HH (2007)

Otro Portugués
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Bioquímica - 5º curso
Asignatura HH
Año del apunte 2007
Páginas 22
Fecha de subida 19/10/2014
Descargas 11
Subido por

Vista previa del texto

Química i Enginyeria de les Proteïnes 25/09/13 TEMA 2 – L’enllaç peptídic i la seqüència polipeptídica 1. Estereoquímica de l’enllaç peptídic 2. Tipus de pèptids naturals 3. Reactivitat química a pèptids 4. Implicacions estructurals i funcionals de la seqüència polipeptídica 5. Estratègies per a la determinació de la seqüència de proteïnes 6. Síntesi química de pèptids; llibreries combinatorials 1. Estereoquímica de l’enllaç peptídic Els aminoàcids s’enllacen amb enllaços peptídics per formar estructures polipeptídiques.
- - És un enllaç de tipus amida on s’ha d’alliberar una molècula d’aigua per formar-se, és una reacció de condensació. La seva ruptura serà una hidròlisi. És extremadament estable si la reacció no està catalitzada.
- - Dóna lloc a una polaritat a la cadena (comença sempre per N terminal i acaba per C terminal, sobretot cal indicar sempre quin extrem és).
- Les carregues no són disposades de manera uniforme (molt important per l’estructura tridimensional de proteïnes). L’oxigen del carbonílic te la majoria de carrega negativa i l’hidrogen del NH té la majoria de carrega positiva. Cada enllaç peptídic genera un dipol. A mida que avancem en la cadena el dipol es va invertint (cap a dalt, cap a sota consecutivament).
- Tenim l’α amino, l’únic α carboxil que queda lliure, i també tenim el carboni α unit a la seva cadena lateral (R).
- És un enllaç molt especial ja que té un caràcter de doble enllaç parcial, ni és simple ni doble, es comporta entremig en quan a propietats. És degut a que està estabilitzat per ressonància.
1 Química i Enginyeria de les Proteïnes La constant de trencament (o hidròlisi) d’aquest enllaç és molt baixa o el que és el mateix, temps de vida mitjà molt gran, les proteïnes NO es trenquen fàcilment (si no hi ha ningú que ho catalitzi és gairebé impossible).
- La distància entre C i N (àtoms de l’enllaç) és superior a si fos un doble enllaç però inferior que si fos un simple. Això fa que no hi hagi rotació al voltant de l’enllaç . Els sis àtoms (C, N, O, Cs i H estan al mateix pla, perquè tots depenen d’aquest enllaç i ell no rota). Veiem les proteïnes com una seria de petites plaques (els diferents plans).
Tot i així les proteïnes no són tires, podem trobar-les en formes globulars i han de poder girar per ser-ho sinó seria un pla. Només poden girar per dos llocs sempre al voltant del carboni α, per tant, cada pla girarà respecte els del seu voltant. Giren al voltant del mateix residu, entre les dues connexions entre el carboni α, el carbonil i l’NH.
La propietat anterior defineix dos angles: Aquests dos angles són de 180° en aquesta figura. Sempre són entre 180 i -180 i s’anomenen angles diedres. A través de la cadena es diuen: (on X és l’aminoàcid i els números seran els graus). En aquest cas: Amb aquesta informació poden dibuixar l’estructura secundària.
La part de l’esquelet carbonat (Betbone) és tot el conjunt d’enllaços peptídics i carbonis α sense tenir en compte les cadenes laterals (els angles no ens diuen res de la cadena lateral).
- Si observem també les cadenes laterals dels aminoàcids veiem una de les dues conformacions (ja que no rota): Cis: cadenes laterals en el mateix cantó Trans: cadenes laterals en diferents cantons.
Normalment, trobem trans perquè és més estable. Només la Prolina n’és una excepció ja que és un iminoàcid que la cadena lateral és ciclada i, per tant, tant cis com trans són poc estables ja que 2 Química i Enginyeria de les Proteïnes s’aproparan molt a les cadenes laterals. Un de cada quatre Prolines serà Cis (tot i així el menys inestable és Trans, per tant, també és majoritari).
PROLILTRANSISOMERASA: és un enzim que isomeritza entre les dues conformacions (Cis i Trans) fent que les proteïnes mal sintetitzades puguin ser viables. Però és un procés molt lent, limitant.
2. Tipus de pèptids naturals Molts dels pèptids tenen activitat biològica, la majoria. En molts casos tenen molts pocs residus(petits) i ponts disulfurs. Aquest pont permet que, com que no es pot plegar i formar el nucli hidrofòbic (perquè és massa petit i no hi ha suficients residus), tinguin una restricció espacial i els obliga a doblegar-se en una certa conformació. Cal que tenim en compte que les proteïnes i receptors no només detecten la seqüencia, sinó que també detecten la conformació. És l’exemple de la ocitocina(residus neutres) i la vesopresina (residus -).
Les funcions dels pèptids són molt vàries:hormones, neurotransmitters, antibiotics, toxins També hem vist l’α amantina: és en un bolet (Amanita Faloides), molt tòxica perquè no tenim enzims de degradació i té moltes ciclacions. Té enllaç covalent entre Triptòfan i Cisteina i els extrems N i C ter formen un enllaç amida (peptídic) per formar un cicle.
Té una estructura globular i no té cap element ni α ni β.
3. Reactivitat química a pèptids - Depèn de l’entorn químic dels grups carboxil i amino. Per això el COOH i el grup amino tenen diferent pKa depenent de l’entorn dielèctric. L’aigua té una constant dielèctrica molt gran, per això quan trobem proteïnes en aigua els grups carboxil i amino estaran ionitzats i a l’interior de proteïnes (hidrofòbics) estaran protonats.
3 Química i Enginyeria de les Proteïnes - A més depenent de la seva localització també variarà Hi ha alguns residus com la His que poden ser donadora i acceptadora (depenent de l’entorn).
Van fer un experiment on van mutar un aspàrtic (-) a glutamina (neutre). Al treure aquesta càrrega negativa el pKa baixa ja que si l’entorn està “negatiu” al protó li costa més marxar. Com veiem en l’últim cas el Glu se li treuen quatre càrregues i veiem que el pKa baixa 10 vegades (-1,00).
IONITZACIÓ: Afecta a la solubilitat. Si es produeix agregació perquè la proteïna no és soluble no serveix.
Es veu afectada per: - Concentració de sals - pH - Temperatura - Solvents orgànics La ionització afecta el comportament de les proteïnes en processos de separació.
Per tant, cal jugar amb les propietats del medi (Salting in salting out) 4 FORÇA IÒNICA I SOLUVILITAT Química i Enginyeria de les Proteïnes Afegim sal ( ja que mai es pot purificar amb aigua destil·lada). La solubilitat augmenta i poden començar els ponts salins i interaccions. S’arriba a un Plateau.
Hi ha sals amb sulfat d’amoni (p. ex) a partir d’una concentració alta augmenta molt la interacció amb aigua i la segresten. Així es formen agregats blancs i precipiten (proteïna concentrada).
Agafarem el Pellet i centrifuguem i podrem diluir-lo en solució salina (sense sulfat d’amoni). Així ho tenim purificat.
4. Implicacions estructurals i funcionals de la seqüència polipeptídica DOGMA GENERAL: Tot i que hi ha alguna excepció.
La longitud d’una proteïna: 30-40 aminoàcids (mínim determinat per la mida del ribosoma) fins a 25.000.
Per tant, el pèptid prové d’una proteïna tallada. Si aproximadament tenim 300 aminoàcids el número de seqüències són: 02/10/13 Per una proteïna de 300 aminoàcids el nombre de formes possibles es astronòmica, molt gran. Això vol dir que si dues proteïnes s’assemblen en seqüències no pot ser per atzar sinó que han d’estar relacionades evolutivament => podem mirar com l’evolució ha progressat comparant la seqüència evolutiva.
Per comparar evolutivament una seqüència la introduïm en una matriu on es compara amb totes.
Aquesta matriu dóna un número i això ens permet elaborar un arbre evolutiu, en que podem saber qui prové de qui i quina es la distància evolutiva en temps geològic entre una espècie i una altra. L'evolució pot ser rastrejada a partir de seqüències contemporànies. Aquí tenim un exemple d’una matriu comparant proteïnes de diferents espècies: 5 Química i Enginyeria de les Proteïnes La diferència entre aus i mamífers venen a ser d’uns 10 diferencies mentre que entre totes les aus son d’ aproximadament 2. La diferència entre els organismes pluricel·lulars i unicel·lulars es de 50. Com mes gran es la diferencia mes lluny estàs en l’escala evolutiva.
Això ens permet confeccionar un arbre evolutiu. Aquest cas es un arbre de quinases en que cada família fosforilada diferents fosfats. Comparem la seqüència de les diferents quinases que determina funció => les tenim ordenades per funció. No es té en compte l’espècie que es tracta.
Si una proteïna reconeix com a substrat una ubiquitina, totes les proteïnes que reconeguin la mateixa ubiquitina quedaran agrupades independentment de l’espècie que sigui.
 També es pot confeccionar ARBRES FILOGENÈTICS. L’exemple de l’esquerra és basat en les diferencies del citocrom C.
o Citocrom C és una molècula que tenim tots els eucariotes en la cadena respiratòria i es poden comparar tots ells.
o Això permet construir un arbre i saber a partir del qual es van diversificar plantes, fongs i animals.
6 Química i Enginyeria de les Proteïnes  o Cada espècies dons, tindrà més semblances entre ells que no pas amb les altres.
o Per elaborar-ho només és necessari tenir les seqüències del citocrom C.
Quina proteïna faig servir per fer una arbre evolutiu o filogenètic? No totes les proteïnes evolucionen a la mateixa velocitat. Quan més important i essencial sigui aquella proteïna per l’espècie menys canvis acumula i més lentament evoluciona (tot ve donat pel fitness o viabilitat del sp). Això és degut a que si una proteïna essencial mutés molt ràpid l’organisme tindria problemes perquè deixaria de funcionar la via d’aquesta.
En el gràfic podem veure el nombre de canvis per cada 100 residus a mesura que passa el temps. El punt 0 es en el que es troben actualment.
Per ex: Veiem la histona H4 que té una mutació cada 600 milions d’anys (promig). Entre vertebrats i insectes com a promig es de 1 o 2 canvis per cada 100 aminoàcids, és a dir, són pràcticament iguals perquè és una proteïna que no admet evolucions. Aquesta proteïna està al nucleosoma i s’encarrega d’empaquetar el DNA.
Aquest empaquetament és una funció bàsica i, per tant, si tenim una mutació en que aquesta histona no funciona => organisme resultant no és viable. Això fa que la histona H4 acumula taxes de mutacions de forma molt lenta.
Ex2. En el cas del citocrom C, que també és una proteïna important, admet més canvis perquè hi ha zones no funcionals que poden acomodar-los i, per tant, acumulen més diferencies entre especies.
Ex3. La hemoglobina evoluciona ràpidament.
Ex4.Els fibrinopeptides (producte d’una proteòlisi limitada) divergeixen ràpidament entre els mamífers.
En resum, si volem veure l’evolució dels mamífers, per exemple, no podem agafar la histona h4 sinó una proteïna que tingui una tassa d’evolució molt rapida. Si volem veure les diferències entre tots els organismes hauríem d’agafar una proteïna de tassa de evolució moderada que ens permeti modelar i observar tot l’espectre.
o Que canvia mes seqüència o conformació? 7 Química i Enginyeria de les Proteïnes L’evolució en permet canviar la seqüència perquè la forma de la proteïna ens la determina la seva funció. Aquesta forma pot ser adoptada per diferents seqüències.
La conformació es conserva més que la longitud de seqüència ja que poden haver petites delecions i modificacions però n’acostumen a haver poques perquè sinó no hi ha el plegament correcte. Aquesta més que la seqüència d’aminoàcids i aquesta més que la posició del tercer codó. El tercer codó del codi genètic és pràcticament no codificant ja que, encara que canviïn els aminoàcids en molts casos codifica pel mateix codó, per tant, manca d’importància.
5. Estratègies per a la determinació de la seqüència de proteïnes Podem saber la seqüència d’una proteïna, en el cas de les humanes ja les sabem totes, però no la seva forma activa. Cal purificar-la. Tenim dos mètodes fonamentals: a) Seqüenciació d’Edman: És necessari d’un seqüenciador de proteïnes (elabora reaccions molt ràpid).
Fem servir N terminal que és reactiu per sobre del seu pKa (en un medi alcalí) així es desprotona. També fem servir un reactiu (PITC) que s’hi uneix i queda la proteïna marcada. També cal un àcid fort.
Procés: Unim la seqüència de la nostra proteïna per N terminal a PITC, es forma un compost molt estable i queda marcat (en un medi alcalí). Afegim un àcid fort que ataca la molècula (desestabilització) i es dóna una ciclació. Es torna a mesclar amb el polipèptid original sense el residu de N-terminal.
Amb el Benzil Chloride, només marca un residu, que el passem per cromatografia per veure quin és (anàlisi dels aminoàcids).
Podem veure color i com que és visualitzable passem a la columna i en funció del temps de dilució sabem de quin aminoàcid es tractava el N terminal inicial.
Quan ja sabem aquest pèptid tornem a començar amb el següent i així consecutivament.
RESUM: Polipèptid + PITC i medi alcalí, acidificació i columna El problema és que al repetir el cicle pot ser que no s’hagi tallat N ter (que hi ha un 10% de possibilitats de que passi). Si es va acumulant 10 % en cada cicle podem arribar a tenir un error molt gran. Si es tracta de diferents aminoàcids ‘’és igual” però si són iguals no surt bé.
8 Química i Enginyeria de les Proteïnes Com a molt podem seqüenciar amb aquesta tècnica uns 100 aminoàcids. Primer tallaríem la proteïna i desprès la ordenem. Caldrà tallar sempre de manera que es solapi per tal de poder seguir l’ordre.
Característiques d’Edman: - Tècnica més antiga - En les dues tècniques cal una petita quantitat de proteïna purificada. (si veiem la banda en una electroforesis la pots seqüenciar).
- El resultat de la seqüència serà pitjor o millor en funció de la purificació.
- Medi alcalí perquè N terminal sigui reactiu - Fem servir un reactiu que no és igual, però té la mateixa funció que el clorur de benzil. Aquest fa el mateix i es anomenat PITC. N-terminal ataca al carboni que esta enllaçat per dos enllaços dobles i això fa que el reactiu PITC quedi unit al n-terminal de la proteïna.
- La proteïna queda marcada.
- Amb el benzil chloride només marca un residu, aquest el passava per cromatografia per veure el que era.
- El què fa aquest complex és que es molt poc estable en medi àcid i es fa servir com un agent trifuoracetic (àcid molt fort) i en aquestes condicions el que es produeix es un atac de manera que el que s’allibera per una banda la seqüència de la proteïna amb un aminoàcid menys => es genera un nou extrem N-terminal i l’aminoàcid original que estava en posició N-terminal unit amb un compost determinat. Aquest compost te color i és visuablitzable i el què farem és, després de la reacció, passar-lo per una columna (com en els derivats de benzil) i en funció del temps de dilució sabem quin aminoàcid és.
- El residu en posició 2 (anteriorment) ara és el nou residu en N-terminal. Ara ho netegem tot i torno a elaborar la reacció: tornem a posar PITC => medi alcalí => acidifico => torno a tenir un nou aminoàcid i aquest serà la segona posició.
- D’aquesta manera vaig llegint quin aminoàcid està en posició N-terminal - En aquesta maquina (abans manualment) el que et dona son cromatogrames i el que tu has de llegir es quin es l’elució d’aquest aminoàcid.
- Eficiència del 90%.
Seqüenciació d’una proteïna: PONT DISULFUR: 1. El primer que volem saber és la seva composició (Hidròlisi total). Si posem el pèptid o proteïna a pH molt àcid com en àcid clorhídric a una elevada temperatura podem trencar l’enllaç peptídic => derivatitzar tots els aminoàcids i marcar-los i passar-los per una columna => quantifiquem quants 9 Química i Enginyeria de les Proteïnes aminoàcids tinc de cada tipus. Hi ha un estendard de pics, sabem on ha d’estar el pic de un molar.
Em de buscar segons el que trobem qui pot trencar els enllaços que ens interessen.
2. Busquem el primer aminoàcid: fem reaccionar la proteïna inicial amb FDNb que reacciona amb N terminal quan està desprotonat. Així doncs sabem quin és el primer aminoàcid.
3. Hidrolitzem i passem per la columna.
4. Com que no podem seqüenciar en només una vegada (cal que solapem els talls per poder determinar l’ordre) hem de fer servir enzims com la Tripsina o substàncies químiques com el Cianogen. Perquè puguin tallar, els enllaços que tallen han de ser accessibles, per tant, no podem tenir la proteïna plegada (condicions desnaturalitzants). Cal reduir també els ponts disulfur perquè si el tinguéssim i tallem la proteïna podria donar-nos com un únic pèptid i en realitat fossin dos i no necessàriament continus (No poden haver unions covalents).
5. Hem de tallar per llocs lo més diferents possibles. Normalment s’utilitza primer la tripsina (fem Edwan i després seqüenciació). Sempre hi ha n+1 talls (p. ex si tenim quatre pèptids hem fet 3 talls).
6. Desprès de tallar i Edwan sabem el primer pèptid i també sabem l’últim (C terminal) perquè no acaba en un residu tallable (tots els altres sí). Si el residu final fos el mateix que l’altre (per tant, pogués ser generat pel que em tallat) no podríem saber-ho.
7. Els pèptids restants no podem saber l’ordre, necessitem un segon reactiu que talli per un lloc diferent i així poder muntar la seqüencia com un puzle. Triem un reactiu que talli un aminoàcid.
Sabem quin es el N-terminal i el C-terminal, aquell que no acaba en l’aminoàcid que no hem tallat.
La seqüenciació dels pèptids es fa amb Edwan perquè són petits.
10 Química i Enginyeria de les Proteïnes b) Espectrometria de masses - Seqüenciació més nova - Agafem la proteïna i li introduïm càrrega.
- Quan ja està carregada la fem volar, accelerar en un camp magnètic per diferència de potencial.
Aquest permet seleccionar els ions (proteïna carregada) amb un relació de massa-càrrega.
- Ho fem passar per un detector que hem digués quants ions tenim de cada.
Aquesta tècnica també té altres finalitats a part de seqüenciar.
- Fem servir dues tècniques: 1. ESI ( Electrospray): - Permet treballar en solucions i hi podem tenir més d’una proteïna en solució.
- Apliquem la diferència de potencial (3000 volts) l’entrada té 8v. Això genera un espècie d’esprai on les proteïnes o la solució adquireixen dues propietats:  Perdent protons (carregats negativament)  Perdent H2O - El que entra al tub de 8 v són proteïnes amb càrregues positives addicionals.
- En aquest tub el temps que trigui en travessar-lo, i això són mil·lisegon, dependrà de la seva massa i càrrega.
11 Química i Enginyeria de les Proteïnes - Imaginem que només tenim una proteïna. Aquesta vola plegada sempre i aquesta proteïna aquí té +30, +40, +50 (la que té més càrrega i amb la mateixa massa vola més ràpid).
- Esquema del dinosaure: que totes les molècules provenien de la mateixa proteïna i ens permetrà calcular la massa molecular d’una proteïna de forma molt exacta.
2. MALDI-TOF Matrix-assisted laser-desorption ionisation – Time of flight - S’assembla molt a l’anterior però diferència en la manera de carregar la proteïna.
- Es tracta d’una matriu (petita com la punta d’un llapis) on dipositem la proteïna, que és un compost químic que és capaç de donar protons a les molècules adjacents.
- S’irradia amb un làser la proteïna (que està dins la matriu). Això permet la transferència de protons de la matriu a la proteïna. En aquesta tècnica sempre hi ha menys càrregues que en la tècnica anterior. Igualment, com més càrrega més ràpid volarà, ja que tindrà la mateixa massa.
12 Química i Enginyeria de les Proteïnes ESI/MS: Obtindrem diferents pics que correspondran a la mateixa proteïna. Normalment si veiem molts pics en un ESI ( tècnica anterior) tenim moltes relacions massa-càrrega. Per saber la massa molecular d’aquesta proteïna fem servir l’equació següent: M/z i n : ho hem de buscar MW: massa de la proteïna nH+: protons adquirits En aquesta equació relació massa/carrega i n hem de treure-les de dues equacions diferents comparant-les. Agafarem aproximadament unes 12 equacions (si tinguéssim aproximadament 8 incògnites) seria bastant exacte.
La màquina ens dóna aquest promig. Per tant, amb aquesta tècnica podem veure proteïnes de fins a 900 kDa (sense purificar). Té una resolució de 40 ppm, aleshores si la proteïna té un milió de Da ens equivoquem en 40, si en té 200 Da ens equivoquem en 0,4 entre el pes molecular que ens dóna per masses i el pes molecular real. Això és molt important pel redisseny de proteïnes.
La sensibilitat d’aquesta tècnica és d’àtom-mol (necessitem molt poca proteïna). Permet distingir, per exemple, entre una hexocinasa normal d’una hexocinasa que ha canviat 4 protons per deuteris (que hi ha una diferència de 4 Da).
13 Química i Enginyeria de les Proteïnes MS/MS: Fem servir dos aparells en cadena de masses.
- Hem de fragmentar la proteïna en pèptids.
- Només necessitem un reactiu (per exemple tripsina). Amb ella generem pèptids i analitzem el pes molecular de cadascun.
- Els mateixos pèptids els enviem a una càmera de col·lisió que conté un gas noble i en les condicions en que envio el pèptid col·lisiona amb el gas i es trenca, en el cas més útil, per l’enllaç peptídic.
Si ajustem l’energia podem fer que es trenqui per només un enllaç peptídic (generem fragments que difereixen en un únic aminoàcid). No genero tots els aminoàcids individualment sinó fragments que es solapen.
Obtenim molts pics, cada pic es diferencia per l’aminoàcid que no hi és. La diferència entre dos és per exemple d’una alanina (com que és petita, la distància també) de manera que veient els pics corresponents podem saber l’aminoàcid que falta.
- La seqüencia es llegeix tal qual. Això no són molts cicles de reacció sinó que ja es pot llegir de forma immediata.
- Cal tenir en compte una cosa: els aminoàcids fan al voltant de 110 Da. Si ens equivoquem amb la identificació tenim un error del 0,004. Hi ha una sensibilitat d’àtom-mol. Podem seqüenciar qualsevol cosa tot i que no la veiem.
14 Química i Enginyeria de les Proteïnes 03/10/13 5. Estratègies per a la determinació de la seqüència de proteïnes Seqüenciació MS-MS Tenim dues masses d’una proteïna que volem seqüenciar completament (no un pèptid i després l’altre, sinó que completament). El què fem és agafem la proteïna (només en cal molt poca quantitat) i la digerim amb tripsina (la tripsina és de molt bona qualitat per fer la seqüenciació massa).
Un dels principals problemes que jo tinc quan vull treballar amb el MS i vull fer digestions és en quant a la informació de les mostres perquè molt sovint, encara que la meva proteïna estigui pura, està contaminada d’una altra proteïna molt abundant que nosaltres tenim, de manera que quan jo digereixo amb tripsina no només obtinc els pèptids de la meva proteïna, sinó d’una altra proteïna. Aquesta proteïna problema és la queratina de la pell que, encara que treballem en ambients molt controlats, aquesta tècnica és tan sensible que les cèl·lules mortes que no veiem i tenen queratina de vegades les veiem en el MS. La majoria de màquines tenen un programa que suprimeix la senyal de queratina. És difícil que acabi la queratina en el tub, però passa.
Agafem, digerim i ho tirem al primer massa.
El primer massa em dóna dos pèptids d’un pes molecular concret i el què fem és calibrar aquest aparell perquè aquest pes molecular el faci passar a un altre màquina, que és el següent espectròmetre de masses. Però abans de passar a aquí, es troba amb un gas, hi ha una col·lisió i controlem l’energia de la col·lisió perquè els trencaments es produeixin, sempre que sigui possible en l’enllaç peptídic (es poden produir trencaments per altres llocs, però volem que la majoria d’enllaços que es trenquin siguin els peptídics). D’aquesta manera et queden fragments de “x” aminoàcids. Això genera dos tipus de ions, un ió de tipus “y” i un ió de tipus “b”. El ió “y” és el que quedaria a l’extrem C-terminal, i el “b” el que quedaria al N-terminal.
15 Química i Enginyeria de les Proteïnes Normalment sempre calibrem les màquines per veure només els ions de tipus “y”, perquè si veiéssim els dos seria un “caos”. Aquests ions volen molt bé i es veuen molt bé. Una vegada hem fragmentat (recordem que la fragmentació té lloc a l’atzar) no em donen fragments petits, sinó que jo calibro la força de col·lisió perquè es trenqui com a màxim un enllaç peptídic. Per tant, tinc fragments d’aquest tipus: Cadascun d’aquest fragment li falta un aminoàcid, és a dir, la diferència entre un i l’altre és d’un aminoàcid. Com que jo sé el pes molecular dels aminoàcids, l’únic que cal fer és llegir la seqüència. Així doncs, observem que al primer pèptid li falta un aminoàcid en la posició Nterminal (perquè hem agafat els ions “y”), en el segon ni falta un respecte el primer, al tercer un respecte al segon, etc. Això em permet llegir directament la seqüència amb molta sensibilitat i precisió i ho puc fer per cadascun dels pèptids: Seqüencia identificació amb MS Normalment no cal un masses-masses i fer tot aquest procés. El MS-MS cal quan estic dissenyant proteïnes noves o estic trobant proteïnes que no s’han trobat encara, fet que passa molt poc. El què es fa habitualment és analitzar proteïnes de teixits coneguts i la determinació de quina proteïna és es fa mitjançant el mass-fingerprint (petjada de masses).
El mass-fingerprint té com a objectiu identificar les proteïnes prèviament separades per electroforesis amb un gel bidimensional. Per separar les proteïnes, doncs, cal un gel de SDS, d’on surten una sèrie de bandes que et diuen el pes molecular. En un gel SDS les proteïnes corren amb el logaritme del seu pes molecular, és a dir, la distància recorreguda depèn del logaritme del seu pes molecular. En aquest cas, tinc un gel que és bidimensional i que el què fa és separar les proteïnes en dues dimensions, em permet separar pel punt isoelèctric i per pes 16 Química i Enginyeria de les Proteïnes molecular. En la primera dimensió les proteïnes correran segons el seu punt isoelèctric, de manera que les electroenfoquem. Correran per un gradient de pH fins que arribin en un punt on el seu pH sigui el seu punt isoelèctric i no es mouran (les enfoquem en el seu punt isoelèctric).
Corren en el seu estat natiu i, per tant, la primera dimensió és nativa. A sota hi ha un gel de SDS normal que fa baixar la proteïna segons el pes molecular (segona dimensió). Per tant, totes les proteïnes que es troben en la mateixa línia horitzontalment tindran el mateix pes molecular, mentre que les que es troben en la mateixa línia verticalment tindran el mateix punt isoelèctric: D’aquesta manera, serà molt casual que dues proteïnes tinguin el mateix punt isoelèctric i pes molecular. Aquest gel bidimensional em permet augmentar molt la resolució. Això té molt d’ús en biomèdiques, ja que una forma fàcil de detectar certes malalties és agafar sèrum i buscar marcadors. Tinc un sèrum d’un pacient normal, sé quines bandes hi ha, i detecto si en el pacient hi desapareix o apareix una banda. Ara hi ha bases de dades estandarditzades i el que has de fer és enfrontar el teu gel amb la base de dades.
Un cop has separat les proteïnes cal identificar-les. El mètode és el següent: 1) Digerir la proteïna en fragments amb un enzim (com per exemple la tripsina) 2) Ionitzar els fragments proteics (sense trencar-los): MALDI o ESI 3) Accelerar a través d’un espectròmetre de masses 4) Produir el “peptide mass-fingerprint” 17 Química i Enginyeria de les Proteïnes Expliquem-ho pas per pas. El què faig és tallo un tros de SDS (de la proteïna que m’interessa), el col·loco en un tub, faig una digestió amb tripsina i genero una sèrie de pèptids. Aquests pèptids els llenço en un masses i em donaran dos-tres pèptids amb una mida definida (només cal un masses). Els pèptids tenen una massa definida que depèn de quantes arginines i lisines tinguin (és on talla la tripsina) i a on estiguin col·locades. Aquest patró és pràcticament únic.
Per tant, el què fa la màquina és treballant online (per accedir a la base de dades de qualsevol lloc del món) em dóna un patró i això ho compara amb una base de dades que no conté dades reals, sinó que el què conté (li he de dir si la proteïna és humana, de ratolí...) són els genomes seqüenciats de tots els organismes i les proteïnes que es poden generar del genoma i quins fragments donarien si jo tallés amb tripsina. Això és teòric i ho comparo amb el cas real. Si el patró correspon amb molt alta probabilitat (digestió bona) em dirà quina proteïna és. Amb aquest mètode no cal seqüenciar perquè la seqüència està dipositada en la base de dades.
Això em serveix per saber quines proteïnes es troben dins la cèl·lula formant un complex macromolecular. Això és molt difícil de fer per altres tècniques. Com ho fem? Imaginem que tinc una proteïna i vull saber amb qui interactua dins la cèl·lula. El què faig és inventar-me una forma de purificar només la meva proteïna. Tinc una columna que em permet purificar la meva proteïna i tot el què estigui unida a ella dins de la cèl·lula. Purifico la meva proteïna, ho elueixo i faig un gel de SDS normal (pot ser monodimensional o bidimensional segons la grandària del complex). En aquest cas em dóna la banda que conec i tres bandes més desconegudes. Tallo les bandes desconegudes i faig un mass-fingerprint, envio i em surten les identificacions, el codi de la proteïna i sé, amb un experiment que pot durar un dia, quin és el complex molecular. D’aquesta manera puc saber amb què interacciona quan la cèl·lula està bé i quan la cèl·lula està morint-se, per exemple.
18 Química i Enginyeria de les Proteïnes 6. Síntesi química de pèptids; llibreries combinatorials Si tenim aminoàcids, que són molt barats, per sintetitzar pèptids només cal formar un enllaç peptídic. La síntesi de pèptids no la practicarem perquè normalment es compren. Així doncs, passarem aquest tema per sobre mirant només la síntesi de pèptids en enzims.
Els pèptids són molt cars, però tenen moltes avantatges, com el fet de què si compro un pèptid no l’haig d’identificar ni sintetitzar. Malgrat ser molt cars, és molt més car i trigues molt més fent la síntesi manual, ja que no només volem els pèptids, sinó que volem que estiguin sintetitzats purificats amb un 95% de puresa i que estiguin analitzats per massa (pes molecular...).
La síntesi de pèptids es fa sobre una reïna (és una bola, que nosaltres no veiem, formada per moltes boles petites, que és un suport sòlid, que normalment és una bola de poliestirè). El què haig de fer és enganxar el meu aminoàcid individual (molt barats) en aquesta bola i necessito sempre que l’aminoàcid que jo entri tingui l’extrem N-terminal bloquejat. Ha d’estar bloquejat amb un compost, poden ser diferents compostos. L’extrem -amino és molt reactiu i he de fer que no sigui reactiu perquè si poso tots els aminoàcids junts seria un “caos” i només vull que reaccionin per un lloc. Al bloquejar l’extrem N-terminal només poden reaccionar pel carboxil.
Això s’uneix a l’alanina i ja tinc el primer aminoàcid enganxat a la bola. Ara vull col·locar el segon, cal que el segon estigui bloquejat, tenir desbloquejat el N-terminal i això ja està llest per a reaccionar. La reacció amb el carboxil és molt poc activa (així com un amino és molt actiu, el carboxil no) i el què faig és que l’aminoàcid que entrarà ara l’activo, el seu carboxil el faig reaccionar amb una molècula que me l’activa (DCC) i després el què faig és el col·loco, ja activat, a l’aminoàcid que tenia i es forma l’enllaç peptídic. Aquest nou aminoàcid (el segon) està bloquejat al N-terminal, desbloquejo, activo el tercer aminoàcid i el faig reaccionar i anar fent pel quart, el cinquè...
19 Química i Enginyeria de les Proteïnes La síntesi que jo faig va en direcció de C-terminal a N-terminal. Per tant, la síntesi química de pèptids funciona en sentit invers que la síntesi proteica. Quin problema té, perquè són cares? Perquè les reaccions d’acoblament de nou no són totalment eficients i és possible que quan jo tingui aquesta molècula, a aquí no se m’hi hagi unit res, però quan entri amb el tercer aminoàcid si que s’adhereixi, de manera que tingui una pèptid en aquesta proteïna que passi de l’aminoàcid 1 al 3 sense tenir el 2 unit i que, per tant, ja no em serveixi de res. Això implica que l’haig d’anar purificant i comprovant per masses que és el pèptid que vull.
Examen: pot preguntar en quin sentit va la síntesi proteica o la química, si s’ha d’activar o no activar un grup i si s’ha de protegir un grup o no i quin grup s’activa i quin es protegeix. Activo tots els aminoàcids menys el primer, ja que el primer l’activo amb la reïna que ja està activada.
Llibreries combinatorials: síntesi per repartició i barreja Perquè ens serveix fer pèptids? Ens serveix per fer llibreries combinatorials. Em permet generar pèptids que continguin totes les combinacions possibles d’aminoàcids.
A aquí poso tres aminoàcids A, B, C, això normalment ho faria amb 20 o amb els què jo pensi que han d’estar en la meva seqüència, 15, 12, 6... En general el què fem és una primera reacció en un tub on acoblo a la reïna l’aminoàcid A (per exemple alanina) i tinc un altre tub on acoblo l’aminoàcid B i en un altre tub l’aminoàcid C. Tinc un tub on tinc la bola més cadascun dels aminoàcids, però separats. A continuació els barrejo tots i tindré, si estic treballant amb els vint aminoàcids, una barreja de boles amb vint aminoàcids. Ara els torno a separar i, per tant, en cada tub hi tindré de nou els vint aminoàcids i torna a passar el mateix, en un tub poso el A, el B, el C i tindré totes les combinacions de dos aminoàcids possibles. Torno a barrejar i tornaré a tenir totes les combinacions de tres aminoàcids possibles, etc. Això és un procés en què el nombre de pèptids augmenta de forma exponencial.
20 Química i Enginyeria de les Proteïnes Si faig servir dipèptids (sempre veuré quin és el N i C terminal) tinc 400 dipèptids d’aminoàcids diferents (20x20). Si en tinc 3 estic en 8000. Si vull un pèptid molt curt, de 8, ja estic en 25600 milions de combinacions possibles.
Perquè vull una llibreria amb totes aquestes combinacions? Imagineu-vos que sabeu que hi ha un pèptid en una proteïna implicada en càncer que pot tenir un inhibidor de caràcter negatiu. El què puc fer és estudiar-la amb molt de detall per saber quin és el seu centre actiu i què s’acumularia a allà, o puc fer la tècnica combinatorial, és a dir, immobilitzar la meva proteïna en una reïna i passar la llibreria completa. Després la netejo i allò que se m’ha unit a la proteïna, allò és un pèptid inhibidor. Podria ser una quinasa que regula el cicle cel·lular.
Llibreria combinatorial amb microxips Això té un problema, que és que hi ha una gran quantitat de pèptids, i per tant, el meu pèptid és una porció molt petita de la llibreria i si és molt petita he de tenir molta afinitat perquè si la unió és feble no la recuperaré. Per això s’han inventat aquest sistema, que és sintetitzar les llibreries amb microxips. Els xips són molt petits, si agafem un “cubre” serien una part molt petita d’aquest. Aquests microxips ens els venen, et venen un xip i en cada xip hi ha uns pèptids.
El què fa és que tenen un substrat en el qual immobilitzen un grup NH protegit, però molt bàsic?. Tot el xip està cobert amb això. El xip té coordenades, de manera que jo sé a on és cadascú. Al principi tot són iguals, però ara el què puc fer és activar selectivament algun d’aquests grups NH perquè sigui reactiu. Ho faig il·luminant selectivament aquest punt amb 21 Química i Enginyeria de les Proteïnes llum UV. Quan il·lumino amb llum UV el protector del NH marxa i el què puc fer és introduir a la solució l’aminoàcid que jo vull. Si jo ara el què faig és introduir Val, aquesta quedarà unida en els llocs que jo he activat. Després n’activo uns altres i puc fer-hi entrar Gly. El grup que jo entro està activat per un costat i protegit per l’altre. El lloc que primerament he il·luminat, on hi ha la primera Val, si després no el torno a il·luminar no està activat i no s’hi podrà unir Gly.
D’aquesta manera aconsegueixo que sé en cadascun dels punts quina és la seqüència. Tinc pèptids i puc saber en cada coordenada quina és la seva seqüència, no com abans.
Seguint amb l’exemple anterior, si agafo la meva quinasa, la marco amb un fluoroform (no és tan energètic (440nm) com la llum UV, que és molt energètica), la passo per un lloc, s’enganxarà a un pèptid que ara està concentrat, i quedarà unida en aquest pèptid, posició 5a (per exemple).
En resum, si tu, per exemple, vols trobar quin pèptid inhibeix una quinasa, passes la quinasa amb un fluoroform i s’enganxarà en alguns punts. Vas al microscopi i observes que és fluorescent en uns punts, normalment s’uneix a dos o tres o quatre pèptids. Mires la seqüència que és i saps el pèptid que s’uneix a la quinasa.
22 ...