Tema 4 (2016)

Apunte Español
Universidad Universidad de Lleida (UdL)
Grado Biotecnología - 1º curso
Asignatura Biologia Molecular
Año del apunte 2016
Páginas 3
Fecha de subida 19/04/2016
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Biología Molecular Héctor Escribano Tema 4 La replicación es semiconservativa y es llevada a cabo por las DNA polimerasas. Las DNA polimerasas no son capaces de unir nucleótidos de novo, debe haber un fragmento previo. Solo puede elongar trozos de ácido nucleico, llamado cebador o Primer. Los nucleótidos nuevos vienen en forma de dATP, para así formar el enlace fosfodiéster; mientras que los nucleótidos que forman el ácido son monofosfatos. Así cuando se forma el enlace se forman dos fosfatos unidos. Una vez se ha añadido el nucleótido, una Pirofosfatasa rompe el enlace pirofosfato, para así desplazar la reacción y que los nucleótidos no se vuelvan a unir a los fosfatos y se deshaga la cadena. Siempre se polimeriza en sentido 5' --> 3'. Es un mecanismo que no tiene excepciones, es siempre así. (No es como algunos organismos que tienen algunos mecanismos que van a su bola). Esto se debe a que la energía la aporta el nucleótido que entra.
Si la polimerasa comete un error y mete un nucleótido erróneo, puede enmendarlo y quitar el nucleótido error, dejando el extremo otra vez en OH. Si se sintetizara al revés, quedarían tres fosfatos en ese extremo. Cuando cortase el nucleótido, solo quedaría un fosfato, y no quedaría la misma situación inicial. Mientras que si es 5' -> 3', al cortar queda un OH que es justo la situación inicial.
Debería haber un sistema que añadiese de nuevo el pirofosfato. Por alguna razón, el sistema 3'-->5' parece ser que no se ha seleccionado a lo largo de la evolución.
4.3. Mecanismo de acción de las DNA polimerasas Discriminación entre los distintos deoxinucleótidos.
Cuando el apareamiento de bases es correcto, la disposición espacial de los nucleótidos permite la reacción. En cambio, si los nucleótidos del molde y del nucleótido entrante no pueden formar los puentes de hidrogeno entre las bases nitrogenadas, la disposición espacial de estos no permite la formación del enlace.
Discriminación entre deoxinucleótidos y ribonucleótidos.
La enzima puede detectar la existencia del grupo H o del OH gracias a unos aminoácidos del centro catalítico de la enzima, y que moverán el nucleótido hacia la posición correcta. Así si hay un grupo OH podrán interaccionar con él, desplazándolo.
Todas las DNA polimerasas usan cationes divalentes para la adición de los nucleótidos (Magnesio y en ocasiones Manganeso). Los cationes "cuelgan" de los residuos de Aspartato de la propia enzima e inhiben las repulsiones entre los oxígenos de los grupos fosfatos y debilitan los enlaces de hidrogeno del OH del nucleótido entrante.
4.4. Procesividad de las DNA polimerasas La tasa de síntesis de las DNA polimerasas puede llegar a ser de 1000nt/s y además correctamente. Esta tasa se consigue gracias a la procesividad de las DNA polimerasas. El concepto de procesividad solo se Biología Molecular Héctor Escribano Tema 4 puede aplicar en la polimerización de moléculas. La procesividad es el número de monómeros que puede añadir por cada vez que se adhiere juntando el centro catalítico con su sustrato. Se puede unir, añadir soltarse, volverse a unir... En cambio, la procesividad es la cantidad de monómeros que se añaden por cada suceso de unión entre la enzima y el sustrato.
Las DNA polimerasas pueden tener procesividades de 50.000 monómeros por sucesos de unión, añadir 50.000 nucleótidos antes de soltarse. Por tanto, son muy procesivas y muy rápidos. Si no fuesen procesivas, sería imposible que se alcanzase tal velocidad. Ya que el proceso limitante (el cuello de botella) es que la enzima encuentre a su sustrato, ya que dura del orden de un segundo. En añadir un nucleótido se tardan escasos milisegundos.
Ejemplo El cromosoma de la E.Coli tiene 4'7*10 ^6 pares de bases. Si la DNA polimerasa no fuese procesiva, tardaría 4,7*10^6 segundos en replicarlo -54 días-. En el caso real, se sintetizan unos 50.000 nucleótidos por cada golpe, a 1000 nucleótidos por segundo, tardaría 0,054 días -78 minutos-. La enzima tarda 78 minutos en replicarlo todo, pero como es una replicación bidireccional se tarda realmente la mitad, 39 minutos, minuto arriba, minuto abajo.
In vitro, esa procesividad se pierde, al ser purificada y ser utilizada sola. In vivo, esa alta procesividad no solo se debe a la propia enzima sino a una proteína que interacciona con ella. Dicha proteína es la Sliding Clamp (una abrazadera deslizante), formada por tres subunidades idénticas, que se unen y forman un anillo. El anillo se puede abrir o cerrar, con la acción de un Clamp Loader, que lo abre y cierra a modo de (enganche de montaña). El Sliding Clamp está rodeando al DNA y a la vez interaccionando con la polimerasa. Si por alguna razón la polimerasa pierde contacto con el DNA, al no dejar de interaccionar con el Sliding Clamp, no tarda tanto en volver a encontrar a su sustrato. Que todas las interacciones se rompan a la vez es muy poco probable. Por eso, al purificarla y no tener Sliding Clamp, la procesividad disminuye considerablemente hasta los 200-300 nucleótidos.
4.5. Fidelidad de las DNA polimerasas La DNA polimerasa se equivoca en uno de cada 10^5 nucleótidos. Nuestro genoma tiene 6,4*10^9 nucleótidos. En replicar nuestro genoma se producen 64.000 errores. La realidad no se acerca a esto ni de broma. La tasa de mutación real de nuestro organismo es de 1 entre 10^10, por cada generación. En cada replicación puede haber como mucho, un error; pero normalmente ninguno. Existen dos mecanismos que evitan los errores de las polimerasas. Las polimerasas son capaces de autocorregirse cuando se equivocan, ya que tienen actividad correctora en sentido 3' -->5'. Cortan el nucleótido y lo liberan como monofosfatos y añaden al correcto. Si se equivocan, vuelven para atrás y corrigen el error.
(Actividad exonucleasa correctora). A veces esa actividad exonucleasa no solo quita el nucleótido erróneo sino que quita alguno más.
Biología Molecular Héctor Escribano Tema 4 Si la unión del molde con el primer es perfecta, la actividad de la enzima esta desplazada hacia la polimerización que para la exonucleación. Pero si no está bien apareado, la deformación de la unión entre el molde y el Primer provoca un aumento de la actividad exonucleasa. A veces, aunque haya un error, no lo elimina y pone uno nuevo; a pesar de que la actividad exonucleasa este muy favorecida. Que se le pase un error ocurre en 1 de cada 100 casos (de cada 100 errores que comete cada 10^5 nucleótidos, puede corregir 99 de ellos). Eso representaría unos 640 errores (aún lejos de la realidad).
Además, existe otro mecanismo postreplicativo, no llevado a cabo por la DNA polimerasa sino por otra enzima, llamado Mismatch Repair. Este mecanismo es capaz de reparar 999 de cada 1000 errores. Lo que nos deja con 0,64 errores por cada replicación completa. (El mecanismo se explica en profundidad en el siguiente tema).
Una célula humana tarda unas 6-8 horas en replicar todo su DNA, y los que prima es que sean rápidas y fiables. Por eso hay DNA polimerasas que se encargan de corregir, y que no importa que no sean procesivas, mientras sean lo más fieles posibles.
4.6. Horquilla de replicación La síntesis del DNA no se produce en cualquier sitio del DNA, sino en sitios específicos. En el E.Coli, en uno solo, en el Humano, muchos sitios; pero siempre los mismos. Lo primero que se genera en esos puntos en los que se empieza a replicar es especie de burbuja de replicación. Esta burbuja es creada por las Helicasas, proteínas que forman un anillo que envuelven al acido nucleicos, y al desplazarse en un sentido u otro van separando las dos cadenas y formando las cadenas.
Cuando las Helicasas van abriendo las cadenas, y no se cambia el Linking Number y aumenta el Twist y se van acumulando superenrrollamientos positivos. Hasta que llegaría un punto en el que no se podría seguir. La función de las Topoisomerasas, van cortando la cadena y uniéndola, disminuyendo los superenrrollamientos; por lo que son unas enzimas vitales para la replicación.
Cuando se crea la burbuja se crean dos horquillas de replicación, en cada lado. Por lo que la replicación puede darse en los dos sentidos.
(Apuntes) La Primasa se encarga de poner el Primer de 5-10 nts en la cadena, al principio de la horquilla (de forma transitoria para que la DNA Polimerasa pueda empezar y luego se quita). Entonces como el primer se pone en el extremo 3', y el primer va en contra de dirección, a la DNA polimerasa le queda siempre un extremo 3' en el primer y puede seguir polimerizando siempre que la Helicasa siga abriéndole paso.
(Cadena Conductora). En la otra cadena el Primer se pone cercano a la Helicasa y sintetiza en sentido contrario. Una de las cadenas se polimeriza de forma continua, mientras que la otra debe hacerlo a trozos ya que el sentido es contrario (Cadena Retardada). Cada uno de los fragmentos que conforman la cadena retardada se llaman fragmentos de Okazaki. Estos fragmentos de Okazaki tienen una longitud de 1000-2000 pares de bases en bacterias y de 100-400 pares de bases en eucariotas.
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