PROCARIOTES - 5 - Control transcripcional (2014)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Genética - 2º curso
Asignatura Biologia Molecular Procariotes
Año del apunte 2014
Páginas 45
Fecha de subida 01/11/2014
Descargas 14
Subido por

Vista previa del texto

CONTROL TRANSCRIPCIONAL Veurem com es controla l’expressió gènica (veurem diferents mecanismes de control i a diferents nivells, tant post transcripcional com transcripcional com post traduccional).
CONTROL TRANSCRIPCIONAL CONTROL PER ATENUACIÓ El control per atenuació és un control en el qual el que es produeix és un acabament prematur de la transcripció – ve a ser un quiero y no puedo. És un control que la cèl·lula té per no produir allò que no necessita. Quan se n’adona que no necessita produir més d’allò, s’acaba la transcripció de forma abrupta i per tant no dóna l’oportunitat de traduir els gens que venen a continuació.
De controls per atenuació en tenim de dos tipus – dependents de traducció i independents de traducció.
CONTROL DEPENDENT DE TRADUCCIÓ La zona implicada en l’atenuació s’ha de traduir.
EXEMPLE 1 – Control per atenuació de l’operó triptòfan d’E. coli Aquest operó està format per una sèrie de gens que sintetitzen triptòfan. En una cèl·lula amb altes concentracions de triptòfan, el transcrit que surt del promotor és 1) – és un transcrit curt que no dóna lloc a la síntesi d’aquells gens que codifiquen pels enzims que necessita la cèl·lula per traduir i obtenir triptòfan. En canvi, quan tens baixes concentracions de triptòfan en la cèl·lula, el transcrit que obtenim és llarg (2) i sí que conté les regions codificants pels gens que codifiquen per les proteïnes que produeixen triptòfan.
A nivell antropocèntric, s’entén perfectament – quan les concentracions són altes, no en produeix (transcrit 1) i quan són baixes sí (transcrit 2). Però, com aconsegueix la cèl·lula acabar abans o després la transcripció en funció del què li interessa? El motiu és que la polimerasa es frena abans o després. Però com? La cosa és quan es frena la RNA polimerasa, i per tant dependrem de terminadors transitoris, que a vegades hi són i a vegades no hi són. Però si la seqüència és sempre la mateixa, què passa? La gràcia de tot el sistema recau sobre una regió petitona situada al costat de la regió promotora que rep el nom d’atenuador. En el cas de l’operó triptòfan, en aquesta regió existeix un petit pèptid anomenat pèptid líder (s’anomena trpL). Aquest pèptid aparentment no té funció descrita fins ara. La gràcia és que en la seva seqüència, al final de tot, incorpora dos aminoàcids triptòfans (UGG-UGG). El triptòfan és un aminoàcid que s’usa poquet en les proteïnes. Per tant, acumular en un pèptid que té molt pocs AA 2 triptòfans i que estiguin un al costat de l’altre és bastant poc habitual. A més a més, aquests dos triptòfans estan a prop de l’stop que codifica per aquest pèptid líder (UGA).
Recapitulem. Trobem 2 triptòfans en el pèptid líder de la regió líder d’aquest mRNA d’aquesta unitat transcripcional que codifica pels gens que codifiquen pel triptòfan. Però la regió líder té 4 regions, és a dir, té 3 regions més a part de la regió que anomenem pèptid líder. Aquestes 4 regions són palindròmiques entre elles, de manera que 1 i 2 es poden plegar formant un bucle, 2 i 3 també i 3 i 4 també.
La gràcia és que no tots els bucles són iguals. El bucle format entre 3 i 4 acaba en UUUU – es tracta d’un bucle terminador, acabarà amb la transcripció (recordem el mecanisme Rho independent, els bucles formats eren molt estables). En canvi, els bucles 1-2 i 2-3 no afecten el pas de la RNA polimerasa; només s’escindirà si es forma el bucle entre les regions 3 i 4.
El sistema dependrà del ribosoma. Com? Nosaltres tenim una RNA polimerasa que va generant el RNA, i es forma el primer bucle. Aquest bucle fa que la polimerasa s’aturi una mica. Quan surt aquest mRNA, apareix el RBS del pèptid líder. Per tant hi haurà ribosomes que començaran a traduir pel trpL. La transcripció continua i llavors podem trobar-nos en dues situacions: - - Alta concentració de triptòfan. Això vol dir que el ribosoma no tindrà cap problema per carregar 2 tRNAs que tinguin triptòfan (recordem que el pèptid líder està en la regió 1). Per tant podrà produir normalment aquesta proteïna. El que passa llavors és que el ribosoma passa per sobre ràpidament –entra, corre pel RNA i surt, quan veu l’stop es desancora. Un cop es desancora, està permetent que 1 i 2 formin un bucle. Si 1 i 2 formen un bucle, 2 i 3 no podran formar bucle però 3 i 4 sí! Per tant, un cop es formi el bucle 3-4, obtindrem el bucle terminador i acabarem tenint el transcrit petit.
Baixa concentració de triptòfan. Quan el ribosoma arriba a la regió dels triptòfans del pèptid líder, com la concentració és baixa, li costarà trobar un tRNA que tingui triptòfans. Per tant, s’entretindrà més estona en aquesta regió, no arribarà tant ràpid a la regió stop – estarà ubicat en la regió 1 un ratet. Per tant, quan el RNA continuï sortint, es formarà el bucle 2-3 ja que la regió 1 estarà amagada sota el ribosoma, de manera que no es pot formar el bucle 3-4 que és el terminador i la transcripció podrà continuar i obtindrem el transcrit llarg.
És un procés d’atenuació dependent de la traducció ja que estem fent que s’acabi la transcripció abans d’hora però necessitem la presència del ribosoma perquè és qui fa que la regió 1 estigui lliure per fer bucle o no. La traducció s’atura quan el ribosoma es desacobla en arribar a l’stop. Per tant el que estem aturant és la transcripció.
Els dos processos es donen quasi simultàniament – el ribosoma està molt enganxat a la RNA polimerasa. Quan el ribosoma es desacobla, la RNA polimerasa està produint RNA – en el moment que surt el RBS, el ribosoma ja està enganxat. Mentre el ribosoma està en 1, la polimerasa ja ha transcrit 2 i 3 però encara no 4, i així es poden formar els bucles entre 2 i 3.
Molts operons que codifiquen per altres AA funcionen igual – tots ells en els seus pèptids líders inclouen l’AA que és sintetitzat per aquell operó.
EXEMPLE 2 – Control per atenuació de l’operó bgl d’E. coli Aquest operó està implicat en la incorporació i degradació de β-glucòsids (són una alternativa energètica als glúcids). L’expressió d’aquest sistema està regulada per un antiterminador. La cèl·lula regula la presència d’aquests gens implicats en la degradació de β-glucòsids en funció de la quantitat intracel·lular de β-glucòsids – la cèl·lula no produeix els enzims implicats en la seva degradació a no ser que hi hagi β-glucòsids. També mira si hi ha glucosa o altres sucres que es puguin utilitzar com a font d’energia.
La cèl·lula té un sistema de captació i transport de β-glucòsids que anomenem sistema sensor (codificat pel propi operó).
Aquest sistema veu el que hi ha fora i serà l’encarregat d’incorporar-ne si en detecten. Per tant tenim un receptor encarregat de transportar β-glucòsids a dins la cèl·lula.
El funcionament és per atenuació i el mecanisme per tant és semblant a l’anterior exemple. Es formaran (o no) bucles als laterals de bgl que impediran (o no) l’avanç de la RNA polimerasa.
Podem trobar-nos amb 3 situacions: Quan NO hi ha β-glucòsids al medi de cultiu, un dels gens que forma part del propi sistema bgl anomenat bglG (és el chivato, és la proteïna sensora) es troba fosforilada en 4 punts i és feliç. En l’operó resulta que hi ha 2 terminadors transcripcionals en aquesta regió inicial del transcrit (situació: tenim la unitat transcripcional, l’operó bgl; aquest al final dels transcrit té un terminador transcripcional però al principi també en té dos). Aparentment, doncs, la RNA polimerasa s’hauria d’aturar al principi (pot no veure el primer però veurà el segon i acabarà escindintse) i obtindríem un transcrit molt curt, i no transcriuríem els gens que estan implicats en la degradació de β-glucòsids. Això per la cèl·lula és útil quan no hi ha β-glucòsids.
Quan SÍ hi ha β-glucòsids, el transportador que s’encarrega de veure si hi ha β-glucòsids, els incorpora a l’interior cel·lular.
Recordem que, quan la cèl·lula intenta incorporar qualsevol tipus de sucre, hi posa fosfats – glicòlisi, cicle de Krebs (el primer pas és sempre una fosforilació). Per tant, al β-glucòsid que entri li posarem un fosfat – recordem que bglG té 4 fosfats (cada una de les dues subunitats té dos fosfats); aquest fosfat que té el β-glucòsid per tant ve del bglG, que li donarà al transportador i aquest a la proteïna. Llavors, quan un bglG té 1 fosfat enlloc de 2, canvia una mica de conformació i dimeritza (abans en teníem dos de separats). És a dir, a la que un dels dos blgGs perd el fosfat, bglG és actiu com a dímer i és quan 15/10/14 adquireix la capacitat de ser un antiterminador – bglG reconeixerà en el RNA regions on es troben els terminadors transcripcionals i faran una mica el mateix que feia el ribosoma en l’operó triptòfan – s’hi enganxarà per amagar-los. Quan bglG està ancorat en aquell lloc, no es podrà formar el bucle allà; si el bucle no es forma, no s’acaba allà la transcripció i el transcrit obtingut és un transcrit llarg que contindrà els gens implicats en la degradació de β-glucòsids que és el compost que estàs incorporant de forma massiva i que t’interessa eliminar.
NOTA: L’expressió d’un promotor regulat negativament és una expressió basal – és la mínima expressió que podem obtenir del promotor quan està regulat per tot el que ha d’estar regulat (encara que estigui inactivat). La concentració de bgl no serà mai zero encara que no hi hagi βglucòsids. En funció de com de fortament regulat està, s’acostarà més o menys a 0, però només serà zero quan no hi hagi promotor.
En el nostre exemple tenim una concentració petita de bgl. A poca concentració de β-glucòsids, ja formarem dímers (ja estaran desfosforilats). El primer lloc d’unió serà el primer terminador (és el primer que surt del mRNA), i potser no tenim suficient bgl per tapar el segon terminador. Llavors, el que fa la cèl·lula és produir més bgl i així tapona tant el 1r com el 2n terminador. Vamos que tenim un ajustament molt fi i un funcionament molt i molt xulo .
Quan tenim β-glucòsids i altres sucres. Els dos fosfats que tenim serviran per saber si la cèl·lula ha de començar a gastar β-glucòsids o si és millor que gasti glucosa (a la cèl·lula li interessa gastar altres sucres abans que els β-glucòsids). Si hi ha altres sucres, bglG perd els fosfats i així la cèl·lula rep el missatge de menja altres sucres i després ja menjaràs βglucòsids. El resultat final és que no dimeritza i es fan els bucles terminadors a les regions del principi.
TOTAL. La regulació per atenuació és dependent de traducció quan necessitem que en el mateix transcrit que estem controlant s’hi estigui donant també la traducció per tal que el sistema d’atenuació funcioni.
CONTROL INDEPENDENT DE TRADUCCIÓ En aquest cas, no serà necessària la traducció en la zona atenuada perquè es doni la regulació.
EXEMPLE 1 – Control per atenuació de l’operó triptòfan de B. subtilis.
Tant a B. subtilis com a E. coli hi ha processos d’atenuació en la regulació de la síntesi d’aminoàcids, però en un depèn de la traducció (coli, gram-) i en l’altre, no (subtilis, gram+).
Tenim un operó que conté uns gens implicats en la síntesi de triptòfan i aquests són bastants similars als d’E. coli El mecanisme de regulació també està associat a bucles ja que també trobarem les 4 regions que poden formar bucles entre elles. En aquest cas, no tindrem ni pèptid líder ni ribosoma; la proteïna TRAP serà la que impedirà la formació dels bucles. Aquesta proteïna reconeix una regió concreta de la regió líder del mRNA que codifica per l’operó.
TRAP el que farà és canviar els bucles – farà que el que no era terminador ho sigui i viceversa.
És a dir, la presència de TRAP indica que la cèl·lula té molt triptòfan, de manera que, quan hi ha molt triptòfan, hi haurà una interacció entre TRAP i la regió líder de l’operó triptòfan que provocarà l’aturada de la transcripció per tal que es formi el terminador transcripcional. En canvi, la no unió de TRAP provocarà la generació d’un bucle entre 2 i 3 i això impedirà la formació del bucle terminador.
En groc, tenim la regió que reconeix la proteïna TRAP. Quan la concentració de triptòfan es alta, es dóna la unió entre TRAP i la regió i la cèl·lula atura la seva transcripció quan troba el bucle terminador. Quan la concentració de triptòfan és baixa, la proteïna TRAP canvia, no reconeix la zona i no es forma el bucle terminador.
Què fa que TRAP s’uneixi o no? La proteïna TRAP uneix triptòfans al seu interior (té “t’s” en el seu interior). Si la concentració de triptòfan és suficient, els llocs d’unió del triptòfan estan ocupats, TRAP adquireix una conformació activa per unir-se al RNA i avorta la transcripció dels gens que sintetitzen triptòfan. Quan la concentració de triptòfan no és suficient, els llocs d’unió del triptòfan estan buits, TRAP no adquireix una conformació activa per unir-se al RNA, no es forma el bucle i continua la transcripció dels gens que sintetitzen triptòfan.
Els gram+ es poden trobar en situacions divertides . Si passem la cèl·lula d’un medi mínim a un medi ric en triptòfan, la cèl·lula es trobarà amb molt triptòfan. La situació que es dóna és que, tot i que la cèl·lula té molt triptòfan a l’interior, la despesa que té de triptòfan també és molt alta, ja que metabòlicament n’està gastant molt (està produint moltes proteïnes, està en un medi ric), fins arribar al punt de gastar més triptòfan del que està produint. Llavors, els gram+ tenen una proteïna ANTITRAP que és capaç d’unir-se a TRAP quan TRAP té molt triptòfan en el seu interior. Aquesta unió entre TRAP i ANTITRAP evita que TRAP sigui capaç d’interaccionar amb el RNA. Quan es produiex ANTITRAP? La cèl·lula veu que el que té són tRNAs que codifiquen triptòfans però que estan buits. És a dir, el que tindrem seran tRNAs els anticodons dels quals reconeixeran codons de triptòfans. L’ANTITRAP es produirà quan aquests tRNAs no tinguin enganxat el triptòfan, ja que voldrà dir que, encara que tinguem triptòfan associat a TRAP, la cèl·lula n’estarà consumint més del que té, i el missatge és continua produint-ne que sinó no en tindrem suficient. * TOTAL. Que en gram+ i gram- la síntesi d’AA es regula per atenuació, però el mecanisme és diferent. Tant en + com en -, qui mana és la presència de tRNAs buits de triptòfan. És a dir, no mana tant la concentració real de triptòfan sinó la presència de tRNAs buits. En E. coli el mecanisme estava basat en ribosomes i no incorporen triptòfan, incorporen tRNAs carregats amb triptòfan. El que atura els ribosomes són els tRNAs que no portaven triptòfan, que no eren capaços de reconèixer-los. Per tant, sempre estem ajustant les necessitats de triptòfan a les necessitats de la cèl·lula, i no a la concentració real de triptòfan dins la cèl·lula – podem tenir-ne molt però igualment necessitar-ne encara més perquè la cèl·lula està metabòlicament activa. Només canvia que els gram+ ho fan carregant ANTITRAP i els gram-, amb el ribosoma.
EXEMPLE 2 – Control per atenuació de la síntesi de l’aminoacil tRNA sintetasa de Tyr a B.
subtilis.
L’ancoratge dels tRNAs també pot determinar la formació o no formació de bucles terminadors. Això ho veiem reflectit en aquest exemple.
Els aminoacils tRNA sintetasa són els enzims que carreguen els tRNAs (són els que reconeixen les dues regions al tRNA i carreguen l’AA *). La síntesi d’aquest enzim hauria d’estar coordinada amb la presència de tRNAs buits a la cèl·lula. És a dir, aquesta proteïna hauria d’estar regulada per la presència de tRNAs buits – si tots estan carregats, els missatge és que no cal més proteïna perquè ja en té prou. En canvi si detecta tRNAs buits, se’n sintetitzen.
Com controla la cèl·lula la presència de tRNAs buits? La molècula que ara interacciona amb el mRNA i canvia les estructures dels bucles és el propi tRNA. Tornem a tenir un sistema de bucles (un és terminador, un no). El tRNA interacciona amb el RNA sortint. Quan el tRNA està carregat, el bucle que es genera és terminador, ja que si està carregat vol dir que no cal que se sintetitzi més tRNA. Quan el tRNA està buit i interacciona amb el RNA, es genera el bucle no terminador i es transcriu la proteïna perquè la cèl·lula en necessita.
Aquests sistemes d’interacció de tRNAs estan molt estesos en microorganismes, i hi ha una forma molt senzilla per saber si un RNA està controlat per un Riboswitch: buscant la regió d’interacció del tRNA en el mRNA. Això es busca gràcies a que hi ha una regió en el tRNA que està molt conservada – l’anomenem regió Tbox i és complementària a la regió del tRNA.
Recordem que la regió on s’ancora l’AA és sempre la mateixa, i és la que acaba interaccionant amb el bucle i la que acaba generant els bucles no terminadors.
En la imatge anterior: si aquesta regió interacciona amb això d’aquí, aquesta regió és igual que això (si ho apliques té sentit)(suposo).
Per tant, si veiem en la regió líder d’un mRNA, una regió equivalent a la regió conservada dels tRNAs, té tota la pinta del món que està regulat per un sistema d’atenuació.
EXEMPLE 3: Regulació de l’operó trp de Lactococcus Aquesta regió que és igual en els tRNAs i que la trobem en tots els que estan regulats per atenuació és la que s’anomena Tbox (caixa d’unió del tRNA). La trobem en mogollón d’unitats transcripcionals controlats per aquest sistema.
ATENUACIÓ DELS GENS AMINOACILS tRNA SINTETASA EXEMPLE 3 – Control per atenuació de la síntesi de la metionina.
RIBOSWITCH – interruptors del RNA. Estan definits com elements del mRNA que uneixen metabòlits o ions metàl·lics (ions Mg2+, precursors d’àcids nucleics, cofactors d’enzims i residus d’aminoàcids) com a lligants i regulen l’expressió del mRNA formant estructures alternatives en resposta a aquesta unió per lligand.
El mecanismes per riboswitch funcionen igual que tots els que estan regulats per atenuació, simplement canvia el fet que la molècula que dóna lloc a la regulació d’aquest RNA és un compost determinat; unim determinats metabòlits que permeten la formació d’un bucle terminador o que no es formi i es permeti la transcripció. Això s’usa en la regulació gènica de microorganismes manipulats genèticament. Es diu que tenim dominis d’hectàmers que canvien l’estructura en funció de la presència o absència de certs metabòlits, i aquest canvi permet la formació dels bucles. Aquí tindrem compostos com nucleòtids, glúcids, aminoàcids, (metionines en l’exemple) que permetran canviar la regió líder del mRNA per donar lloc als bucles, enlloc de tenir regions blg o tots els altres que hem vist. És obvi que el metabòlit regulador tindrà a veure amb el que s’està produint o com a mínim regularà una resposta en relació al que s’està produint. Un tRNA es transcriurà o no en funció d’un determinat compost.
S’està investigant, per exemple, la generació d’hectàmers que puguin canviar en funció de certs metabòlits sintètics que permetin encendre i apagar funcions quan a tu t’interessa.
Els riboswitch són importants perquè la resposta en presència del metabòlit és immediata. Si hem de regular un gen i el procés passa per detectar la senyal, produir tal, aturar tal... passa molta estona.
En canvi, amb aquests interruptors, el metabòlit regula directament la transcripció, simplement amb l’increment de la concentració del metabòlit ja es regula la transcripció.
CONTROL PER ALARMONES I RESPOSTES GLOBALS 20/10/14 Són molècules no proteiques de baix pes molecular que estan involucrades en la regulació gènica. Tant la síntesi com la degradació de les alarmones estan catalitzades enzimàticament de manera que els seus nivells intracel·lulars poden ser alterats ràpidament en resposta a estímuls externs – modulen l’expressió dels altres gens.
TETRAFOSFAT DE GUANOSINA – ppGpp El primer cop que es va descriure el van anomenar “magic spot” perquè quan agafaven una cèl·lula i la passaven de medi ric a medi mínim, apareixia un punt que incrementava moltíssim la seva expressió. Com allò apareixia i desapareixia, ho van anomenar “magic spot”. I ya.
El ppGpp intervé en el metabolisme anabòlic de la cèl·lula – això vol dir que està relacionat amb tot el que ha de construir i sintetitzar la cèl·lula per funcionar en aquell entorn. Per tant, és una alarmona que està relacionada amb els operons que codifiquen per síntesis, com ara la síntesi d’AA, de nucleòtids, etc.
El ppGpp modula el que es coneix com a resposta astringent – resposta que sorgeix en la cèl·lula quan pateix retallades #PP. La cèl·lula passa d’un medi ric on quasi no ha de sintetitzar res perquè ho pot captar tot de l’exterior (condicions súper òptimes), a un medi completament contrari. És una resposta d’adaptació a la nova situació; la cèl·lula ha de racionalitzar molt bé el que ha de sintetitzar, invertir en el que necessita per poder amortitzar al màxim els seus recursos.
Quan es disparen? Les respostes astringents es disparen en el moment en que passem d’un medi ric a un medi mínim. També es disparen en absència de compost = auxotròfia d’una cèl·lula – una cèl·lula auxòtrofa és aquella que és incapaç de sintetitzar cert element (per exemple, un aminoàcid – una cèl·lula ThyA- és una cèl·lula auxòtrofa per la timina).
En una cèl·lula salvatge es dispara quan passes de medi ric a medi mínim. En una cèl·lula auxòtrofa pel triptòfan, la resposta astringent es dispararà quan li traguem el triptòfan del medi, perquè per molt que tingui de les altres coses, detectarà que necessita produir triptòfan i, encara que no pugui, intentarà acoblar el seu metabolisme a aquesta necessitat.
En què consisteix aquesta resposta? L’efecte de ppGpp serà: - Bloquejar la síntesi de proteïnes – estem en crisi, tenim pocs recursos.
Un cop no tenim de res, portem els recursos a: o Sintetitzar aminoàcids.
o Degradar proteïnes inútils – d’aquesta manera, tenim més material per sintetitzar els aminoàcids que necessitem.
o Sintetitzar lípids (per la paret i membrana).
o Sintetitzar nucleòtids (RNA i DNA).
o Disminuir la síntesi de ribosomes – controlar que la quantitat de ribosomes és la que necessitem. Com veiem, és la única síntesi que disminueix, la síntesi de la resta d’operons anabòlics augmenta. El motiu és que de ribosomes n’hi ha molts quan creix en un medi ric. Si la liofilitzem, aproximadament un 90% del pes sec són ribosomes.
Per tant, ppGpp canvia el patró de reconeixement de la RNA polimerasa i amb això modularà el programa d’expressió de la cèl·lula. Aquesta interacció amb la RNA polimerasa es dóna de diferents maneres, però el resultat sempre és optimitzar i racionalitzar els recursos.
CICLE DEL ppGpp Com hem dit, la cèl·lula controla la seva síntesi i degradació (la cèl·lula s’ha d’adonar que el medi ha passat de ser ric a ser mínim). Però és important eliminar-ho un cop s’ha superat aquesta situació.
Quan falta algun aminoàcid o quan la concentració d’AA baixa molt en l’entorn cel·lular, la proteïna RelA produeix ppGpp simplement afegint fosfats al GTP o al GDP (utilitzarà els fosfats d’ATP per formar el tetra o pentafosfat de guanosina).
Altres senyals rebudes per la cèl·lula : quan tenim pocs fosfats, pocs àcids grassos, poc ferro o tenim la cèl·lula estressada (xoc osmòtic), la proteïna SpoT també és capaç de generar ppGpp.
Quan la situació retorna a l’estat basal i ja no estem en condicions en que necessitem ppGpp, SpoT recicla el ppGpp i el torna a GTP o GDP.
Com se n’adona la cèl·lula mitjançant RelA de la deficiència d’AA? En una situació normal, un ribosoma sintetitza proteïnes incorporant tRNAs carregats amb AA en el seu interior, i això va fent que la cadena peptídica passi d’un tRNA a un altre i vagi avançant en la lectura dels triplets. Però quan la concentració d’AA disminueix, òbviament s’augmenta la concentració de tRNAs no carregats. Aquests tRNAs segueixen estan en la cèl·lula i el ribosoma els intentarà incloure, el que passa és que aquesta incorporació farà que el polipèptid no es pugui transferir (no es podrà fer cap enllaç peptídic), per tant el ribosoma tal qual entri sortirà (se n’adona que no funciona).
Quan això passa, la velocitat del ribosoma per sobre el transcrit per donar lloc a una proteïna disminueix fins aturarse ja que està esperant rebre un tRNA carregat que permeti avançar en la lectura del mRNA i no n’hi ha. És llavors quan actua RelA, que reconeix la presència de tRNAs buits i el fet que els ribosomes no avancin. Llavors, RelA s’uneix als ribosomes, s’activa i activa la producció de ppGpp.
Un cop això passa i la concentració d’AA és la correcta, ja es podran tornar a carregar els tRNAs amb els AA, ja no quedarà bloquejat l’avanç del ribosoma i RelA deixarà de produir ppGpp.
La forma en que SpoT produeix ppGpp no està tan clara. Se sap que és ella qui ho fa però no se sap exactament com detecta la presència d’aquests compostos.
MECANISME D’ACTUACIÓ DEL ppGpp - MECANISMES DIRECTES o ACCIÓ SOBRE L’ACCÉS DELS NTPs ppGpp és un ribonucleòtid i per tant pot entrar dintre una RNA polimerasa, ja que té 4 fosfats (recordem que la RNA polimerasa incorpora ribonucleòtids en el seu interior). Quan entra (entra perquè la seva concentració és bastant elevada), obtura el canal d’entrada dels nucleòtids ja que està gordo i ocupa més espai.
Com a conseqüència, disminueix la velocitat dels altres nucleòtids – la velocitat de la RNA polimerasa serà més lenta i s’acabarà desacoblant. Per tant, s’atura la transcripció i així la síntesi de proteïnes.
o MODULACIÓ DEL RECONEIXEMENT DE LA REGIÓ PROMOTORA En una situació normal, la RNA polimerasa està unida a la σ que toca (segons les diferents concentracions relatives de les σ) i reconeixerà millor alguns promotors determinats. Quan ppGpp està present, ppGpp interacciona amb la proteïna DksA i, un cop dins, la polimerasa és capaç d’interaccionar amb vàries subunitats σ que reconeixeran promotors de manera diferencial a les σ que hi havia anteriorment (σ reconeix la regió -35 i ajuda en l’ancoratge del -10). Si no hi hagués ppGpp, aquestes σ concretes no tindrien afinitat per la polimerasa, però ara aquestes σ es tornen molt fortes i s’uneixen a la RNA polimerasa de forma més habitual.
Per tant, ara tindrem σ que governaran quins promotors seran reconeguts per la RNA polimerasa en aquesta situació i podràs modular quins promotors afavoreixes i quins no.
Per exemple, els promotors que es veuran afavorits per σ seran els de la generació de lípids i AA (promotors anabòlics). Un exemple dels que no seran reconeguts per aquests seran els promotors dels ribosomes .
MECANISMES INDIRECTES - INCREMENT DE LA DISPONIBILITAT DE LA RNA POLIMERASA En una situació normal (molts aminoàcids, baixa concentració de ppGpp), tindrem promotors forts (com els dels rRNA) i promotors febles (síntesi d’AA), i les polimerases estaran molt ubicades als promotors forts i tindran menys tendència a ubicar-se en els febles.
En quan es dispara la resposta astringent i la concentració de ppGpp augmenta, el primer que passa és que s’atura la transcripció (és com un reset). Llavors, tindrem un pool de RNA polimerases que estaran modulades, i per tant aniran als promotors que abans eren febles.
Control de l’operó rrnB Discriminator – d’alguna manera estem discriminant aquests promotors en presència de ppGpp.
- DISMINUCIÓ DE LA CONCENTRACIÓ DE GTP El ppGpp es produeix a partir de guanines. Aquestes guanines penta/tetrafosfat no es poden fer servir per produir RNAs (necessites que siguin trifosfats). Per tant, la producció de ppGpp gasta guanines, de manera que la concentració relativa de guanines a l’interior cel·lular disminueix. Recordem que els nucleòtids que comencen les unitats transcripcionals són sempre As i Gs – tots aquells RNAs que comencen per G (en el +1), ho tenen més difícil per transcriure’s i disminuirà la seva producció, sobretot perquè quan la RNA polimerasa ha de posar 3 nucleòtids per començar i no els troba si hi ha poca guanina, i això fa que els altres RNAs es facin més ràpidament degut a aquest alentiment.
- MODULANT L’ESTABILITAT DE FACTORS S En una situació normal (creixement cel·lular logarítmic), determinades subunitats σ són degradades utilitzant la interacció amb diferents proteïnes (tenen un recanvi). En la imatge, la proteïna amb la qual interacciona per la seva degradació és RssB. El fet que estiguin unides fa que s’incorpori una proteïna degradadora de proteïnes σ (ClpXP). Per tant, en aquest nivell basal d’expressió, hi ha un equilibri síntesi-degradació constant.
Quan es dispara la resposta astringent, un dels promotors que s’activen és el d’una proteïna que ancora la proteïna RssB. Per tant, tenim una proteïna segresta aquestes RssBs, de manera que la proteïna que vehiculava la degradació de σ disminueix i al final provoca que la concentració de σ augmenti i així es modula el ratio entre aquella σ i les altres.
És a dir, la cèl·lula té diferents σ a diferents concentracions, i tenen totes un ratio entre elles perquè se sintetitzen i es degraden ràpidament (així es mantenen els nivells en equilibri). Cada pool de σ tindrà una proteïna concreta per degradar-la. Però un cop no tens la proteïna que ajuda a degradar una σ en concret (ja que ppGpp no ho permet), tindràs un increment d’aquella σ. Si abans teníem una σ en l’equilibri 10/100 (10 de cada 100 σ era d’aquell tipus), potser ara passa a ser 20/100.
A més, ppGpp no només s’uneix a un segrestador sinó que, en funció de per on s’hagi activat, pot estar activant l’expressió de diferents proteïnes que acaben segrestant i modulant les concentracions relatives de les σ. Per tant, actua sobre el sistema de degradació de les σ, no sobre les σ, i per això és un mecanismes indirecte.
Una de les coses que passen és que, quan ppGpp entra a la RNA polimerasa, bloqueja els seus canals, de manera que s’atura i es desacobla. Però també hem dit que ppGpp incorpora σ noves, i per tant les RNAs polimerases començaran a sintetitzar els transcrits que convingui en funció d’aquestes σ. Però hem dit que ppGpp bloqueja els canals de RNA polimerasa!? El que passa és que la presència de ppGpp no és que taponi el canal d’entrada, sinó que dificulta l’entrada dels nucleòtids, disminueix la velocitat. Però un cop es torni a ancorar, la velocitat ja serà baixa d’entrada, per tant no es desacoblarà.
SÍMIL. Si tu vas a 150 km/h i et trobes un camió, passes de 150 a 80 km/h i et desacobles. Però si tu tens un cotxe petit que ja d’entrada va a 80 km/h, no t’afecta.
El que fa que es desacobli la polimerasa és el fet de detectar una disminució de velocitat. Però una que ja s’acobli directament quan la seva velocitat ja és baixa, podrà arribar fins al final.
ppGpp també avisa d’altres coses i pot activar altres sistemes. Exemples: 1. El fet que canviem d’entorn i passem a un que hi ha pocs nutrients, activem la producció d’antibiòtics ja que així el que hi hagi allà serà per mi i no per altres microorganismes.
2. Pot activar sistemes d’esporulació i protecció (latència a llarg termini).
3. Pot activar mecanismes de virulència o de biofilm (on les cèl·lules són molt més resistents). Molts gèneres associats a virulència (patògens) estan controlats per la resposta astringent – quan es dispara aquesta, comencen a sintetitzar patogenicitat.
Exemple: salmonel·la. Dins de l’hoste, activa una sèrie de gens. La senyal que li permet activar-los és el fet que canviï la concentració de nutrients extracel·lular.
cAMP – AMP cíclic 22/10/14 L’AMP cíclic és un ATP que ha estat ciclat gràcies a l’enzim adenilat ciclasa (Cya). Aquesta resposta està associada al metabolisme catabòlic (degradació de compostos), al contrari del ppGpp.
L’AMP cíclic està associat a la repressió per catabòlit. Què és eso? Hi ha una jerarquia en la degradació de sucres – la presència de glucosa impedeix la degradació dels altres sucres. En E.
coli, la glucosa és qui dóna més rendiment energètic, per tant la degradació de glucosa és prioritària. Un cop s’ha acabat la glucosa, es degraden els altres sucres. Per tant aquí catabòlit és equivalent a glucosa.
Llavors quina és la senyal que fa que se sintetitzin els enzims adequats per la degradació dels sucres pertinents en cada moment? L’AMPc – la cèl·lula detecta AMPc per activar tota aquesta senyal. Com se sap això? En el següent gràfic, veiem representat per uns cercles blancs l’expressió/concentració de β-galactosidasa d’un cultiu en condicions normals, sense glucosa. Veiem que al llarg del temps, va augmentant progressivament. Lògic, ja que si no hi ha glucosa es degrada la lactosa. Si afegim glucosa al medi de cultiu, la β-galactosidasa es para ja que primer s’ha de degradar la glucosa – el pendent canvia . Al cap d’una estona torna a augmentar, ja que la cèl·lula ja s’ha menjat la glucosa que hi havia. En canvi, si afegim glucosa i també afegim AMPc, el pendent és pràcticament igual a la de en condicions normals (sense glucosa).
Per tant, qui està fent veure a la cèl·lula si hi ha glucosa o no és la concentració d’AMPc. Quan hi ha AMPc, la cèl·lula entén que no hi ha glucosa, ja que si afegeixes glucosa i AMPc a la vegada, la cèl·lula es comporta com si no hi hagués glucosa! Com es veu a través de l’AMPc que no hi ha glucosa? Quan la glucosa entra a la cèl·lula, es fosforila. Qui dóna aquests fosfats? Tenim el PEP que fosforila l’enzim I. Aquest enzim I passa el P a la proteïna rica en histidina, i aquesta li passa el P a la proteïna IIA, que li passa a la proteïna IIB que forma part del complex d’incorporació de la glucosa i serà la que acabarà donant el P a la glucosa. La proteïna IIA és específica de cada sucre. Aquí, la de la glucosa dóna el P a la glucosa a través de la proteïna IIB, però a part, també pot interaccionar amb l’adenilat ciclasa per tal que aquest produeixi AMPc (O BÉ FA UNA COSA O BÉ FA L’ALTRA).
Per tant, quan hi ha glucosa al medi de cultiu, la proteïna IIA té més afinitat per IIB perquè incorpori el sucre. Però quan no n’hi ha, li dóna a l’adenilat ciclasa perquè fosforili AMPc. Per això quan no hi ha glucosa les concentracions de AMPc són elevades.
L’AMPc per si sol és una mica tontet i no serveix de molt – per canviar l’expressió dels gens, necessita associar-se a una proteïna anomenada CRP (proteïna de la repressió per catabòlit) o CAP (proteïna activadora de la repressió catabòlit).
Aquest complex AMPc-CRP serà capaç d’interaccionar amb el DNA. Aquesta interacció permet la torsió del DNA i així afavoreix l’ancoratge de la RNA polimerasa – és un complex activador transcripcional la presència del qual, en el DNA, incrementa els nivells de transcripció. Però la no presència no vol dir que no hi hagi transcripció, simplement que el nivell serà més baix.
Té dues formes d’afavorir el posicionament: tindrem unes caixes CRP que seran reconegudes, i un cop ancorat al DNA, el pot plegar per fer que el promotor sigui més visible, però també pot interaccionar amb les subunitats α per posicionar de forma correcta la RNA polimerasa.
Si no hi ha glucosa en la cèl·lula ni tampoc lactosa, no tenim CRP-AMPc, el repressor està ancorat al promotor, els nivells basals d’expressió de l’operó lactosa són més alts que si hi hagués glucosa en el medi de cultiu. Si tenim lactosa però no glucosa, l’expressió de l’operó lactosa serà màxima. Si tenim les dues coses, tindrem un nivell incrementat dels enzim que degraden la lactosa, però no tindrem tot el nivell si no hi hagués glucosa. Per tant, sempre s’intentarà que la glucosa sigui el primer que es mengi.
L’AMPc-CRP interacciona en la regió upstream (per sobre la regió -35 i -10). Això el que permet és que el complex interaccioni amb la RNA polimerasa de forma correcta.
A on intervé CRP-AMPc? Tenim molts gens associats, tots els que estan associats a la degradació (de sucres, d’AA, de nucleòtids, de β-glucòsids, etc.). Tot això estarà inhibit en presència de glucosa. També s’activaran els gens de respiració – fermentació de la glucosa; quan la glucosa falta, respiren sucres (dóna bastant rendiment). També estaran associades algunes resistències antibiòtiques – quan falta glucosa, el medi és més pobre, sistema de defensa. El complex CRP-AMPc inactiva la síntesi de CRP i la síntesi d’adenilat ciclasa – si tenim molt AMPc, no cal més – feedback de control negatiu.
Tots els bacteris són iguals? Tenim diferents senyals moleculars que donaran lloc a la mateixa resposta. És a dir, molts es comporten igual davant la glucosa, tenen mecanismes de repressió per catabòlit; però el senyal molecular que activa això va en funció del microorganisme que tinguis. A nivell molecular, la resposta es pot orquestrar de formes diferents.
EXEMPLE – Repressió per catabòlit a Bacillus subtilis L’entrada de glucosa és igual que en E. coli – PEP, proteïnes HPr, IIA, IIB, etc.
Aquí, però, l’alarmona que s’encarrega de determinar la presència de glucosa és la FBP (fructosa 1,6-bifosfat).
Aquesta es va formant a mida que es van degradant glucoses. Per tant la seva presència + una proteïna que serà l’equivalent a CRP (ancoratge a DNA) + la presència de proteïna rica en Histidina (HPr) formen un complex l’efecte del qual serà repressor – bloquejarà l’expressió de gens associats al metabolisme catabòlic. Abans teníem un activador – contra més concentració de glucosa, menys concentració de l’activador AMPc. Aquí, en canvi, contra més concentració de glucosa més concentració del repressor FBP.
E. coli  ↑[glucosa] ↓[AMPc] =activador B. subtilis  ↑ [glucosa] ↑[FBP] = repressor EXEMPLE – Repressió per catabòlit a Pseudomonas putida Pseudomonas és un microorganisme respirador de succinats i acetats. La cèl·lula té tota una sèrie de metabòlits que tindran la seva alarmona i activaran o desactivaran els gens corresponents. En aquest cas concret, és el modulador CRC qui s’encarrega del bloqueig de la traducció de gens de transport d’altres sucres si existeixen en el medi succinat o acetat.
QUÒRUM SENSING – Lactones Els bacteris d’un mateix cultiu es parlen entre ells. La forma de parlar és molecular – deixen anar compostos que són rebuts per altres cèl·lules que reaccionaran a ells. Molts mecanismes estan associats amb les funcions cel·lulars sincronitzades – comportament global d’un cultiu.
Parlem des de cèl·lules que es posen d’acord per fer simbiosi o tenir resistència a antibiòtics fins a converses per formar biofilms.
Tot això pot dependre de la densitat cel·lular – quan la densitat és baixa, tens poques cèl·lules per unitat de volum i cada una va a su rotllo. Però si tenim moltes cèl·lules juntes segregant una mateixa cosa (triangulito), la concentració del triangulito és més alta. El triangulito llavors seria la substància equivalent a l’alarmona i que és rebuda per l’altra cèl·lula receptora.
La idea és: hi ha una cèl·lula que envia senyals (alarmones), la cèl·lula receptora les rep, s’uneixen a reguladors transcripcionals i aquests actuen sobre els gens que toquen en funció de la resposta (activadors o repressors, increment o disminució dels gens).
Les molècules estrelles del quòrum sensing són les lactones. Però no són les úniques – diverses molècules semblants estan relacionades a aquest fenomen.
LACTONA di-c-GMP – diguanilat cíclic Aquest nucleòtid també té un enzim que el cicla i també està relacionat a les senyals de quòrum sensing. Aquesta molècula modula reguladors transcripcionals perquè fosforilin proteïnes o interaccionin amb el DNA i així canviïn patrons d’expressió de la cèl·lula.
Exemples d’accions del di-c-GMP: La concentració de c-di-GMP està relacionada a moltes coses i es veu afectada per un munt de coses. Molts receptors de paret acaben afectant la seva concentració, entre d’altres.
REGULONS I REGULADORS TRANSCRIPCIONALS 27/10/14 Un reguló són tots aquells gens que estan sota control d’un mateix regulador transcripcional.
Un reguló pot ser simple o complex – podem tenir que alguna de les proteïnes resultants del regulador transcripcional A també sigui un regulador transcripcional B que reguli també l’expressió d’uns altres gens, de manera que tindríem una cascada d’activació i tots els gens que estiguessin sota control del regulador A, tan si la regulació és directa (els derivats d’A) o indirecta (els derivats de B), tots els gens formarien el reguló del regulador transcripcional A – els gens derivats formarien part del reguló del regulador general A i també del reguló del segon regulador transcripcional B.
Quan això passa, alguns autors, al reguló del regulador més genèric (A) l’anomenen moduló.
Normalment el regulador funciona gràcies a la presència d’un estímul, i aquest acaba afectant sobre l’acció del regulador fent que canviï l’expressió dels gens controlats per aquest reuglador transcripcional.
Quan mirem els gens que s’activen/reprimeixen un cop s’ha detectat l’estímul, aquest pool de gens l’anomenem estimuló – són totes les respostes derivades a un estímul extern. Aquest estímul pot afectar diferents modulons, i tots els diferents modulons formarien l’estimuló.
- Reguló – gens que estan sota control d’un mateix regulador transcripcional.
Moduló – conjunt de regulons d’un regulador global que engloba més d’un regulador.
En ell tindrem efectes directes i indirectes del regulador transcripcional.
Estimuló – respostes que es deriven de la detecció d’un estímul extern, ja que l’estímul pot anar directament a un moduló o pot afectar diferents modulons, i tots els diferents modulons formarien l’estimuló.
També hem de tenir en compte que els diferents estimulons i els diferents regulons poden solapar-se entre sí, per tant un regulador transcripcional regularà un regulador però el gen que està regulat per aquest regulador pot ser regulat també per altres reguladors. Per tant, regulons, estimulons i modulons es poden solapar perquè un mateix gen pot estar regulat per diferents proteïnes. Per tant un mateix estímul pot generar l’activació de diferents regulons, però aquests diferents regulons no seran un moduló ja que no hi ha una estructura piramidal, sinó que seran un estimuló.
Exemple – l’operó lactosa és el reguló del gen lacI (els gens lacZ, lacY i lacA que formen l’operó lactosa estan controlats per lacI). L’estimuló de la lactosa estaria format pel repressor lacI i altres repressors que puguin estar afectats per la lactosa. Els mateixos gens de l’operó lactosa també formen part d’un altre reguló – el complex CRP-cAMP, que és un moduló, ja que controla tots els gens que estan implicats en la degradació de coses (metabolisme catabòlic). Si parléssim de quin estimuló controla tot això (estímul extern), seria la glucosa o fins i tot l’alarmona cAMP, depenent d’on estiguem seria un o altre (cAMP és un senyal intern). (*) DETECCIÓ SENYALS DE L’EXTERIOR La majoria de senyals es detecten a dintre de la cèl·lula per sistemes sensors de dos components –aquests sistemes consten d’un component de paret (una única proteïna o un complex proteic) que detectarà la senyal, la transmetrà a l’interior i modificarà un efector (per exemple la glucosa, l’aparell sensor del qual comprèn IIA, IIB, etc.), i aquest efector transmetrà la senyal fins als gens. Normalment tot això es basa en una cascada de fosforilacions.
ESQUEMA 1 – Quan el compost detectat és reconegut pels sistema sensor, el component sensor de paret canvia conformacionalment, cosa que permet la modificació de la part efectora. Això es trasllada en una cascada de fosforilacions que acaba amb la transcripció de certs gens. A vegades les respostes no passen per fosforilacions, sinó que directament s’activa un regulador transcripcional. Altres vegades, aquest fosfat passa per diverses etapes fins a arribar al regulador transcripcional.
ESQUEMA 2 – La senyal és detectada pel complex sensor, s’ancora, modifica l’efector i aquest s’encarrega de transmetre la senyal – modifica altres coses (reguladors transcripcionals) que un cop són modificades donen lloc a la senyal sensora; a més, aquestes coses modificades retornen el sensor al seu estat basal.
Normalment, tenim un domini receptor i un efector. Però això ho podem complicar: podem tenir que dins el receptor hi hagi una sola proteïna o moltes proteïnes, i podem tenir que l’efector sigui un complex proteic o una proteïna. En funció de l’estímul i el sensor anirà canviant però sempre tindrem 2 components, un que detecta i un que transmet a l’interior.
REGULADORS TRANSCRIPCIONALS Tenim 2 tipus de reguladors transcripcionals – activadors i repressors (uns bloquegen la RNA polimerasa aturant el promotor, i els altres estimulen la RNA polimerasa incrementant la taxa de transcripció del promotor).
Recordem que en els promotors tenim una regió upstream (més enllà del -20), on trobarem la majoria dels activadors, i una regió downstream (més enllà del -10) on trobarem al majoria dels repressors.
Abans, es considerava que les regions operadores eren les regions d’ancoratge únicament dels repressors transcripcionals, i acostumaven a estar solapades amb la regió -10 (pic en el gràfic) tot i les excepcions. Les regions d’activació, abans rebien el nom d’activators sites (fins fa poc no s’han passat a considerar com a reguladors transcripcionals com els repressors).
Actualment es considera que els operons poden ser tant per activadors com per repressors – és a dir, que la regió d’interacció d’un regulador transcripcional es pot anomenar operador.
Per tant la regió d’interacció és aquella que permet l’acció del regulador transcripcional, tan si és en positiu (activador) com si és en negatiu (repressor).
L’operador sempre serà diferent en funció de cada regulador – la seqüència d’ancoratge depèn de com és el regulador, no de si es activador o repressor. Per exemple – el cAMP té gens que l’activen, però també hi ha alguns gens (com el propi CRP) que eren inhibits per la presència de cAMP , eren bloquejats per feedbakc negatiu. Però la regió d’ancoratge (la seqüència de DNA) és la mateixa; el que passa és que a vegades estarà actuant com a activador i altres actuarà com a repressor – el que canvia és la posició de la seqüència dins el promotor.
És a dir – podem tenir proteïnes que actuïn com a activadors i repressors, i dependrà d’on interaccionin amb el DNA; si interaccionen en la regió upstream, potser li donen la curvatura necessària al DNA per tal que l’acció de la RNA polimerasa s’estimuli. Però si la mateixa proteïna la col·loques en la regió downstream, allà el que farà serà bloquejar el pas de la RNA polimerasa. És la mateixa proteïna amb la mateixa seqüència de DNA, però en tenir regions d’interacció tant el la regió upstream com en al regió downstream, pot actuar com a activador i com a repressor.
ACTIVADORS Tota proteïna que activi la transcripció.
Considerarem un activador tot allò que estigui estimulant l’expressió. Podem tenir activadors i coactivadors, que són activadors que interactuen amb altres activadors per estimular encara més l’expressió d’un mateix promotor.
Un activador té un paper dual – en l’estudi de l’expressió gènica, sabem l’inici i el fi, però no com funciona la cascada; només sabem l’efecte del regulador sobre el gen global (eliminem reguladors i observem com canvia l’expressió del gen). Per tant, ens podem trobar que un activador transcripcional tingui un efecte positiu i activi l’expressió d’un gen perquè ho fa directament o perquè ho fa a través d’un gen/una sèrie de gens. Però l’efecte també pot ser negatiu tot i ser un activador – podem estar activant un regulador que el que faci quan està activat és bloquejar l’expressió d’un gen.
Per això és important saber qui activa qui, perquè l’efecte general és negatiu però ell és activador! També pot ser que l’efecte sigui directament negatiu. Per exemple, en el cas del cAMP, la regió d’interacció coincideix exactament amb la regió -10 de la RNA polimerasa – per molt que sigui un activador, si tenim una proteïna enorme enganxada, la RNA polimerasa no podrà ancorarse. Per tant els activadors només seran activadors quan es col·loquin on els toca donant la curvatura ideal per un promotor. Tot depèn del lloc on se situï la regió operadora del regulador transcripcional. (*) REPRESSORS Tota proteïna que bloqueja la transcripció – pot bloquejar el pas de la RNA polimerasa o bé pot evitar que reconegui el promotor. Pot fer-ho de diverses maneres: 1. Bloquejar la regió -10 (la RNA polimerasa no s’uneix) 2. Bloquejar la regió -35 (la RNA polimerasa no reconeix el promotor) 3. El repressor té llocs d’ancoratge en -10 i més enllà de -35, cosa que genera un plegament que oculta el promotor (RNA polimerasa no la veu).
4. Repressor que bloqueja l’acció d’un activador – difícil de detectar. En aquest cas el repressor no interacciona directament sobre el DNA sinó sobre proteïnes que actuen sobre aquest. En aquest cas no trobaríem cap regió operadora.
Els repressors també tenen un paper dual – un repressor pot tenir un efecte directe sobre un gen o pot bloquejar l’expressió d’un activador i disminuir l’expressió d’un gen o pot reprimir l’expressió d’un repressor i així incrementar l’expressió d’un gen.
A l’igual dels activadors, el mateix repressor pot actuar com a positiu o negatiu en funció d’on s’ancori.
TIPUS DE CONTROL TRANSCRIPCIONAL Tots els gens es poden regular per 4 formes diferents bàsiques que després es poden complicar més o menys. Aquestes quatre són: Sempre que hi hagi un repressor involucrat en el control de l’expressió gènica direm que hi ha un control negatiu. Però sota un control negatiu d’un gen podem tenir un increment o una disminució de l’expressió gènica. Tot depèn de com s’associa el repressor a l’estímul que l’està activant.
1. Tenim un control negatiu per inducció quan el repressor de normal està unit al DNA i en presència de l’inductor, el repressor deixa d’unir-se al DNA. Exemple – operó lactosa. En absència de l’inductor l’expressió és basal. En presència de l’inductor l’expressió incrementa (+/+++).
2. Tenim un control per negatiu per repressió quan el repressor de normal no està unit al DNA, i només hi interacciona quan s’uneix a una molècula que el canvia conformacionalment. Aquesta molècula l’anomenem corepressor. Exemple – operó triptòfan. En absència del corepressor l’expressió incrementa. En presència del corepressor l’expressió és basal. (+++/+).
Els efectes són contraris quant a la presència/absència de l’inductor/corepressor.
Sempre que hi hagi un activador involucrat en el control de l’expressió gènica direm que hi ha un control positiu. Però sota un control positiu d’un gen podem tenir un increment o una disminució de l’expressió gènica. Tot depèn de com s’associa el repressor a l’estímul que l’està activant.
3. Tenim un control positiu per inducció quan l’activador de normal no està unit al DNA (apoactivador), i només hi interacciona quan s’uneix a una molècula que el canvia conformacionalment. Aquesta molècula l’anomenem activador. Exemple – operó arabinosa p cAMP-CRP. En absència de l’inductor l’expressió és basal. En presència de l’inductor l’expressió incrementa (+/+++).
4. Tenim un control positiu per repressor quan el repressor de normal està unit al DNA i en presència d’un corepressor, l’activador deixa d’unir-se al DNA. Exemple – operó treonina. En absència del corepressor l’expressió incrementa. En presència del corepressor l’expressió és basal. (+++/+).
Un mateix regulador transcripcional per segons quins gens pot tenir un control positiu per inducció i a vegades pot tenir un control negatiu per repressió. Exemple – CRP-cAMP en l’operó lactosa. Pel gen lacZ, CRP exerceix un control positiu per inducció per estimular l’expressió gènica. En canvi, sobre CRP o sobre TIA té un control negatiu per repressió que bloqueja l’expressió. Això depèn del lloc d’interacció.
El que no passa massa sovint és tenir un control positiu per inducció i un control negatiu per inducció, ja que l’estructura de la proteïna hauria de permetre la interacció amb el DNA sempre. És a dir, que els “creuats” són possibles però els horitzontals no.
Què hauria de passar perquè fossin possibles els horitzontals? Que canviés la seqüència i no la regió – amb l’inductor reconeix una seqüència i sense una diferent. En ambdós casos tindria capacitat d’interaccionar amb el DNA però el lloc de reconeixement seria diferencial. Tindríem una regió operadora per quan és apoactivador o aporepressor i una diferent per quan tingués la molècula que l’ajuda a fer el complex que activa o reprimeix.
OPERONS BACTERIANS - CATABÒLICS – De degradació (obtenir energia).
ANABÒLICS – De síntesi (consumir energia).
En tots els operons catabòlics intervindrà el complex CRP-cAMP – repressió per catabòlit (glucosa o sucre). Tots els operons catabòlics estan governats pels modulons que estan controlats per l’estímul corresponent al catabòlit que és degradat preferentment.
En tots els operons anabòlics intervindrà el ppGpp – resposta astringent. Tots els operons anabòlics estan governats pels modulons associat a ppGpp que estan controlats per l’estímul corresponent a una baixada dels nutrients.
EXEMPLES SOBRE OPERONS OPERÓ LACTOSA Clàssic exemple de control negatiu per inducció. :DDD Seminari 2.
OPERÓ TRIPTÒFAN Clàssic exemple de control negatiu per repressió. És un operó anabòlic, intervé ppGpp. També tenim sistemes d’atenuació que el controlen, i també tindrem un control propi que és el negatiu per repressió.
Quan la concentració de triptòfan al medi de cultiu és baixa, el nostre repressor transcripcional no incorpora triptòfan a l’estructura i no interacciona amb el DNA, per tant l’expressió dels gens de l’operó triptòfan estarà activada. Aquí s’hi suma el control de l’atenuador i del ppGpp, però l’efecte final és que es produeix tot el transcrit.
Quan la concentració de triptòfan al medi de cultiu és alta, el repressor s’uneix al triptòfan, canvia conformacionalment, dimeritza, reconeix la regió operadora del DNA, s’hi enganxa i bloqueja l’expressió de l’operó.
Per tant, el triptòfan fa de corepressor.
El sistema és xulo, perquè l’expressió normalment és basal. Però quan el repressor és desenganxa i la RNA polimerasa comença a transcriure, aquesta es troba amb el control d’atenuació. Per tant, encara que la RNA polimerasa reconeix el promotor, si la concentració de triptòfan és alta la transcripció es bloquejarà abans de sintetitzar els gens (transcrit curt) – el nivell basal d’expressió és molt baixa ja que hi ha molts sistemes de control associats.
Sobre els canvis conformacionals – hi ha dos centres catalítics que incorporen dues molècules de triptòfan a l’interior, cosa que fa que es moguin les hèlixs a l’interior i això acaba produint que hi hagi interacció amb el DNA. Simplement, la idea és que el triptòfan interacciona amb el repressor i mou les hèlixs que hi ha en l’estructura del repressor fent que tingui actiu el centre d’interacció amb el DNA.
29/10/14 El promotor de triptòfan està altament controlat a diferents nivells per dos motius. En primer lloc, la cèl·lula és un AA que costa sintetitzar, per tant la cèl·lula no pot gastar energia per sintetitzar-lo si no el necessita realment. En segon lloc, la regió -35 del promotor de l’operó triptòfan és una regió extraordinàriament forta – és una regió molt òptima pel reconeixement de la RNA polimerasa. Per tant, si no hi hagués tot aquest control, l’expressió basal des del promotor del triptòfan seria extraordinàriament alta.
De fet, és tan bon promotor que s’utilitza per fer promotors sintètics – quan volem introduir gens en una cèl·lula i sotmetre’ls a algun control, molts dels promotors sintètics que utilitzem contenen la regió -35 de l’operó triptòfan perquè assegura un bon funcionament. Per exemple, el promotor sintètic PTAC (P de promotor, i correspon a la fusió del promotor de l’operó triptòfan, PTRIP i l’operó lactosa PLAC) és utilitzat amb freqüència ja que conté la regió -35 del triptòfan (és molt bona) i la regió -10 i la regió operadora de l’operó lactosa (és molt fàcil mitjançant el lacI controlar qualsevol gen). Tot el que posis sota control de PTAC estarà controlat per l’operó lactosa, però mantindrà la regió forta d’interacció del triptòfan. A vegades s’agafa tot l’operó triptòfan amb tota la regió atenuadora i davant s’hi posa un gen que a tu t’interessa controlar. Ara el gen que tu has posat davant passa a tenir tota la senyal reguladora d’aquell promotor, de manera que passa a jugar amb les mateixes senyals amb que estaries jugant en l’operó triptòfan.
Posar un promotor de l’operó triptòfan davant d’un gen no vol dir que aquella cèl·lula sigui triptòfan+; poses el promotor, però no tot l’operó (no se sintetitzarà).
Com en tots els operons, existiran diferents mutacions que donaran lloc a fenotips diferents: - - trpOc – operador constitutiu (expressió màxima).
trpq – repressor d’alta afinitat – són repressors amb una constant d’afinitat per la regió afinadora molt alta. A vegades es posa un lacI- perquè tenim cèl·lules que expressen molt més repressor del que toca, i dóna sensació que el repressor funciona millor però no és això. Per tant, si tens molt més repressor necessitaràs molta més concentració d’inductor per obtenir la mateixa resposta perquè hauràs de bloquejar molts més llocs.
trpRs- insensible a l’inductor (al triptòfan).
OPERÓ ARABINOSA Un dels promotors més utilitzats pel control de gens en soques bacterianes és el promotor PBAD – promotor de la unitat transcripcional AraB, AraA i AraD, que són els gens de l’operó arabinosa. Es tracta d’un operó catabòlic (degrada sucres, -osa) per tant serà regulat pel cAMP.
Aquest promotor té un control propi. El reguló AraC conté 3 unitats transcripcionals. El regulador transcripcional del sistema serà AraC, i controlarà diferents promotors que donaran diferents mRNAs, cadascun dels quals contindrà gen/s.
De tots els promotors de les diferents unitats transcripcionals que formen el reguló AraC, el promotor que conté els gens AraB, AraA i AraC és promotor PBAD. Si posséssim un Para, no estaríem definint quin és (seria ParaBAD).
El reguló AraC és un reguló encarat a la degradació de l’arabinosa, i conté els enzims necessaris per la seva incorporació i la seva degradació fins a poder-la entrar al cicle de Krebs.
El control de AraC és normalment un control positiu per inducció – actua com a activador i quan està unit a l’arabinosa activa els gens que controla. Però això no és el que passa amb el PBAD – el control que fa AraC és un control positiu/negatiu (dual), AraC és capaç de controlar a més negativament la seva pròpia unitat transcripcional. Per tant, per AraC, el control de la seva expressió gènica és negatiu per repressió (quan l’AraC s’uneix, que és quan hi ha arabinosa, actua com a repressor).
Però el promotor usat dins la cèl·lula és el promotor PBAD, i s’utilitza per aquesta característica dual. Què vol dir que actua de forma +/- o dual? El regulador AraC té dos dominis – un d’interacció amb el DNA i un d’ancoratge amb l’arabinosa.
Quan no hi ha gairebé arabinosa al medi, aquest regulador transcripcional és capaç d’interaccionar i fer un dímer que bloqueja l’accés al promotor PBAD.
PARÈNTESI – El repressor triptòfan només interacciona amb el DNA quan està unit al triptòfan.
En canvi el repressor/regulador AraC és capaç d’interaccionar amb el DNA sempre, tot depèn d’on es troben les seves regions operadores. Si tenim una regió d’interacció i a una distància concreta en tornes a tenir una altra, en aquesta estructura el dímer s’estabilitza dins el DNA i per tant el regulador és capaç d’ancorar-se al DNA encara que no tingui arabinosa. Si no tinguéssim aquestes dues regions operadores juntes i el DNA no es plegues estabilitzant el complex, l’estructura no s’uniria el DNA.
Les regions promotores llavors queden bloquejades i la RNA polimerasa no pot reconèixer el promotor perquè les regions -35 i -10 queden a una alçada que no permet veure-les, per tant l’expressió és basal – en aquesta situació de bloqueig hi ha una repressió del sistema.
Incís: AraC només té acció d’activació en algunes de les unitats transcripcionals que controlava, i el rarito era PBAD perquè els altres eren sempre positius. Però ara hem dit que el dímer AraC pot actuar com a inhibidor – això és perquè en aquests promotors no hi ha la regió operadora que estabilitza el complex. Per tant en els promotors AraC no hi ha activació quan no hi ha arabinosa, i en PBAD hi ha una repressió amb arabinosa. No és el mateix no activar que reprimir. AraC és sempre el mateix, el que canvien són les seqüències de DNA que estabilitzen el dímer.
Quan tenim arabinosa en el medi de cultiu, l’arabinosa interacciona amb l’AraC. Llavors, canvia conformacionalment canviant l’estructura del dímer – enlloc de plegar-se com abans formarà un complex diferent, en el qual cada un dels monòmers serà capaç de reconèixer una regió d’interacció o operadora en el promotor del PBAD. Com en aquesta conformació el dímer pot ancorar la RNA polimerasa, tindrà una funció d’activador del promotor. Per tant, amb arabinosa, el regulador ancorat al DNA ancora la RNA polimerasa incrementant la transcripció del sistema – expressió induïda.
En els altres, aquesta nova conformació del dímer sí que pot ancorar-se al DNA, pot ancorar la RNA polimerasa i pot activar el sistema, i per això posem una creueta positiva, perquè el dímer quan incorpora arabinosa sí que és capaç d’estabilitzar-se en els promotors amb una creueta positiva i activaria el sistema.
Mateixa idea diapositiva diferent – quan no hi ha arabinosa veiem la conformació del dímer en gris, sense capacitat d’interacció, que s’ancora al DNA només si tens les regions operadores que toquen i es forma aquest loop. En aquesta situació, el promotor allà on s’ancori estarà parat (bloqueig). En aquesta conformació, AraC no pot vehicular la RNA polimerasa i fa que ho tingui difícil per entrar a dins.
Però quan sí que hi ha arabinosa, veiem la conformació del dímer en groc, i l’arabinosa s’introdueix en el dímer canviant-lo conformacionalment fent que interaccioni amb el DNA (reconeix la mateixa seqüència) adquirint ara la capacitat d’ancorar la RNA polimerasa (s’obre el loop en el DNA). Quan l’adquireix i interacciona amb dues regions seguides de les regions promotores, activa la transcripció dels gens B, A i D.
Aquest cas és un dels que no es pot descriure (la majoria pertany a alguns d’aquells 4). Quan no hi ha arabinosa, tenim un bloqueig, però quan n’hi ha tenim una activació – realment el regulador té una acció dual sobre el promotor. Com la gent que treballa amb axiò consideren que AraC sempre té una acció positiva, parlem d’una acció activadora i una acció antiactivadora, en funció de si hi ha arabinosa o no en el medi de cultiu.
L’expressió basal del promotor és molt molt baixa, i quan està activat és bastant alta. Per tant l’interval de diferència entre l’expressió basal i màxima és bastant alt, ja que deixem d’activar i a l’hora reprimim o deixem de reprimir i a l’hora activem.
En aquesta imatge veiem com AraC reconeix les dues seqüències que són molt semblants, ancora la RNA polimerasa i activa la transcripció.
Recordem que un mateix promotor pot acumular diferents senyals – triptòfan té repressor, ppGpp, l’atenuador, un promotor que és més o menys òptim, etc. tots els processos són acumulatius, no excloents.
...