Tema 2 (2015)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Bioquímica - 2º curso
Asignatura Biologia Molecular
Año del apunte 2015
Páginas 31
Fecha de subida 11/02/2015
Descargas 47
Subido por

Vista previa del texto

María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia molecular T2 Tema 2. ESTRUCTURA SECUNDÀRIA DEL DNA INTRODUCCIÓ: DESCOBRIMENT DE L’ESTRUCTURA DEL DNA Des del 1930 l’estructura química dels components del DNA era coneguda i per tant es sabia que un nucleòsid es composava d’una base nitrogenada i d’un sucre que fa d’un anell de ribosa i segons si té més o menys hidroxil podíem determinar si era ARN o DNA (és desoxi i per tant, té un hidroxil menys).
Quan afegim fosfat aleshores parlem del nucleòtid o nucleòsid fosfat i la manera d’anomenar els àtoms és molt rigorosa i està establerta de forma molt pautada: els àtoms que formen part de la base porten números normals mentre que els que estan fora porten números amb una “prima”. Això dona lloc a dos tipus de molècules amb un anell en el qual si l’anell es petit totes tenen una estructura similar a la pirimidina mentre que si són més grans s’assemblen a l’estructura de purina:  Bases puríniques: Adenina (A) i Guanina (G)  Bases pirimidíniques: Timina (T), Citosina (C) i Uracil (U) En arribar els anys 40 els químics ja s’adonen que la molècula de DNA es tracta d’una estructura altament polimeritzada i d’alt pes molecular de manera que formen cadenes molt llargues amb polaritat i per tant, és un polímer llarg que no té la mateixa funció en cada extrem. Si mirem la molècula de DNA des d’adalt cap avall veiem que el primer nucleòtid està unit amb el segon per mitjà d’un enllaç fosfodièster (pont covalent que uneix les riboses) i per tant, veiem que el primer carboni que em trobo corresponent a la ribosa és el 5’. Si elaborem el mateix procediment des de sota veurem que el carboni unit és el 3’ i per tant, podem dir que el DNA va des de 5’3’.
Experiments en el laboratori de Avery (Nova York) Aquest laboratori farà servir pneumococs, bacteris molt perillosos ja que quan estan en forma activa, si són inoculats en ratolins o altres animals els mata, són letals. Alhora, els investigadors disposaven d’uns altres pneumococs mutants, que no tenien càpside i no eren letals. Doncs l’experimentació es basarà en la utilització d’aquestes dues soques:  Soca A: soca normal i letal  Soca B: soca mutant i no letal Quan la soca A (nativa i letal) era sotmesa a escalfament perdia la capacitat de matar al hoste i per tant, el que van fer és observar que passava si introduïes la soca mutant (soca B) amb aquesta nova soca escalfada. Els resultats van ser que els pneumococs recuperaven la seva letalitat. Aquest aspecte és estrany perquè parlàvem de mutants que inicialment no eren letals i per tant, vol dir que existia una transformació biològica.
1 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia molecular T2 La següent pregunta durant la investigació va ser quin era el contingut en els natius escalfats que permetia la transformació, és a dir, quin era el principi transformant responsable. Els investigadors pensen que si troben la causa molecular d’aquesta transformació com que varia l’herència biològica trobaran part de les bases del material de l’herència.
El següent experiment que van elaborar va ser sotmetre les soques natives escalfades a una segona homogeneïtzació i després els van passar per una espècie de “batidora” per procedir a elaborar un fraccionament, que era la separació de lípids, proteïnes i ADN. Així doncs, un cop tenien les tres fraccions les van col·locar en tres tubs diferents per tal de conèixer quina d’aquestes era la causant de la transformació: van observar que cap d’elles llevat de la fracció d’ADN podia generar que els pneumococs recuperessin la seva letalitat.
Des del primer moment en que s’elaboren les experimentacions estan convençuts que trobaran les molècules responsables de la transformació de l’herència biològica dels pneumococs i per ells està molt clar que els gens estan involucrats dins d’aquesta estructura.
L’entorn científic però no els va creure perquè en aquesta època es pensava que el portador de l’herència biològica havia de ser de la família de les proteïnes ja que tenen 20 aminoàcids i en canvi els àcids nucleics només tenen 4 components de manera que, les proteïnes, suposadament, podien donar lloc a estructures molt més complicades i formades per més elements. Així doncs, la comunitat científica afirmarà que la seva fracció d’ADN està contaminada per proteïnes i per aquest motiu es produeix la transformació.
En mateix laboratori voldrà rebutjar la hipòtesis de la comunitat científica de manera que tractaran la fracció de DNA per purificar-la millor amb una sèrie de tractament amb enzims:  Proteases (trenquen les proteïnes): observen que la fracció segueix sent letal  RNAases: la fracció segueix sent letal  DNAases: la fracció ja no és letal Amb aquest experiment demostren que és el DNA el causant de la transformació.
2 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia molecular T2 Experiments de Hershey y Chase (1951) Aquest és un experiment molt senzill en que s’utilitzen bacteriòfags que tenen una càpside proteica i s’aprofita el fet que en aquests anys ja existien els isòtops radioactius i per tant utilitzen:  Sofre 35 per marcar la proteïna  Fòsfor 32 per marcar el DNA El que va permetre seguir aquestes dues molècules. Elaboren una barreja de bacteriòfags i bacteris i poc temps després van elaborar un homogeneïtzat (experiment del turmix) on aconseguien desenganxar els bacteriòfags dels bacteris però tenint present que aquests ja havien tingut temps de fer la seva feina.
Més tard van elaborar una centrifugació, el que els hi va donar un sobrenedant i un sediment:  Sobrenedant: part petita corresponent als bacteriòfags, que són visibles en microscopi. Aparentment aquests estan bé però només donen radioactivitat en sofre 35.
 Sediment: en aquest tenim bacteris amb el DNA que dona radioactivitat en fòsfor 32.
Quan el sediment evolucionava (replicació del DNA) hi havia la proliferació de virus i la seva lisis. Això demostra que el DNA és el material necessari per una infecció i que les proteïnes no havien estat necessàries.
La conclusió d’aquest laboratori és paral·lela i coherent amb la del Laboratori de Avery. Els dos investigadors rebran el premi Nobel. Hem de tenir present però que la contaminació proteica del laboratori de Avery era del 0.02% mentre que aquesta era superior al 1% però ens trobem en una època en que la comunitat científica ha evolucionat i per tant, l’experiment és més acceptat.
Estudis de Chargaff (1951-1952) Chargaff influenciat pels experiments anteriors es dedica a l’estudi dels àcids nucleics però ho elaborarà de forma molt química (podem veure la biologia molecular com una ciència molt interdisciplinària perquè hi ha contribucions molt importants de diferents ciències). Com que era químic analític agafarà el DNA i el sotmetrà a hidròlisis àcida de manera que aconsegueix trencar la molècula i alliberar les bases nitrogenades.
En aquesta època els químics ja saben separar molècules amb tècniques cromatogràfiques (sobretot amb la cromatografia de paper) i serà així com elabori la separació: posarà les bases sobre una tira de paper de filtre i ho introduirà en un dissolvent ben triat, que anirà avançant per capil·laritat per tota la tira de paper, arrossegant els components de la dissolució i separant-los en funció de les seves propietats químiques. Aquesta experimentació ens donarà 4 taques diferenciades, cadascuna d’elles corresponent a una base nitrogenada.
Fins al moment Chargaff només havia elaborat química analítica però ell volia elaborar química quantitativa de manera que va buscar un sistema ver contar les bases.
3 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia molecular T2 Aproximadament a partir de l’any 50 hi havia marcadors radioactius i també hi havia espectrofotòmetres en els laboratoris de manera que va agafar les taques i amb unes tisores les retallarà i les posarà en diferents tubs, en els quals també introdueix un dissolvent que s’emportarà el material absorbit pel paper, que passarà a dissolució. Seguidament va mesurar l’absorbància i com que tenia tots els patrons va poder conèixer la proporció de cadascuna e les bases, per tant, va treballar amb organismes diferents per intentar arribar a una conclusió.
Els resultats que treu de l’experimentació són (no va sabia perquè era així): Organisme A G C T A/T G/C Humans 30.9 19.9 19.8 29.4 1.05 1.0 E.Coli 24.7 26 5.7 23.6 1.04 1.01 Hipòtesis de Watson i Crick (1953) No és correcte dir que només ells estaven treballant en l’estructura d’aquest tema sinó que ells obtenen dades molt importants d’altres investigadors però sobre tot de Franklin i Wilikins (Franklin serà la única que no rebrà el Premi Nobel).
Estudis anteriors a la hipòtesi de Watson i Crick que van contribuir A continuació estudiarem quins van ser els científics i la informació que van aportar per tal que Watson i Crick poguessin arribar a la seva hipòtesi.
1.
Contribució de Rosalind Franklin Aquesta investigadora contribueix amb la difracció de raig X de fibres orientades de DNA. En la següent imatge veiem una X de punts discontinus petits llevats d’uns més grans situats al nord i al sud. En la difracció de raig X en veure punts vol dir que es tracta d’una estructura repetidament oposada per tant, el DNA té una estructura repetitiva tot i que no tingui pinta de ser un cristall.
Rosalind treballà amb una preparació de DNA en que agafarà les cèl·lules, les trencarà i arribarà als nuclis, que sedimenten molt bé. Un cop té els nuclis el que vol es separar-los en DNA i proteïna i per tant, els tractarà amb clorur de sodi concentrat (2M) el que permetrà la dissociació de les histones (les principals proteïnes) i a més, els tractarà amb detergents iònics com el SDS, una molècula que té càrrega a l’extrem i que també ajuda a dissociar i separar les proteïnes del DNA.
A més, afegeix cloroform amb fenol (el cloroform no és miscible en aigua) i al cap d’una estona tindrem en el tub una part més densa corresponent al cloroform i una part líquida sobre aquest que és una dissolució aquosa. Generalment per anar més ràpid es sol centrifugar la mostra, el que permet la separació de la fase orgànica i aquosa (queda soluble en ella el DNA perquè té moltes càrregues negatives). Entre les dues capes trobarem una interfase composada per proteïna (queda en la interfase perquè té residus hidrofòbics i polars).
4 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia molecular T2 En aquest moment és necessari xuclar amb la pipeta la part de dalt sense acostar-se a la interfase (de color blanquinós) i normalment es repeteix el procés 2 vegades. Aquest procés ens dona una gran quantitat de volum d’etanol que provoca que el DNA precipiti i es formin petits “filets” que s’aconsegueixen amb la pipeta. Rosalind necessitava orientar el DNA i per tant el que va fer és tibar-lo, el que ens dona una orientació gràcies a que el material és fibril·lar. Així doncs el que va fer es tibar el DNA amb unes pinces de laboratori que probablement s’obrien i es tancaven amb una falca.
2.
Teoria de Bragg La segona cosa que tenien Watson i Crick fa referència a tot el coneixement que s’havia adquirit sobre la cristal·lografia de raigs X. Al 1912 es va establir la teoria de Bragg que estava proposada per dos científics que eren pare i fill. Aquesta teoria afirmava que si la matèria conté estructures que es repeteixen, quan li incideix una radiació, aquesta es dispersa en totes les orientacions a l’espai però hi ha direccions privilegiades on la intensitat queda reforçada. Aquest fenomen de difracció és un fenomen general. A la imatge podem veure com es repeteixen uns punts o bé uns plans posats de manera regular.
Cal tenir present que la llum ha de ser la adequada. Per poder veure distàncies molt petites, com és el cas de les distàncies interatòmiques, la radiació ha de tenir una longitud d’ona molt petita, com ara la dels raigs X.
Per tal que es produeixi interferència constructiva cal que els màxims estiguin en fase, de tal manera que les intensitats se sumin. La radiació dispersada pren una orientació amb un determinat angle d’scapping i que compleix la fórmula de Bragg: Si es compleix aquesta fórmula, haurà interferència constructiva. Podem aïllar l’equació anterior i obtenim que: Així doncs, de la fórmula podem extreure que el sinus de l’angle és inversament a la distància que es repeteix, és a dir, com més gran sigui l’angle, més petita és la distància entre el patró que es repeteix. Per tant, es genera un diagrama de difracció on l’espai és invers.
Tornant a la imatge de la pàgina anterior, podem dir que les taques llunyanes al centre, fan referència a estructures que es troben a prop i les taques properes, estan lluny. Aquest fet és contrari al que esperaríem.
5 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego 3.
Biologia molecular T2 Contribució de Linus Pauling Al 1951, el bioquímic Linus Pauling també van aportar informació sobre els raigs X que Watson i Crick van aprofitar.
Pauling va establir la hèlix alfa de les proteïnes.
A la imatge de l’esquerra veiem un diagrama de difracció d’una estructura helicoïdal que en aquest cas no és una proteïna. A la dreta podem observar un esquema en el qual si disposem de fibres de DNA més o menys orientades i fem incidir raigs X, aquells que no es desviïn aniran a parar a l’stopper i els altres donen un patró de taques que podem observar.
Pel que fa a la terminologia, podem dir que la línia central es coneix com a equador i en conseqüència, les taques que surten de la part central s’anomenen taques equatorials. Les altres taques es coneixen amb el nom de taques meridionals.
Sempre que es fa difracció d’àcids nucleics es troba al patró de difracció unes taques situades a la part inferior i superior molt intenses que fan referència a estructures que es troben repetides. Aquestes taques que són successives capes es coneixen com layer lines.
Per tal de demostrar que un diagrama correspon a una estructura helicoïdal s’empra un model pedagògic elaborat per uns bioquímics que consisteix en un escalat de dimensions que es va fer en diapositives. En cada un dels espais de la diapositiva es va posar una estructura regular que es repetia moltes vegades. Podem veure a la imatge les diferents estructures que van elaborar, entre les que trobem estructures amb línies paral·leles orientades, línies paral·leles inclinades cap a una banda o una altra,etc.
6 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia molecular T2 Això ho van fer per tal de trobar diferents patrons de difracció, entre els quals trobem el d’estructures helicoïdals. En aquest cas, irradiar amb un laser de llum vermella era suficient per produir un patró de difracció on la longitud d’ona del raig incident és molt més gran que la dels raigs X i també més energètica. Per tant, quan Watson i Crick treballaven el tema de patrons de difracció, ja hi havia coneixement sobre quin era el diagrama de difracció d’estructures helicoïdals.
Interpretació del diagrama obtingut per Watson i Crick La part més bàsica i evident del diagrama fa referència a les gruixudes taques que trobem a la part superior i inferior. Per la teoria de Bragg, sabem que com que estan a una distància gran, l’angle de difracció serà petit. Concretament, la distància de repetició és de 3,4 Å. Aquestes taques tan intenses són degudes a què hi ha moltes parelles de bases apilades que donen un patró de difracció i provoquen una difracció molt intensa.
Pel que fa a les layer lines podem afirmar que no estan totes ja que el material i les condicions no eren les òptimes. La taca més interna està a una distància de 3,4 nm,és a dir, la distància bàsica i fonamental és justament 10 vegades més petita. Amb això van arribar a la conclusió que es tractava d’una hèlix que cada 10 elements es produeix una volta completa. Cal tenir present però, que tot això són hipòtesis que provenien de interpretacions del patró de difracció obtingut.
4.
Models moleculars Watson i Crick també tenien al seu abast models moleculars que havien estat elaborats pels químics i que els hi permetia conèixer la midà dels àtoms i la distància entre els enllaços. Aquest fet era un gran avanç ja que no pensaven en el buit si no que tenien l’ajuda de models moleculars que estaven construïts a escala.
Així doncs, podien situar els diferents àtoms que formen part de les riboses i de les bases nitrogenades. A més a més, el model molecular també els hi permetia veure quins eren els enllaços que tenen la capacitat de girar.
5.
Propietats químiques Per una altra banda, també disposaven informació sobre les propietats químiques de les bases nitrogenades. A les imatges podrem veure com la química de les bases no és trivial ja que, per exemple, la adenina i la citosina podien tenir diferents formes tautomèriques, és a dir, podien ser la forma amino o bé la imino.
7 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia molecular T2 Quan adopten la forma amino, trobem el grup –NH2 (amina), en canvi, en el cas imino es forma un doble enllaç fent que el nitrogen no pugui girar i obtenint així dues conformacions: hidrogen a la dreta o hidrogen a l’esquerra. A més a més, abans el nitrogen podia fer un pont d’hidrogen actuant com a acceptar, però ara aquest pont d’hidrogen es podrà fer si l’hidrogen incorporat actua com a donador; aquest fet es pot observar a l’esquema. El que passa amb la citosina és equivalent al que passa amb la guanina.
Pel que fa a la guanina i a la timina es produeix una tautomeria ceto – enòlica, on el carbonil es transforma en un hidroxil fent que el doble enllaç canviï de posició. Amb aquest canvi tornem a canviar la formació de ponts d’hidrogen ja que el nitrogen era un donador i ara passa a ser un acceptor, a més, l’oxigen que abans era un acceptor, com que incorpora un hidrogen es torna un donador.
Watson i Crick sabien tot això gràcies als experiments realitzats prèviament pels químics. Per tant, van considerar que les bases prenien les formes més probables, les més estables i que estaven més estona. Cal remarcar que si haguessin treballat amb totes les formes possibles, hagués estat un treball molt més complex.
6.
Lleis de Chargaff Watson i Crick també tenien al seu abast els resultats de Chargaff que recordem que afirmaven que A = T i C = G. Tenint en compte quines eren les possibilitats de formar ponts hidrògens, considerant les formes majoritàries (amino i ceto), van proposar els ponts d’hidrogen que s’establien en la hèlix. Concretament, s’establien 2 ponts d’hidrogen entre adenina i timina i 3 ponts d’hidrogen entre citosina i guanina.
8 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia molecular T2 Estructura del DNA des del punt de vista químic Amb el que hem vist fins ara, Watson i Crick van determinar que una estructura com el DNA pot formar hèlix des d’un punt de vista químic.
Les dimensions de les bases, que segons un químic no són un pla matemàtic, tenen unes dimensions físiques; concretament, un gruix de 3,3 Å (que no és menyspreable). Les dimensions establertes fan que quan les bases s’uneixin per enllaços éster fosfòric, tenint en compte quines són les distàncies atòmiques i les longituds dels enllaços, podem establir que dues bases quedaran separades per 6Å. El forat que queda, des d’un punt de vista químic, no té molta lògica ja que les bases tenen propietats hidrofòbiques i per tant, si aquest forat s’omple d’aigua, les bases no estaran còmodes.
Per tal d’evitar que es formi, l’estructura s’inclina però respectant quina és la distància entre els àtoms i enllaços. Amb això aconseguim que les parelles de bases es toquin, i així reduir la part hidrofòbica exposada a solvent (aigua). Tot i això, queda una proporció que encara es pot reduir més si la estructura rota i adquireix forma d’hèlix.
Així doncs, gràcies a les eines anteriorment nombrades i als coneixements sobre química que Watson i Crick tenien, van elaborar un model molt raonable sobre l’estructura del DNA.
Si tens a l’abast totes aquestes eines i coneixements sobre química, pots elaborar el model que ells van fer duna manera raonable.
Les dues hèlix han de ser cadenes que parteixin d’un mateix eix, això és degut que hem generat l’estructura recargolant les cadenes entorn a un eix central. A partir de models es pot veure si és més estable que siguin hèlix paral·leles o bé antiparal·leles. Watson i Crick van veure que la hèlix del DNA era una estructura antiparal·lela i que d’aquesta manera no es produïen interferències estèriques i quedava una hèlix molt més ben formada.
9 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia molecular T2 El diàmetre de les hèlix és de 2 nm (20 Å), que per una banda prové de l’aparellament d’una purina (base gran) amb una pirimidina (base petita). Hem de tenir en compte que, el gruix de la zona serà el mateix si s’aparella A – T com si s’aparella G – C, ja que hi ha exactament 1,08 nm entre el carboni del sucre que pertany a una base i el carboni del sucre que pertany a l’altra base. .Per una altra banda, hem de tenir en compte els fosfats que formen part de l’estructura. Així doncs, en conjunt obtenim que el diàmetre de la hèlix és d’aproximadament 2 nm. Diem aproximadament perquè la hèlix no és totalment un cilindre sinó que és una estructura molt complexa.
Recordem que en l’estructura que Watson i Crick proposaven, el fosfat està situat cap en fora. Això té lògica química ja que els fosfats són molt polars. El sucre també és polar i per això està situat més cap en fora. Cal tenir present que el fet que el fosfat estigui situat a l’exterior és una cosa raonable però no és trivial ja que una mica abans que Watson i Crick publiquessin el seu model, el químic L. Pauling va proposar un model on els fosfats estaven orientats cap a dins.
Com hem dit anteriorment, el DNA de Watson i Crick (DNA tipus B) té 10 parelles de base per volta. Una hèlix no només es caracteritza pel nombre de pb per volta sinó que també ho fa pel pas de rosca que fa referència a l’avenç que es produeix en cada volta completa. En el cas del DNA tipus B, el pas de rosca és de 3,4 nm/volta.
En la hipòtesi de Watson i Crick, les parelles de bases estan apilades i, essencialment, són paral·leles entre elles. Estan orientades respecte de l’eix central de l’hèlix perpendicularment. Una altra cosa que caracteritza el model és que la hèlix avança cap a la dreta.
La hèlix de DNA no és totalment un cilindre ja que és una estructura molt irregular. L’estructura que té fa que observem una zona coneguda com a solc gran i una altra com a solc petit, aquest fet ho podem veure a la imatge superior. Això es produeix perquè les riboses no estan situades en el centre de les bases. Que hi hagi un solc gran i un solc petit ve relacionat amb el reconeixement, ja que hi ha proteïnes que reconeixen el DNA en punts específics segons els solcs.
10 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia molecular T2 TÈCNIQUES EMPRADES EN L’ESTUDI DEL DNA La biologia molecular es caracteritza perquè s’ha apropat al coneixement a partir d’àmbits molt diversos. Farem un salt en el temps ja que va ser a partir del 1953 quan es van començar a desenvolupar tècniques més modernes que van permetre l’estudi del DNA.
Microscopi de força atòmica (AMF) i microscopi efecte túnel (STM) El microscopi de força atòmica, AMF (Atomic force microscope), i el microscopi d’efecte túnel (STM) (scanning tunneling microscope) van estar dissenyats per un investigador que va rebre el premi Nobel. Avui en dia, el AMF és un dels microscopis més emprats actualment.
Les dues tècniques es fan per palpació de la mostra a través d’una sonda. En el cas del microscopi de força atòmica està més clar ja que el fonament d’aquest microscopi està basat en una punta molt fina (sonda) que passa per sobre de la mostra que ha d’estar estesa correctament. Així doncs, on hi ha protuberàncies, l’agulla pujarà i on hi ha solcs, l’agulla baixarà; la punta és sensible a la mostra i podem escanejar tota la superfície amb el que obtindrem una imatge topogràfica. Cal tenir present que, la sonda, per tal que la imatge obtinguda s’apropi a la realitat, ha de terminar en un sol àtom.
Pel que fa al microscopi d’efecte túnel, la imatge que obtenim està basada en els canvis de conductivitat elèctrica. En aquest cas, la imatge és més indirecta i per tant, més difícil d’entendre.
Amb el microscopi STM es van aconseguir obtenir imatges del DNA molt precàries. La imatge s’obtenia perquè si mirem la estructura de la doble hèlix de Watson i Crick, hi ha zones més primes i altres més gruixudes. Per tant, les propietats elèctriques de conductivitat canvien i per aquest motiu van poder obtenir les imatges. La interpretació que van fer és que es tracta d’una doble hèlix que va girant. Cal tenir present que les zones que tenen més intensitat corresponen a la part més gruixuda de la doble hèlix.
11 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia molecular T2 Amb el microscopi de força atòmica, la sonda és capaç de recollir les protuberàncies de la mostra tot i ser molt petites. Això és gràcies que la punta és molt prima i toca la mostra. La sonda està muntada sobre un trianglet brillant que actua com a motlle, està fet d’un material elàstic que aguanta la mostra i la presenta sobre el substrat. Així doncs, la punta es va movent sobre la mostra i pujarà o baixarà en funció de la topologia.
Recordem que el diàmetre del DNA és de 2 nm de manera que aquest aparell ha de tenir una gran precisió.
Un làser envia llum sobre el triangle elàstic i com que té la capacitat de reflectir la llum (amb un determinat angle), aquesta és captada per un mirall que acaba en un receptor. Quan la sonda puja o baixa, aquest angle de reflexió varia, però ho fa molt poc; de manera que no seria apreciable. Recordem que els angles tenen una propietat que ens soluciona aquest problema: si tenim un angle molt petit, en comptes de mirar el valor de l’angle a prop del centre ho fem des de més lluny, per tant, la distància serà més gran però l’angle continua sent el mateix. Això ens serveix perquè segons com arribi la llum, podem com és la protuberància que està produint aquest angle.
Amb el microscopi de força atòmica es van obtenir altres imatges del DNA on també s’observava una certa helicoidicitat.
Gràcies a les noves tècniques, es pot veure de manera total com el DNA segueix una estructura helicoïdal, a més a més, com les distàncies proposades per Watson i Crick coincideixen. Avui dia s’utilitzen imatges en funció de barres de colors, és a dir, són tècniques per donar sensació i que permeten tenir una idea del gruix intuïtivament.
Cal tenir present que el model de Watson i Crick no és l’estructura del DNA sinó que és una proposta, és a dir, una hipòtesi estructural. Així doncs, no van descobrir l’estructura del DNA, categòricament, sinó que van fer una hipòtesi raonable. Avui en dia, sí que podem dir i demostrar quina és la estructura del DNA.
Un altre avantatge que té el microscopi AMF és la capacitat de treballar en medi aquós. Això és molt positiu ja que moltes vegades ens interessa veure les estructures en el seu estat fisiològic, com ara el cas del DNA, i aquest sol ser un estat aquós.
A classe de problemes veurem com s’ha pogut determinar la periodicitat helicoïdal del DNA a partir d’una digestió enzimàtica.
12 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia molecular T2 DESNATURALITZACIÓ DEL DNA Experiments fets per René Thomas A l’any 1951, és a dir, abans de la proposta de Watson i Crick, René Thomas que era un autor francès estava fent la tesi i va trobar uns resultats estranys que el van portar a descobrir la desnaturalització del DNA i alhora a adquirir informació molt important sobre l’estructura secundària.
R. Thomas feia espectres d’absorció del DNA purificat. Veiem que el DNA té un màxim d’absorció a 260 nm. Per una altra banda, també disposava dels valors del coeficient d’absorció de tots els nucleòtids: A, C, T i G. També era capaç de determinar el % de cada base en una molècula de DNA que ell havia preparat; per tant, si es suma l’absorció de cada nucleòtid, considerant quina és la proporció, obtindria un espectre teòric de l’absorció del DNA.
Aquesta suma teòrica li donava un espectre significativament més alta, d’un 30% superior. Això no era el que s’esperava i per assegurar-se que no hi havia errors amb les sumes que ell feia a partir de les dades d’absorbància dels nucleòtids, va sotmetre a aquest DNA a hidròlisi forta (concentracions elevades d’àcid i temperatura elevada). Un cop fet aquest procediment, quan mesurava l’absorbància obtenia un valor experimental que concordava amb el teòric. Això volia dir que el càlcul que ell havia fet era correcte.
La disminució de l’absorbància del DNA es coneix com efecte hipocròmic. Aquest investigador va veure que si disposem del DNA amb una absorbància inferior a la teòrica, es pot augmentar si escalfem el DNA lleugerament o bé augmentem l’acidesa. A aquesta transformació se li anomena com efecte hipercròmic. Més endavant, es va veure que l’efecte hipercròmic també es pot René Thomas va arribar a la conclusió que en a l’estructura del DNA passen coses importants i que no afecten a l’estructura del DNA però sí que canvien les seves propietats. Això va fer que afirmés que el DNA té una estructura secundària que es veu afectada per les condicions externes; es canvien les propietats de les bases nitrogenades. Cal remarcar que diem bases nitrogenades perquè ni els fosfats, ni les riboses contribueixen a l’absorbància en aquesta longitud d’ona; només poden contribuir les bases perquè són estructures que contenen anells aromàtics capaços d’absorbir a longituds d’ona grans. Per tant, el DNA pot perdre la seva estructura secundària amb facilitat i obtenim el DNA desnaturalitzat.
Aquest tema ha donat molt joc, avui dia hi ha moltes proves que indiquen que la desnaturalització del DNA equival a la separació de les dues cadenes. El que Thomas veia era com el DNA natiu, conegut també com dsDNA (double stranded), es transformava en DNA dues cadenes senzilles, conegut com ssDNA (single stranded). (ds DNA, double stranded) 13 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia molecular T2 Temperatura del fusió: Tm Cada DNA que s’estudia té una característica que es pot trobar experimentalment i que és anomenada com temperatura de fusió. La desnaturalització, sovintment, s’aconsegueix escalfant el DNA i per poder estudiar-la, al laboratori escalfem la mostra del DNA i observem la seva absorbància a 260 nm. De manera que en aquest experiment, que es coneix amb el nom d’experiment de fusió del DNA, on el DNA es desnaturalitza, el que es fa és augmentar la temperatura i mesurar la absorbància. És fa un gràfic on a l’eix de les Y es representa la temperatura i al X l’absorbància a 260nm.
Les corbes de fusió tenen una temperatura característica que és coneguda com la temperatura de fusió i que fa referència a la temperatura que provoca la meitat de la transició. Hi ha dos mètodes per calcular quin és el valor de la Tm. Per una banda, es pot mesurar a partir de la gràfica, on la temperatura que es trobi en la meitat entre l’absorbància inicial i la final serà la Tm. Per una altra banda, es pot mesurar d’una altra manera que és la que se sol aplicar: es fa la derivada empírica, és a dir, numèrica de la corba. Sabem que el punt on el pendent és més gran fa referència al moment on el canvi és del 50%, és a dir, correspon a la temperatura de fusió.
A la imatge podem veure els resultats de la experimentació: a l’esquerra la corba de fusió (a) i a la dreta la derivada de la corba de fusió. En aquests experiments es va utilitzar DNA que procedia de vedella.
14 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia molecular T2 Es va observar una mena de llei on la temperatura de fusió (Tm) varia en funció del % en GC. Per una altra banda, la temperatura de fusió també varia en funció de la concentració salina del medi: com més gran sigui la concentració d’ions monovalents, la Tm augmenta. Hi ha fórmules empíriques que ens permeten conèixer quina és la Tm en funció de la + fracció molar de GC (XG-C) i la quantitat d’ions monovalents, que sol ser sodi ([Na ]): La temperatura de fusió augmenta quan afegim concentracions altes de sal perquè el DNA s’estabilitza ja que s’eliminen les repulsions. Recordem que la doble hèlix està carregada negativament, aleshores, si augmentem la concentració d’ions sodi (càrregues positives), les càrregues negatives es veuen apantallades i per tant, la repulsió entre les dues cadenes es veu reduïda. És per aquest motiu que cal més temperatura, és a dir, més energia tèrmica perquè les dues cadenes se separin.
Hem de tenir en compte que en el laboratori, per precaució, sempre que tenim DNA hi posem una certa concentració d’ions monovalents com ara sodi o potassi. Amb això aconseguim que a temperatura ambient continuem mantenint la doble cadena del DNA ja que sinó la repulsió electroestàtica seria molt gran i només trobaríem ssDNA. Així doncs, afegim contraions per tal de solucionar el problema. Se sap que és més fàcil regenerar un DNA petit amb sal que un de gran.
Intuïtivament, veiem que amb un augment de temperatura, augmenta la energia tèrmica i per tant les dues cadenes se separen. Per una altra banda, el DNA es fon (desnaturalitza) perquè les bases nitrogenades tenen la possibilitat de protonar-se o perdre protons. En conseqüència, si disminuïm molt el pH apareixen càrregues positives que poden estar en les dues cadenes; com que les bases estan molt juntes hi ha repulsió entre càrregues positives (sempre i quan el que fem sigui baixar el pH) i per tant, les dues cadenes se separen.
Estabilització del DNA Hi ha diversos fenòmens que contribueixen a que el DNA s’estabilitzi. Per una banda, un alt contingut en GC afavoreix la estabilitat del DNA ja que entre aquestes bases es produeixen 3 ponts d’hidrogen en comptes de 2. Però això és un tema delicat ja que imaginem que les dues cadenes se separen, com que està tot ple d’aigua, les bases tindran tendència a formar ponts d’hidrògens però amb l’aigua. Per tant, aquesta no és la font principal d’estabilització.
El motiu principal d’estabilització és la hidrofobicitat de les parelles de bases i la seva tendència natural a apilar-se. D’això s’està segur ja que s’han fet experiments on es detecten associacions (amb RMN, cristal·lografia o de propietats col·ligatives) i s’ha vist que inclús quan les bases no formen part de l’estructura del DNA, tenen tendència a interaccionar per les seves parts hidrofòbiques i apilar-se.
Així doncs, la principal estabilització de la doble hèlix ve donada per la hidrofobicitat de les bases i els ponts d’hidrogen contribueixen en menor proporció.
15 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia molecular T2 RENATURALITZACIÓ DEL DNA Experimentació amb DNA de vedella El mateix investigador que hem vist que treballava amb la temperatura de fusió, va fer una corba de refredament controlat (b) de la mostra de DNA de vedella. El que feia era disminuir la temperatura progressivament una vegada el DNA estava fos.
Va aconseguir la absorbància disminuís però no fins el valor inicial sinó fins a un valor intermedi.
Això li va fer pensar que la renaturalizació no era completa ja que si ho fos, hauríem de tornar al mateix valor d’absorbància.
Un problema que tenia aquest experiment era que el DNA amb el que treballava era molt complex. Recordem que es tracta d’un DNA de mamífer (vedella) i que la seva complexitat és tan gran que per fer un experiment de renaturalització s’han de tenir en compte molts temes experimentals que no es van considerar.
Experimentació amb bacteriòfag M13 Posteriorment es va elaborar una altra experimentació en la qual es treballava amb un DNA no tan complex, es tractava de DNA del bacteriòfag M13 que té unes 7.000 pb de bases. Aquest DNA pot ser lineal o circular però en aquest cas el que van emprar era DNA lineal.
En aquest cas, en comptes de mirar la possible renaturalització amb un espectrofotòmetre es va elaborar un gel electroforètic d’agarosa ja que permet que corrin bé en el seu interior DNA grossos. Concretament, es tractava d’un gel d’agarosa no desnaturalitzant, això és important ja que si el DNA és de doble cadena, dintre del gel es podrà mantenir com a tal. En canvi, si fos desnaturalitzant, el DNA es transformaria a monocadena.
Van aconseguir determinar una concentració d’agarosa adequada per tal de poder distingir entre el DNA de cadena simple o doble. En aquest cas, el DNA monocadena migra més enredera. Cal tenir present que depenent quines siguin les condicions es pot aconseguir invertir.
L’experiment consistia en agafar diversos tubs que contenien dsDNA i exposar-los al bany María, de manera que amb la temperatura de l’aigua bullint, el DNA de doble cadena se separa i obtenim el monocadena. Cal tenir present que l’aigua que es troba amb el DNA no bull exactament a 100 graus ja que sempre que tenim una dissolució en aigua, l’aigua no és pura sinó que hi ha ions, a més, hi ha un buffer que ens permet que el pH es mantingui neutre. Per tant, és la presència d’ions el que fa que la temperatura d’ebullició pugi per sobre dels 100 °C. Aquest fet és beneficiós ja que el DNA és una molècula làbil i si la bullim, es podria trencar.
Els tubs que havien estat bullint es passaven a un bany de gel per tal que el DNA estigués en una situació estable, és a dir, congelada. Posteriorment, a aquests tubs se’ls sotmetia a una incubació a 37 °C a diferents temps. Entre el començament de l’experiment i el final, les mostres han estat incubades des de menys d’un minut fins 180 minuts.
16 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia molecular T2 El gel electroforètic que van obtenir va ser: Veiem com de mica en mica va apareixent la banda corresponent a la doble cadena. Finalment, totes les bandes que corresponen al ssDNA desapareixen i únicament trobem dSDNA, és a dir, tot el DNA s’ha tornat doble cadena. Per tant, en aquest experiment, la renaturalització s’ha donat amb plenitud. Podríem dir que l’experiment s’ha produït de manera perfecta ja que al carril 15 veiem una banda molt prima i perfecta.
El fet que l'estructura monocadena del DNA pugui tornar a ser dsDNA es coneix amb el nom de renaturalització o bé hibridació i és una de les tres potes de la enginyeria genètica. Cal tenir present que molts experiments estan basats en aquesta capacitat d'hibridació.
Per tal d'observar a la electroforesi els resultats es va afegir bromur d'etidi que quan s'uneix en el DNA dóna fluorescència vermella. Si som molt rigorosos podríem dir que inclús a la columna 15 hi ha parells de bases que han quedat malament ajuntades però no són suficients com per produir una banda o una llapisada.
17 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia molecular T2 CONFORMACIONS DEL DNA En una seqüència de 10.000 parelles de bases segur que trobem seqüències que són complementaries però que no tenen la complementarietat que necessiten.
L'acoblament màxim es produeix quan són complementàries completament tot i que podem trobar estructures on l'acoblament és parcial i es formin estructures intermediàries i transitòries que al final es van desfent per produir l'estructura més estable de totes, que fa referència a la que té la complementarietat completa.
Les conformacions poden provenir de dos fets: de la lliure rotació de l’enllaç Nglucosídic o bé de les riboses.
Pel que fa a les conformacions que provenen de la rotació de l’enllaç N-glucosídic, veiem el cas de la citidina que és la base més petita de les pirimidines on si el carbonil de la base el fem girar i passem a l’altre conformació extrema hi haurà impediment estèric. Per tant en les pirimidines la única conformació que trobem és la anti. Pel que fa a les purines, és possible tenir les dues conformacions: anti i sin ja que aquest impediment estèric no existeix.
En el cas del DNA de Watson i Criclk, és a dir, en el DNA tipus B, les bases estan en anti respecte a la ribosa.
Pel que fa a les conformacions que provenen de les riboses: sabem que la ribosa es tracta d’un anell que té 5 vèrtex. En un pentàgon regular a cada angle li toca 108° però els carbonis que donen estructura de tetraedre tenen un angle de 109.5°. Per tant, els carbonis no s’hi trobaran bé en aquesta estructura. La manera de resoldre això és fent que l’estructura es deformi una mica i adquireixi una conformació de mitja cadira on un dels àtoms surt del pla de l’anell, d’aquesta manera aconseguim que els valors dels angles s’apropin més als valors que volen prendre. La mitja cadira també té beneficis ja que evita la eclipsi d’àtoms, és a dir, evitar que els àtoms estiguin molt propers a l’espai, la qual cosa seria desfavorable.
18 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia molecular T2 En els DNA, podem tenir diferents conformacions de mitja cadira en la ribosa:  C3’ endo. En la conformació C3’ endo, l’àtom que surt del pla és el carboni 3’ que està situat a la part interna.
S’anomena conformació endo perquè el carboni que ha sortit del pla, es troba en el mateix costat del pla que el carboni 5’.
 C2’ endo. En la conformació C2’ endo, en comptes de sortir el carboni 3’, surt el carboni 2’ i també es col·loca al costat del pla on se situa el carboni 5’. Aquesta conformació és la que trobem en el cas del DNA tipus B.
 C3’ exo. En la conformació C3’ exo, surt el carboni 3’ fora del pla però se situa a la cara oposada al carboni 5’, és a dir, a la part inferior.
Depenent quin tipus de DNA es tracti, podem tenir una conformació de ribosa o una altre que veurem més endavant.
Hem de tenir en compte quina és la conformació de cadira de la ribosa ja que en el DNA qualsevol angle que toquis afecta a l’estructura global. S’ha vist que si la conformació és la C3’ endo, la distància entre dos fòsfors consecutius és de l’ordre de 5,9Å; en canvi, si la conformació és la C2’ endo, la distància és de 7Å. Per tant, canvis en la conformació de la ribosa, tenen repercussions en una altra part de la estructrua.
APARELLAMENT ENTRE LES BASES A la imatge superior de la pàgina interior hem vist que al DNA hi ha molts enllaços que poden rotar. Aquest fet l’hem de tenir en compte a l’hora de plantejar-nos quina és l’estructura del DNA.
Watson i Crick van proposar al seu model del DNA una hipòtesi sobre com s’aparellaven les bases entre sí. Al començament, la comunitat científica no recolzava gaire aquesta proposta però a mesura que van passar els anys se li va donar més valor. A partir d’això van haver-hi diversos intents per intentar demostrar que la hipòtesi que Watson i Crick proposaven corresponia a la veritable estructura del DNA Experiments elaborats per Hoogsteen (1963) Al 1963, 10 anys més tard de la proposta del model de DNA, l’investigador Hoogsteen va fer una experimentació per intentar demostrar que els aparellaments que Watson i Crick proposaven eren correctes.
El seu experiment consistia en barrejar quantitats equimolars dels nucleòsids A i T i per una altra banda, G i C. Cal tenir present que utilitzava nucleòsids, és a dir, formats únicament pel sucre i la base. Hoogsteen volia obtenir uns cristalls per tal de visualitzar quins eren els ponts d’hidrogen que es formaven entre els nucleòsids.
19 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia molecular T2 L’investigador va obtenir uns resultats que no eren els esperats ja que bases no formaven els ponts d’hidrogen que Watson i Crick indicaven. En el cas de la G –C, l’estructura obtinguda és més escandalosa ja que s’indicava que només es produïen 2 ponts d’hidrogen. A més a més, per obtenir aquests cristalls va haver de treballar amb un pH que es trobava entre 4 i 5, de manera que es produïa una protonació que en condicions normals no trobem.
Així doncs, amb aquesta experimentació no es va poder provar que el que proposaven Watson i Crick era correcte.
Experiments elaborats per Alexander Rich (1966) A l’any 1966, al laboratori d’Alexander Rich també es van fer experiments per intentar demostrar amb èxit el que havien proposat Watson i Crick.
Els nucleòtids i, particularment, les bases tenen espectres d’infraroig determinats i que són característics da cadascuna d’ells. Per tant, si fem un espectre d’una dissolució de diferents bases, obtindrem diferents espectres.
Per una banda, podem pensar que si ajuntem G i C a la mateixa cubeta i a la mateixa concentració, si no interaccionen entre elles, esperem obtenir un espectre suma de les bases per separat. Veiem que l’espectre experimental és diferent al calculat considerant que no interaccionen.
Per tant, s’està demostrant que la G i la C interaccionen entre elles formant un complex que altera l’espectre IR. Per una altra banda, si barregem la G amb la A, veiem que entre l'espectre calculat i el que observem, gairebé no hi ha diferència, i per tant, volia dir que la associació entre a i G no es produïa.
20 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia molecular T2 Això va donar peu a què en aquest laboratori veiessin quines eren les associacions més intenses. Ho van fer a partir del càlcul de les constants d’associacions. Donat l’equilibri entre bases, la constant d’associació (K) serà: La concentració de les bases es pot obtenir a partir de les alçades dels pics de IR. A la taula podem observar com la constant d’associació de parelles estranyes com ara AA, UU o CC és bastant inferior a la constant de les parelles AU o AT. La parella GG té més tendència a formar ponts d’hidrogen amb ella mateixa però si comparem la seva constant amb la de GC, continua sent molt més petita, és a dir, més desfavorable.
Cristal·lització del DNA Al 1979 es va fer una passa important en el mateix laboratori de Rich ja que van aconseguir obtenir un cristall de qualitat d'una seqüència de DNA concreta. Això va permetre fer cristal·lografia de raigs X i en conseqüència van determinar amb una gran resolució quina era l’estructura d’aquell petit DNA que havien cristal·litzat. Aquest fet és molt important però s’ha de tenir en compte que el model es va proposar al 53 i aquest avanç es va produir al 79.
Per una altra banda, la cristal·lització es va poder elaborar perquè al 1970 es va aconseguir fer la síntesi automatitzada d’oligonucleòtids. La primera seqüència que es va sintetitzar va ser: CGCGCG que era complementària a GCGCGC i van obtenir un cristall on el DNA no era tipus B.
Al 1963, Khorana va aconseguir fer la síntesi manual d’una seqüència d’oligonucleòtids però va treballar mesos i a més a més, les quantitats que va obtenir van ser molt petites.
Al laboratori de Dickerson també es van fer experiments de cristal·lografia amb altres oligonucleòtids i sí que van comprovar que la forma demostrada amb resolució atòmica era corresponent a l'estructura de Watson i Crick.
Fins casi gairebé els anys 80, no hi havia dades amb resolució atòmica per estar segurs de quina era la veritable estructura del DNA.
21 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia molecular T2 OBTENCIÓ D’OLIGONUCLEÒTIDS SINTÈTICS L’obtenció d’oligonucleòtids sintètics serà una gran millora de cara a la investigació ja que es poden obtenir cristalls de petites seqüències obtingudes artificialment en gran quantitat i amb puresa.
Estudi d’oligonucleòtids amb difracció de raig X Al observar amb raig X els oligos cristal·litzats donen una multitud de taques la qual cosa permet, aplicant les tècniques d’informàtica associades a la difracció del raig X, conèixer la disposició dels diferents àtoms que composen els oligos.
El que veurem en aquest anàlisis ens permet detectar la distribució de la densitat electrònica i a partir d’aquestes densitats que estan representades com corbes de nivells, els investigadors poden localitzar les posicions exactes de les bases nitrogenades o fosfats. Aquest aspecte és molt important perquè no només podem determinar la distància entre bases sinó que també podem conèixer la posició de cada àtom.
Els millors resultats de raig X s’obtenen amb cristalls i podem entendre que l’intermedi per obtenir bons resultats són les fibres orientades mentre que el pitjor serien les fibres no orientades ja que no veuríem cap “taca” intensa sinó que observaríem el DNA com un cercle no orientat en l’espai, una sèrie de cercles concèntrics i per tant, sabríem que hi ha distàncies repetides però no es podria determinar la estructura de Watson i Crick.
Estudi d’oligonucleòtids amb ressonància magnètica Aquesta tècnica l’hem vist amb anterioritat i sempre era aplicada a petites molècules i dona uns senyals (pics) que tenen cadascun una posició que s’anomena desplaçament químic i permet caracteritzar les petites molècules. Aquesta tècnica també és aplicable a diferents proteïnes però quan l’espectre és realment complicat és quan s’elaboren espectres de ressonància magnètica nuclear en dues dimensions.
Aquests últims serveixen per caracteritzar proteïnes o per fer estudis de l’estructura tridimensional del DNA. En la diagonal sempre obtindrem la informació equivalent a la realització d’un espectre normal, en una molècula senzilla obtens informació dels àtoms que estan propers dins l’estructura covalent. Aquells pics que surten fora de la diagonal són interessants perquè corresponen a interaccions no calents, i per tant, ens donen informació tridimensional. Si observem la imatge veiem que els senyals 1 i 2 corresponen a protons entre els quals hi ha una interacció no covalent (indicada amb un punt blanc) de manera que es pot determinar que entre els punts 1-2 i 1-3 existeixen interaccions en l’estructura tridimensional mentre que entre 2-3 no hi ha cap interacció.
22 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia molecular T2 Com a conclusió, podem saber que els diferents tipus d’àcids nucleics tenen un espectre bidimensional de ressonància magnètica nuclear diferent: la forma B del DNA dona un espectre que té una silueta i unes taques fora de la diagonal que són diferents a les taques que s’observen en un espectre de la forma Z o A.
El que caldria remarcar dels estudis amb ressonància és que aquests, en contraposició als estudis amb cristal·lografia es produeixen amb oligonucleòtids no cristal·litzats, no són oligonucleòtids sòlids sinó que estan en dissolució i aquesta situació és més propera a la real. Si observem el següent dibuix les ratlles representen interaccions de forma covalent entre l’esquelet covalent mentre que les discontinues representen ponts d’hidrogen. És molt important tenir present que perquè es produeixin els senyals característics cal que l’estructura tingui una forma tridimensional determinada.
Angles que descriuen els oligonucleòtids Gràcies a la caracterització per mitjà d’estudis amb cristal·lografia i ressonància magnètica s’han resolt moltes estructures i s’ha pogut estudiar els valors dels angles que descriuen els oligonucleòtids: 23 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia molecular T2 Angle Tilt L’angle Tilt pot adquirir diversos valors i és l’angle que es forma enter una parella de bases i la següent en l’estructura, és a dir, sabem que entre una parella de base si la que hi ha a sota hi ha una obertura. En el model de Watson i Crik una parella és paral·lela a l’altre però sabem, que aquest aspecte és erroni ja que entre elles hi ha una angle de 6 graus, de manera que Tilt = 6° en relació a l’eix X.
Angle Roll Aquest és l’angle entre dues bases en relació a l’eix Z.
Angle de twist Sabem que per formar una doble hèlix ham d’enroscar les dues cadenes i per cada 10 parelles de bases es produirà una volta (model de Watson i Crik) de manera que, sabent que una volta són 360° ens dona que en cada volta tenim 36° de manera que en l’estructura W&C l’angle twist representa en cada passa quans graus hem de fer per elaborar l’enroscament. Així doncs aquest angle varia en funció del nombre de parelles de bases que tens per volta.
Angle de propellor twist Dues parelles de bases en lloc de construir un pla sabem que una base respecte l’altre es “torça” una mica, és a dir, s’inclina de manera que les bases no estan en un mateix pla perquè tenen un corbament el que rep el nom de propellor (com els angles de la hèlix d’un avió). Les bases estan generant una obertura i es podria pensar que es tracta d’un angle de roll però no és cert perquè hem de pensar que les bases de dalt i de sota estan paral·leles però les dues parelles tenen un cert angle de propellor de 20°.
Els àcids nucleics tenen aquest angle perquè no podem oblidar que les parelles de bases estan apilades però alhora tenen un twist de manera que una parella no tapa totalment la parella de sota el que genera uns punts al descobert que poden interaccionar amb l’aigua, el que és energèticament desfavorable. Si no hi ha un angle de propellor la interacció entre les dues bases deixarà molts llocs buits mentre que si es genera una inclinació la zona d’interacció de entre les parelles és més gran i per tant, es poden donar més interaccions hidrofòbiques que no permeten les interaccions amb l’aigua.
24 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia molecular T2 Slide Observem que els diferents eixos ens defineixen angles i també observem un nou element que no és un angle però sabem que sovint es nota un deslliçament (slide) d’una prella de bases repecte l’altre, és a dir, estan corregudes respecte l’eix X.
Valors dels angles Els valors que s’han trobat dels angles són:  Angle de Twist: 36° (estructura de W&C) però en realitat estan en el interval 28°-42°  Angle de roll: valors que van des de -10° a +20°  Angle de Tilt: entre 6°-20°  Slide:es dona entre 2Å i -1Å Pis pirimidina – purina Existeix la possibilitat que s’encarin dues purines o dues pirimidines o que es combinin entre elles, és a dir que tinguem pirimidina – purina, i quan això últim passa, quan tenim en el pis de d’alt una base tipus pirimidina i a baix una purina és complicat perquè l’estructura vol fer el típic angle de propellor, que pot ser un angle gran per minimitzar l’energia però aleshores, en aquest punt hi ha un impediment estèric, és produeix un xoc entre les protuberàncies, entre les cantonades de les bases.
Aquest aspecte s’ha de resoldre perquè afecta a l’estructura i la manera que té es generant un angle de roll pronunciat, de 20°, aleshores es produeix un slide significatiu (2Å) el que permet que la estructura pugui fer una bona interacció hidrofòbica i que els problemes d’impediment estèric no es donin.
Es genera una estructura en que es modifica tot però que aconsegueix una estabilitat màxima modificant distàncies i angles entre les bases.
En la següent imatge observem que al generar un slide de 2Å si tens dues parelles de bases, l’angle de twist passa de 36° a 28° de manera que si toquem un dels paràmetres que defineixen la posició entre bases també es modifiquen els altres.
25 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia molecular T2 Trobem que molts dels oligos que s’estudien tenen poc roll i deslliçament, que pot arribar a ser nul o bé que aquests paràmetres siguin molt petits. Hi ha una zona en que les parelles pirimidina – purina tenen uns valors grans d’aquests angles, el que defineix dos famílies de tipus de DNA (descobertes en el mateix moment):  Família de la forma A: Té un Roll de 12° i un slide de 2Å  Família de la forma B (W&C): Té un Roll i un slide nul de manera que hi ha un apilament clar i senzill. Ç Observem en la següent imatge diferents disposicions d’aquests dos paràmetres: FORMA A DEL DNA Aquesta forma té propietats diferents a la forma B, que és la de Watson i Crick. La forma B globalment és més lalrga que la forma A pel mateix nombre de parells de bases de manera que la forma A té els solcs diferents a la forma B. Si mirem les parelles de bases veiem que estan disposades a l’entorn d’un forat central petit.
El DNA es prepara precipitant amb etanol i el DNA de tipus A el van trobar quan en la mostra que posaven davant del raig X (recordem que la mostra es posa una vegada ha estat estirada i dins de capil·lars de quars, es segella el capil·lar pels dos extrems de manera que la mostra queda amb una humitat controlada) i encara retenia una gran quantitat d’etanol (75%). Així doncs és una forma estranya perquè per un bioquímic interessa aquella forma que estigui en el sistema cel·lular i sabem que tot i que l’etanol sigui un metabòlit mai no està en la cèl·lula en un 75% de manera que va ser una estructura descoberta en el laboratori. Encara que s’hagi descobert en condicions de laboratori però aquesta és la forma que adopten els híbrids de DNA i RNA o bé quan el RNA forma dues cadenes perquè el carboni 2’ de la ribosa del RNA impedeix la formació de l’estructura B. A la forma A tenim pel que fa a la conformació de la ribosa que el carboni c3’ endo com a conformació mentre que en la forma B tenim el c2’ endo. Si ens fixem en el nucleòsid (posiicó de la ribosa en relació a la base, és a dir, la conformació relacionada amb l’enllaç n-glucosídic) tenim que en tots dos casos la conformació és anti. Observem doncs que petits detalls alteren l’estructura el que permet descriure noves famílies estructurals.
26 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia molecular T2 ESTUDI DE L’ESTRUCTURA DEL DNA A PARTIR D’OLIGONUCLEÒTIDS La estructura del DNA que Watson i Crick van hipotetitzar és l’estructura que ha quedat consolidada a partir de molts dels estudis fets amb oligonucleòtids. De manera que, els oligonucleòtids purs que s’han sintetitzat químicament, elaborat cristalls i analitzats per trobar la seva estructura tridimensional ens porten a la conclusió que la forma B del DNA és la forma dominant.
Vam veure que en dissolució aquosa, el DNA s’aproximava a l’estructura del DNA B. Cal tenir present que Watson i Crick suposaven que hi ha 10 pb per volta i en dissolució eren 10,5 pb/volta.
Fruit de l’estudi d’una gran quantitat d’oligonucleòtids sintetitzats i analitzats, podíem entendre altres formes de DNA, com ara el DNA tipus A que es va trobar en els mateixos mesos que el DNA B. La forma A es podia entendre perfectament ja que es podien determinar els angles i els slides que hi havia.
A l’any 79 es va analitzar als laboratoris de Rich una oligonucleòtid que tenia la seqüència CGCGCG i van obtenir una estructura que no esperaven. Aquest oligonucleòtid adoptava el que avui dia coneixem com DNA Z que és molt diferent als altres dos tipus de DNA.
Estudis elaborats per Jovin Els estudis amb oligonucleòtids de l’estructura del DNA arrenquen anys abans, al 1972, Jovin, un altre científic argentí, treballava a un laboratori alemany i utilitzava nucleòtids no tan definits com els que va emprar Rich, és a dir, tenien diferents pesos moleculars. Cal tenir present que Rich treballava amb oligonucleòtids de 6 bases.
Nomenclatura Normalment, quan escrivim les seqüències dels oligonucleòtids ometem la lletra d de desoxi, com anteriorment en la seqüència de Rich (CGCGCG). Trobem diferents nomenclatures per fer referència als oligonucleòtids:  (dGdC)n i poli dGdC són nomenclatures que ens indiquen que l’oligo es repeteix n vegades.
 La nomenclatura poli dGdC . poli dG dC fa referència a una doble hèlix. Cal tenir present que les dues nomenclatures anteriors també poden fer referència a doble hèlix però no està totalment determinat.
En aquest cas es fa referència als desoxinucleòtids G i C però podrien ser altres.
27 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia molecular T2 Espectres de dicroisme circular del DNA Jovin va trobar que quan treballava el DNA dels oligonucleòtids sintetitzats, l’espectre observat era completament diferent a l’espectre del DNA B. Els espectres es van fer mitjançant la tècnica de dicroisme circular que s’obté amb llum polaritzada circularment.
La llum polaritzada plana és aquella que aconsegueix que la llum vibri en un sol pla. En el dibuix observem que la llum polaritzada plana té un camp elèctric que és on oscil·la. Tècnicament, la oscil·lació no es perfecta en el pla però sí que s’acosta. Per una altra banda, la llum polaritzada circularment és una llum polaritzada però en aquest cas està girant sobre un eix. Cal tenir present que es pot aconseguir que aquesta llum giri tant cap a la dreta com cap a l’esquerra.
Elaborant un experiment amb un aparell que permet tenir llum polaritzada que va cap a la dreta i cap a l’esquerra van aconseguir obtenir espectre típic de DNA B que està representat amb una línia continua. A l’espectre es representa la longitud d’ona respecte l’absorció de la llum L (polaritzada cap a l’esquerra) menys l’absorció de llum D (polaritzada cap a la dreta).
Quan al laboratori de Jovin es feien servir DNA amb una alternança de GC, l’espectre que obtenien era molt diferent al del DNA tipus Z. En aquest assaig, a part d’utilitzar aquests oligos es feia en presència d’una concentració de clorur de sodi molt elevada, de 3 o 4 M. Aquestes dues condicions esdevenien en un DNA amb un espectre molt diferent conegut com DNA Z; el nom de DNA Z va ser concedit per Rich i no per Jovin.
Estudis elaborats per Rich Rich va triar l’oligonucleòtid CG perquè volia obtenir uns resultats molt diferents als que proposaven Watson i Crick. Quan va elaborar els estudis va veure que l’estructura obtinguda era completament a la del DNA B.
Per una banda, el DNA va cap a la dreta (dextrogir) i el DNA Z cap a l’esquerra (levogir). Això ho van poder determinar perquè la llum polaritzada quan toca la matèria és molt sensible, és a dir, nota diferències molt importants segons qui l’evita.
28 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia molecular T2 Nomenclatura DNA Z El DNA Z va ser anomenat així degut al patró que segueixen els fosfats en la seva estructura. Si nosaltres seguim els fosfats en l’estructura del DNA B, les podem unir a partir de línies que són monòtones i que segueixen progressivament l’estructura. Per una altra banda, en el DNA Z la línia que ressegueix els fosfats és una línia feta fallida i que té semblances amb la lletra Z.
Canvi de DNA B a DNA Z Imaginem que tenim un DNA doble cadena en forma B, per tal que el tros del mig es converteixi en DNA Z s’ha de produir un gir de 180° en una regió. A l’esquema veiem que l’autor ha invertit les lletres per tal de visualitzar-ho.
En el cas del DNA B, totes les conformacions que tenim en la formació de l’enllaç N-glucosídic són del tipus anti. Pel que fa a les riboses veiem que totes són del tipus endo.
En el cas de la forma Z, observem que les purines adopten la conformació sin i les pirimidines anti. En tots dos casos, l’enllaç N-glucosídic és del tipus endo.
Per tal que el DNA passi a DNA tipus Z ha d’haver-hi una alternança entre purines i pirimidines, és a dir, les passes han de combinar una pirimidina i a sobre una purina. És per aquest motiu que hi ha autors que consideren que la unitat bàsica del DNA Z no és una parella de bases sinó que són dues parelles de bases.
Es per això que hi ha autors que en aquest DNA z consideren que la unitat bàsica no és una parella de base sinó que són dues parelles de bases que tenen la propietat de que si tenim una pirimidina just a sota tenim una purina.
29 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia molecular T2 Distància entre els fosfats en el DNA Z Distància entre els fosfats de dues cadenes Si estudiem un DNA Z i mirem quina és la distància que hi ha entre els fosfats d’una cadena respecte l’altre obtenim que és de 0,8 nm. Recordem que la distància que hi ha en el DNA B, és a dir, el normal és de 1,2 nm.
Aleshores, un DNA no tindrà tendència a adoptar la conformació Z ja que per fer-ho té un entrebanc i és que quan s’apropen les dues cadenes s’elaboren repulsions.
Recordem que en l’experimentació de Jovin es treballava amb una alta concentració de sal, amb això aconseguim augmentar la concentració d’ions sodis i en conseqüència apantallar la càrrega dels fosfats. Per tant, una elevada concentració de sal afavoreix la formació del DNA Z degut que disminueix les repulsions que es produeixen a l’apropar els fosfats.
Distància entre fosfats de la mateixa cadena En el DNA B tenim el sucre unit en c2’ endo i la guanina està en conformació anti, és a dir, queda orientada cap al sentit contrari a la ribosa. Aquest fet provoca que la distància que hi ha entre un fosfat i el consecutiu sigui significativament més gran que la distància que hi ha entre els fosfats consecutius que estan formant una cadena de Z DNA. Aquest fet és degut que la guanina canvia la seva conformació d’anti a sin i per tant queda cap al costat de la ribosa; a més, el sucre ara és c3’ endo. Aquests dos esdeveniments fan que la distància entre els dos fosfats sigui més petita.
Tipus de DNA A la imatge veiem una foto comparativa dels 3 tipus de DNA. Cal tenir present que a les tres figures els hi correspon el mateix nombre de parells de bases tot i que són substancialment diferents.
A continuació observem una taula comparativa que cal estudiar amb detall i entendre les característiques de cada tipus.
30 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia molecular T2 Oligo dA . oligo dT L'oligo dA . oligo dT quan es va estudiar es van obtenir uns resultats una mica sorprenents. Aquest oligo fa referència a una cadena composada totalment per A i la complementària per T i es va observar que és un DNA que és molt rígid, per tant, costa molt que es corbi. Cal tenir present que el DNA en els organismes és una molècula molt llarga i com que les cèl·lules són estructures molt petites cal que tingui una flexibilitat molt gran.
L’assaig per determinar la rigidesa d’aquest oligo es va fer a partir de les proteïnes histones ja que se sabia que qualsevol seqüència aleatòria del DNA, en barrejar-se amb histones, dóna un plegament al voltant d’aquestes proteïnes. Amb l’experimentació es va demostrar que aquesta seqüència no era capaç d’enrotllar-se al seu voltant.
Quan van estudiar cristal·logràficament aquest oligo van poder determinar el perquè d’aquesta rigidesa. Es va observar que a part d’haver-hi ponts d’hidrogen entre A i T, que són els que s’elaboren normalment, hi havia ponts d’hidrogen travessers o bifurcats que van d’una parella de bases a l’altre. Així doncs, eren aquests ponts d’hidrogen addicionals els causants de la rigidesa.
A la representació del DNA amb paral·lelepípedes podem veure clarament com l’angle de propeller que hi ha afavoreix que es produeixin aquests ponts d’hidrogen travessers ja que els àtoms queden prop a l’espai. Si ens hi fixem afecta a l’oxigen 4 de la T i al nitrogen 6 de la A.
31 ...