra que ésta proyecta.
El fundamento de formación de la imagen al microscopio electrónico es el mismo que el de la técnica de tinción negativa (la veremos más adelante): los electrones son dispersados por la película de metal pesado y la sombra es transparente al haz.
Con esta técnica podemos obtener información sobre la forma y dimensiones de la partícula biológica. Para ello debemos calcular experimentalmente la longitud de la sombra (d) y saber con qué ángulo hemos platinado (α). De manera que podemos calcular la altura de la partícula como: .
Si la muestra colapsa puede que la altura no se corresponda a la real. Hay que tener en cuenta que la muestra tiene una capa por encima del metal pesado de manera que la altura será ligeramente más grande a la real.
8 Judith González Gallego María Monteserín Cuesta Técnicas instrumentales avanzadas T1 Sombreado multidireccional En el caso del sombrado multidireccional sí que giraremos la muestra durante el proceso de platinación. El grosor de la capa de platino dependerá del seno del ángulo incidente sobre la muestra. De manera que habrá más grosor cuando el seno se aproxime a uno, es decir, cuando el ángulo sea de 90°. A las protuberancias de la muestra encontraremos más cantidad de metal depositado.
Tinción de la muestra Tinción positiva La tinción positiva consiste en la asociación estable de un catión metálico con la muestra. Para realizar la tinción se requiere un tiempo de unos 5 – 10 minutos y una concentración elevada de colorante que suele ser acetato de uranilo al 1%.
Posteriormente, se lava la muestra con agua para eliminar el colorante sobrante, es decir, el que no se ha unido a la muestra.
Los cationes metálicos del colorante se unirán a las zonas de la muestra con una elevada densidad de carga negativa. Es por este motivo que hay algunas muestras que no se pueden teñir con este método ya que en algunos casos las muestras pueden tener baja carga negativa y por lo tanto que al realizar el lavado se pierdan las interacciones con el colorante. También es desfavorable una distribución homogénea de la carga negativa ya que no hay una tinción diferencial. De manera que la tinción positiva en algunos casos no es informativa como en los fagos donde no podremos captar ninguna característica estructural.
Tinción negativa En el caso de tinción negativa, la muestra se trata con cationes metálicos a una concentración baja, es decir, 0,1% – 0,2% de acetato de uranilo durante poco tiempo, del orden de segundos. En este caso no se realiza lavado. De manera que esta tinción evita la asociación estable del colorante con regiones negativas de la muestra.
Se llama tinción negativa porque no observamos directamente la muestra sino los sitios donde no la encontramos. Si el colorante está en exceso es desfavorable ya que se podría confundir con la tinción positiva.
Con papel de filtro absorberemos la gota de colorante que hay sobre la muestra situada en la rejilla. Gracias a esto se formará un film de disolución. Quedará un film restringido por capilaridad y en el microscopio electrónico veremos el negativo de nuestra imagen. También queda disolución restringida en las hendiduras y esto nos permitirá ver relieves. Por ejemplo, podemos ver el agua retenida en las diferentes subunidades de capsómero de un fago.
La tinción negativa se utiliza mucho en microscopia pero hace falta cumplir los requisitos para obtener una imagen correcta. Si estos no se cumplen, tendremos efectos de tinción positiva.
9 Judith González Gallego María Monteserín Cuesta Técnicas instrumentales avanzadas T1 Por una parte, si la muestra tiene una gran densidad de carga negativa, por mucho que sigamos el protocolo de tinción negativa no saldrá una tinción negativa, sino que obtendremos tinción positiva ya que el colorante se habrá unido fuertemente.
Por otra parte, es indispensable que la muestra sea hidrofílica. Si no lo fuera no el film no se formaría y el tratamiento con agua nos destruiría todo porque ésta no interacciona con la muestra hidrofóbica. De manera que las muestras hidrofóbicas no son teñibles con este método. Hoy en día, se pueden hacer teñibles si se recubren con BSA que es una proteína amfipática que nos permitirá crear una capa macromolecular sobre la muestra. Con esto conseguimos que la muestra sea más hidrofílica pero perderemos detalle del orden de del tamaño de la BSA.
La BSA es una proteína del suero sanguíneo que transporta moléculas hidrofóbicas.
Tinción de ácidos nucleicos El DNA es muy difícil de visualizar por microscopia electrónica ya que su sección transversal (20 Å) es muy fina y a demás tiene una elevada relación axial. Esto hace que se enrolle sobre sí misma y forme estructura muy gordas. Con esta tinción conseguimos solucionar los dos problemas. Nos permite diferenciar incluso el DNA de cadena doble del de simple.
Normalmente se suele combinar con un sombreado multidireccional.
El método de Kleinschmidt-Zahn consiste en crear una capa de citocromo C sobre el DNA. Se trata de una proteína de carácter hidrofóbico que se desnaturaliza si la separamos de la membrana pero podemos simular el ambiente lipídico con 1 M de NaCl. En su forma nativa no puede interaccionar con el DNA pero cuando está desnaturalizado sí que puede. Cuando interacciona lo que conseguimos es formar una vaina alrededor del DNA lo que provoca un aumento del diámetro de la sección transversal.
Para realizar esta tinción, en un porta, depositamos una gota de DNA (0,1 mg/ml) juntamente con citocromo C (1 mg/ml) y acetato de amonio 1M. En estas condiciones el citocromo C está en estructura nativa y no interacciona con el DNA.
Seguidamente lo introducimos en agua hasta conseguir que el citocromo C baje en concentración de manera que este se desnaturalice e interaccione con el DNA. De esta manera conseguimos formar un film. A continuación realizaremos un sombreado multidireccional.
10 Judith González Gallego María Monteserín Cuesta Técnicas instrumentales avanzadas T1 Tiempo después de esta técnica se descubrió que la interrupción de las secuencias codificantes por otras no codificantes. La mayoría de genes sí que tienen secuencia no codificante.
El premRNA está formado por exones e intrones y este es la transcripción inmadura del DNA, aun le queda desprenderse de sus intrones. El splicing es el mecanismo por el cual se eliminan los intrones del mRNA. Este proceso es llevado a cabo por unas enzimas que cortan las uniones entre exones e intrones y posteriormente unen la secuencia. De manera que, en el ME veremos un mRNA maduro sin intrones ya que al hibridar el mRNA con el ADN los intrones no encuentran su pareja en el mRNA maduro.
Gracias a los chips podemos ver DNA sin necesidad de hacer tinción Kleinschmidt-Zahn.
TÉCNICAS DE MICROSCOPIA Tanto el microscopio de efecto túnel cuántico como el microscopio de fuerza atómica nos permiten examinar superficies de las muestras sin necesidad de teñir. Ambos tienen una gran resolución pero también tienen algunos inconvenientes ya que el microscopio de efecto túnel presenta problemas con muestras biológicas.
Microscopio de efecto túnel El microscopio de efecto túnel nos permite observar superficies con una gran precisión. Su funcionamiento se basa en una sonda microscópica que sigue la superficie de la muestra a medida que sube, baja y varía su coordenada Z. La sonda es una punta afilada de metal que puede tener el grosor de un solo átomo. La distancia entre las sonda y la muestra siempre es constante.
Este microscopio utiliza un fenómeno de la física cuántica, denominado efecto túnel, para proporcionar imágenes de sustancias conductoras de la electricidad. La sonda se coloca a una distancia de pocos Å de la superficie de la muestra aplicándose un voltaje pequeño entre ellos. La distancia entre aguja y superficie es crítica, llegan a estar en contacto los orbitales de la aguja con los de la muestra. La magnitud del corriente del efecto túnel depende de la distancia entre la superficie y la sonda, el flujo de corriente es mayor cuando la sonda se acerca al material y disminuye cuando se aleja. Esto es debido que a causa de la poca distancia entre el material y la sonda, algunos electrones de la superficie se escapan a través del hueco generando así una corriente.
Si la distancia entre sonda y muestra es más grande que la necesaria para que se produzca el efecto túnel, el microscopio no funcionará. Por otra parte si la distancia es mucho más pequeña que la distancia de efecto túnel se provocaran saltos de electrones, cortocircuitos.
11 Judith González Gallego María Monteserín Cuesta Técnicas instrumentales avanzadas T1 La posición de la coordenada Z a lo largo del tiempo nos permite formar una imagen en el plano X-Y. A medida que el mecanismo de barrido mueve la sonda por encima de la superficie, se ajusta automáticamente a la altura de la superficie para mantener constante la corriente del efecto túnel. Después de varias pasadas hacia delante y hacia atrás se utiliza un ordenador para crear una representación tridimensional del material.
Gracias al microscopio de efecto túnel se han conseguido visualizar imágenes de moléculas como el DNA-Z aunque esta es la única imagen que hemos podido ver. Este microscopio no es útil para observar muestras biológicas ya que las macromoléculas biológicas son muy aislantes, sobre todo las proteínas, que tienen menos conductividad eléctrica que el DNA.
Microscopio de fuerza atómica El descubridor del microscopio de efecto túnel también diseñó el microscopio de fuerza atómica que es útil para observar moléculas biológicas. Con este microscopio también podemos explorar la superficie de la muestra. En este caso se hace bajar la aguja hasta que toque la superficie. A medida que la sonda resigue la superficie de la muestra, los electrones de la sonda de metal son repelidos por las nubes electrónicas de los átomos. Para conseguir que la altura de la sonda se mantenga constante se aplicara una fuerza del orden de 1nN. Podríamos decir que es como un tocadiscos donde la coordenada Z se va modificando. Un sensor registra el movimiento ascendente y descendente de la sonda y esta información es transmitida a un ordenador donde se generará una imagen tridimensional de la superficie de la muestra.
Hay que ajustar la fuerza ya que si es demasiado pequeña, reseguirá la muestra haciendo saltos y por ende ejecutando una mala lectura. En cambio, si la fuerza de la sonda es demasiado alta, podría estropear la superficie. Hay una variante que evita estos problemas: tapping – mode. En tapping – mode, la aguja tiene una energía vibracional que es proporcional a su propia frecuencia de resonancia, De manera que a medida que se mueve va vibrando y así se reduce la posibilidad de dañar la muestra.
En algunos casos, con el microscopio de fuerza atómica tenemos la posibilidad de observar la muestra en condiciones de hidratación biológica.
Como soporte utilizamos la mica ya que es prácticamente lisa. Por otra parte, para obtener precisión de fracciones de Å, utilizamos cuarzo en la aguja que es un material piezoeléctrico. Este hecho nos permite que cuando se dilata o se contrae produce una corriente eléctrica, de igual manera, cuando se le aplica una corriente eléctrica también se dilata o contrae.
Con esto conseguimos una gran precisión.
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