Tema 1 (2014)

Apunte Español
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Bioquímica - 2º curso
Asignatura Química i Enginyeria de proteïnes
Año del apunte 2014
Páginas 16
Fecha de subida 14/10/2014
Descargas 39
Subido por

Vista previa del texto

Judith González Gallego Química i enginyeria de proteïnes T1 PROPIETATS FONAMENTALS DEL AMINOÀCIDS I DE LES POTEÏNES PROTEÏNES I PÈPTIDS Funcions als éssers vius Les proteïnes són els cavalls que fan que la maquinària molecular funcioni ja que elaboren la seva funció a tots els nivells, inclús quan parlem de factors de traducció i transcripció. Les proteïnes poden funcionar com:  Paper estructural, de suport o moviment: un exemple clar és el col·lagen, l’actina i la miosina, que s’encarreguen de mantenir estructures o bé permeten el seu moviment.
 Catalitzadors o enzims: baixen l’energia de l’estat de transició permetent que es generi el mateix producte en una quantitat de temps inferior de manera que la reacció química és més ràpida i compatible amb els temps de vida dels éssers vius.
 Transport: aquesta funció és molt important sobretot en organismes pluricel·lulars ja que han d’importar molècules d’un lloc a un altre. Un exemple és l’hemoglobina.
 Regulació metabòlica: hi ha proteïnes denominades querofactors i que es troben a dalt de les cadenes metabòliques de manera que dirigeixen el funcionament de la cadena de síntesis o degradació. Normalment són proteïnes que poden patir una modificació postraduccional, com la fosforilació, i sota d’aquestes proteïnes de control hi ha una sèrie d’enzims que elaboren la reacció sempre que tinguin la proteïna reguladora.
 Protecció i reconeixement: aquesta és una funció molt important en organismes superiors i són un exemple els anticossos i les immunoglobulines.
Estudi de les proteïnes Com s’han anat estudiant les proteïnes al llarg del temps és un aspecte que ha anat canviant: antigament s’estudiava la proteïna individualment amb un purificació determinada i caracterització individual. Actualment es prefereix un estudi més col·lectiu ja que es sap que aquestes rarament funcionen soles, és a dir, que depenen d’una interacció o bé directe o indirecte d’altres proteïnes de manera que s’estudia la proteïna en aquest context (sense estudiar res d’una proteïna i estudiant les seves interaccions es poden obtenir moltes conclusions). Cal tenir present que les dues formes coexisteixen.
Actualment l’estudi de proteïnes està més aïllat per l’aparició de genomes (codifiquen per un conjunt de proteïnes), tant col·lectius com individuals. Els estructural genomics van aparèixer fa 6 anys i la funció d’aquest projecte era resoldre estructuralment totes les proteïnes d’un genoma, és a dir, saber totes les proteïnes (el màxim possible). Hi ha dues aproximacions, d’instituts europeus i americans que han estudiat aquesta estructura amb cristal·lografia i sincrotró mentre que el Japó ha elaborat aquests estudis amb ressonància magnètica.
Aquest fet ha portat a un camp posterior anomenat proteòmica, que busca estudiar el conjunt de proteïnes no de forma genèrica sinó en un conjunt, és a dir, totes aquelles que s’expressen durant l’estat embrionari o durant el càncer.
1 Judith González Gallego Química i enginyeria de proteïnes T1 Estructura de les proteïnes A nivell atòmic, per sota de 5 Å, podem veure les proteïnes i en alguns casos podem veure fins i tot els seus ponts d’hidrogen el que ens permet saber com és físicament la proteïna. En 2004 hi havia resoltes o estudiades 24.783 proteïnes, en 2006 la xifra va pujar a 35.623 i per últim en 2009 hi havia 55.791. Conèixer les estructures de les proteïnes ens permet conèixer:  Mecanismes que hi ha darrera de la seva funció (perquè una quinasa fosforila)  Seguir el que anomenem l’evolució molecular, és a dir, com s’assemblen dues proteïnes (com el citocrom C d’un animal i d’un humà)  Predir estructures tridimensionals homòlogues. Aquest aspecte és molt important perquè sabent l’estructura tridimensional d’una proteïna i tenint una altra que s’assembli en seqüència podem assumir que també s’assemblarà en estructura, de manera que podem intentar modelar la proteïna de la qual no coneixem l’estructura a sobre de la que coneixem l’estructura el que ens permetrà arribar a l’estructura amb un pressupost més reduït.
 Problemes de plegat ja que si la proteïna no es plega correctament dona lloc a una malaltia per dos aspectes: o Quan no es plega no adquireix la seva funció de manera que la cèl·lula presenta un problema.
o Quan la proteïna perd la funció i no plega té tendència a autoensamblar-se formant agregats (causa del Alzehimer).
 Modificació i enginyeria. Quanta més informació tenim d’una proteïna millor serà el seu model i la seva proteïna que es generarà al laboratori; es pot intentar buscar proteïnes que visquin en un medi hidrofòbic i orgànic per eliminar les contaminacions de petroli o bé per generar drogues que inhibeixin una determinada activitat.
Actualment tenim 62.645 proteïnes resoltes i els mètodes majoritaris de resolució son els rajos X i la ressonància magnètica nuclear tot i que el primer guanya ja que és un mètode més fàcil. El Protein Data Bank és una base de dades de proteïnes en que estant totes les proteïnes resoltes amb un finançament públic.
En el següent gràfic podem observar en vermell que les estructures resoltes estan augmentant de forma exponencial i en blau el nombre de proteïnes noves resoltes cada any, que tal i com es pot observar es troba estancat tot i el seu creixement ràpid. Aquest fet és així ja que actualment es resolen moltíssimes proteïnes amb homòlegs per comparació que no pas amb un estudi individualment ja que buscar estructures totalment noves és més complicat i presenta un cost més elevat.
2 Judith González Gallego Química i enginyeria de proteïnes T1 Nomenclatura de la proteïna El llenguatge que explicarem a continuació és una convenció que seguirem. Anomenem proteïna a una seqüència d’aminoàcids que es plega a l’espai amb una estructura definida y bàsicament única tot i que també la podem definir a partir del nombre de residus en que podríem dir que és una seqüència d’aminoàcids que té més de 100 residus d’aquests. Quan el nombre de residus és inferior a 100 parlem de pèptid i normalment no té una estructura tant definida (no solen tenir gaire estructura). El polipèptid serà doncs, un sinònim de proteïna. L’oligopèptid és un pèptid molt petit, amb menys de 10 residus i el pentapèptid en té menys de 5.
Hem de tenir clar que parlem de residus i no d’aminoàcids ja que aquests estan enllaçats amb un enllaç peptídic de manera que cada residu és cadascun dels aminoàcids que s’incorpora a la cadena per mitjà d’un enllaç amb la pèrdua conseqüent d’aigua.
AMINOÀCIDS: ESTRUCTURA I PROPIETATS Els elements que formen les proteïnes són els aminoàcids dels que hi ha 20 proteogènics que són α-aminoàcids amb una configuració a l’espai L. Els 20 aminoàcids estàndard es diferencien per la seva cadena lateral el que fa que cada aminoàcid tingui unes propietats molt específiques que són suficients i necessàries per donar estructures i diferents que conformaran les proteïnes.
L’aminoàcid més petit és la glicina ja que no presenta cadena lateral (té un hidrogen) mentre que el més gran és el triptòfan.
La grandària de les molècules determina moltes coses com per exemple la substitució d’aquests en cadenes ja que es necessita un determinat espai per acoblar un determinat residu. De tots els altres aminoàcids tenim amb cadenes carregades, no carregades i polars.
Estereoquímica dels α – aminoàcids Els aminoàcids presenten la configuració L o D en funció de com estan enllaçats a l’espai amb el grup quiral. Recordem que per tenir un grup quiral necessitem 4 substituents diferents. Totes les proteïnes, a excepció de molt poques, estan formades per aminoàcids en configuració L tot i que també podrien existir proteïnes amb configuració D que serien imatges especulars de les que coneixem avui en dia. Cal tenir present que aquestes proteïnes hipotètiques serien totalment funcionals i que el fet de tenir proteïnes L és per evolució ja que les primeres van ser amb aquesta conformació i els ribosomes es van acomodar a elles, de manera que és una impremta històrica.
És molt important tenir clar que els sistemes biològics només poden degradar proteïnes compostes per L aminoàcids ja que les altres proteïnes no són reconegudes.
3 Judith González Gallego Química i enginyeria de proteïnes T1 Estructura i propietats dels aminoàcids Tots els aminoàcids tenen un grup α-amino i α-carboxil, grups ionitzables, és a dir, que poden guanyar o perdre electrons. El Pka del grup carboxil està al voltant de 2-2,5 tot i que depèn del aminoàcid, el que ens diu que sobre un pH=2,5 es troba desprotonat i per tant a pH fisiològic estarà carregat. El Pka del grup amino es troba al voltant de 9,5 de manera que a pH fisiològic estarà protonat i amb càrrega ja que en aquest cas estar desprotonat correspon a perdre una càrrega.
Classificació i propietats dels diferents aminoàcids en funció de la polaritat Els aminoàcids es poden classificar en diferents grups i aquest és un aspecte molt important des el punt de vista estructural i funcional.
Aminoàcids no polars Són aminoàcids als que no els hi agrada l’aigua ja que no poden formar ponts d’hidrogen amb la seva estructura. El grup està composat per: Glicina, Alanina, Valina, Leucina, Meteonina i isoleucina.
 Glicina: Té un hidrogen a la cadena lateral el que provoca que sigui l’únic aminoàcid no quiral (propietat química). Com que no té cadena lateral allà on està no hi ha una restricció de grups, de manera que permet una gran flexibilitat de les cadenes. Les zones riques en glicina seran sovint zones flexibles, amb loops...
 Alanina: Té un grup metilè en la cadena lateral i no pot formar ponts d’hidrogen de manera que sovint es troba al interior de les proteïnes, formant el nucli.
 Valina: Té dos metils a la cadena lateral.
 Leucina i isoleucina: Es com la valina però amb un metil més. Ambdós aminoàcids tenen la mateixa formula química però difereixen en la conformació.
 Meteonina: És l’únic aminoàcid, conjuntament amb la cisteïna, que té un sofre incorporat a la seva cadena. En aquest cas aquest sofre es troba al interior de la cadena i no es reactiu.
En general sempre es satisfà que com més grups tenen a la cadena lateral més hidrofòbics són de manera que la leucina i la isoleucina són els més hidrofòbics.
4 Judith González Gallego Química i enginyeria de proteïnes T1 Aminoàcids no carregats Les seves cadenes laterals poden interaccionar amb l’aigua favorablement perquè poden formar ponts d’hidrogen. Aquests els trobem normalment cobrint la superfície de les proteïnes. El grup està format per: Serina, Treonina, Cisteïna, Prolina, Asparagina i Glutamina.
 Serina: S’assembla a la Alanina en la qual un hidrogen ha estat canviat per un hidroxil, un grup hidròfil o polar.
 Treonina.
 Cisteïna: Té un grup de sofre i és extremament reactiva, sent la responsable de la formació d’un dels pocs enllaços covalents entre les proteïnes, el pont disulfur (oxidació i unió de dues cisteïnes).
 Prolina: Diem que és un α-aminoàcid tot i que en realitat no ho és, és un iminoàcid ja que té un grup imino i no amino. La seva cadena lateral està ciclada formant aquest grup imino. La proteïna està classificada com polar no carregada tot i que molt freqüentment és hidrofòbica i està dins les proteïnes (caràcter polar discutible). Des del punt de vista estructural la prolina és l’antítesi de la glicina ja que per causa de la cadena lateral ciclada és un residu molt rígid, que no proporciona mobilitat a l’estructura.
 Asparagina i Glutamina: Són formes no carregades d’uns altres aminoàcids. Els dos grups són molt polars.
Aminoàcids amb grups aromàtics Aquests són aminoàcids que presenten propietats exclusives gracies al seu anell. El grup està composat per: Fenilalanina, Tirosina i triptòfan.
 Fenilalanina: És extremadament hidrofòbica (residu que ho és més). Sempre es troba al interior de la proteïna.
 Tirosina: És més polar que l’anterior gràcies al seu grup hidroxil tot i que també presenta hidrofobicitat pel grup fenil. A diferència de l’anterior aquesta es pot trobar en ocasions a l’exterior de les proteïnes.
 Triptòfan: La seva principal característica és que és un aminoàcid molt gran i no es pot introduir en qualsevol cadena. Té un caràcter polar donat per l’hidrogen del nitrogen (pot interaccionar amb l’aigua) i apolar per l’anell. La gran majoria de vegades es troba a l’interior de les proteïnes tot i que en ocasions la podem trobar fora. És un aminoàcid poc abundant de manera que si el trobem és perquè és totalment necessari: dins la proteïna actua com un empaquetador (empaquetant altres residus) o a l’exterior permet la interacció amb d’altres molècules o proteïnes.
5 Judith González Gallego Química i enginyeria de proteïnes T1 Aminoàcids carregats positivament Aquest grup el composen: Lisina, Arginina i Histidina.
 Lisina i Arginina: A pH neutre estan quasi sempre carregats i es troben fora de la proteïna ja que introduir—los al interior té un consum d’energia molt gran. Tenen una propietat que d’altres aminoàcids polars no tenen: poden formar ponts salins amb grups carregats negativament (són enllaços més forts que els d’hidrogen, sobretot si la distància és curta) de manera que poden formar interaccions més fortes i dirigides.
 Lisina: És més hidrofòbica que l’Arginina. És un aminoàcid lineal i el més prim que existeix el que li permet tenir una gran flexibilitat. Molt important quan és necessari interaccions amb residus de caràcter iònic perquè pot deixar d’interaccionar amb residus negatius de la proteïna i passar a interaccionar amb d’altres.
 Arginina: Té un grup dentant que pot formar pont d’hidrogen amb d’altres molècules.
 Histidina: És un aminoàcid ciclat amb un grup imidazol. És l’únic aminoàcid que pot estar protonat i desprotonat a pH fisiològic en funció del seu entorn elèctric de manera que pot acceptar o donar electrons el que és molt important per catalitzar reaccions químiques (es troba freqüentment al centre actiu dels enzims) Aminoàcids carregats negativament Són aminoàcids amb un grup carboxílic addicional (anomenat α-carboxílic). Tots els carbonis γ són equivalents a l’espai, tenen les mateixes propietats però no ho són els α i β. El grup està format per: Aspartat i Glutamat.
Aminoàcids disposats a l’espai Els aminoàcids tenen les següents estructures: 6 Judith González Gallego Química i enginyeria de proteïnes T1 Aminoàcids modificats Els 20 aminoàcids naturals sí que els trobem a les proteïnes però també trobem altres aminoàcids com els aminoàcids modificats que provenen de la modificació dels 20 estudiats anteriorment per mitjà d’un procés enzimàticament molt complicat i energèticament costós de manera que si en una proteïna trobem un aminoàcid modificat és perquè aquest és molt important per la seva funció o estructura. Alguns exemples són:  Hidroxiprolina: Té un grup hidroxil que li proporciona polaritat de manera que dona lloc a una estructura rígida i polar.
 Trimetillisina: l’extrem té tres metils i per tant és altament hidrofòbic; tenim un residu molt llarg que no pot ser polar i no pot formar enllaços salins.
 Metilhistidina: amb el metil bloquegem l’activitat reactiva de la histidina, aquell hidrogen que es podia unir a d’altres compostos és substituït per un metil.
 Fosfoserina: els aminoàcids que es poden fosforil·lar són la serina i treonina perquè tenen un grup hidroxil tot i que també es pot fosforil·lar la treosina. La fosforilació, al contrari que les modificacions anteriors és una modificació reversible a les proteïnes és a dir, l’enzim que fosforil·la la serina, treonina o tirosina és una quinasa i es poden desfosforil·lar gràcies a una fosfatasa de manera que tenim un conjunt d’enzims que permeten addicionar o eliminar grups fosfat i aquest aspecte és molt important perquè permet activar o desactivar proteïnes.
 γ – carboxiglutamat: té un grup carboxílic addicional i això és molt important perquè te més càrrega de manera que l’estructura té dues càrregues negatives amb forma d’endoll el que permet coordinar cations divalents, permet a les proteïnes segrestar calci de forma específica.
Cal tenir present que no només existeixen 20 aminoàcids i les seves modificacions sinó que existeixen més de 700 aminoàcids implicats en els processos de generació de proteïnes i d’altes processos com la Gaba (hormona o neurotransmissor), cirtulina, ontina (intermediaris de productes nitrogenats) entre d’altres.
7 Judith González Gallego Química i enginyeria de proteïnes T1 D – aminoàcids a la natura Els D - aminoàcids existeixen a la natura de forma molt ocasional i cal destacar la valinomicina i gramicidina A.
Valinomicina És un antibiòtic que té un D – aminoàcids i altes derivats amb la forma D això fa que aquest antibiòtic sigui molt actiu per les espècies bacterianes ja que no el poden degradar, no poden trancar l’enllaç peptídic format entre dos D – aminoàcids ja que no tenen mecanismes de reconeixement.
Gramicidina A Aquest també es un antibiòtic però alterna una estructura d’aminoàcids amb forma D – L – D – L .... el que li permet aconseguir una estructura terciària (per aconseguir-la calen interaccions molt concretes) ja que amb les alternacions es genera una hèlix. A més, té residus molt hidrofòbics que mai no els trobaríem fora de la proteïna en condicions normals. Aquest antibiòtic elabora uns porus en els bacteris i s’insereix en ells, destruint la seva membrana cel·lular, al seu interior és hidrofílica el que genera una entrada d’aigua que acaba causant la mort dels bacteris.
Mesura de la hidrofilitat i hidrofobicitat Hi ha diferents escales i les més fàcils i senzilles són aquelles en que agafem l’aminoàcid, el posem en un solvent aquós i el transferim a un solvent orgànic per mirar la quantitat d’energia que necessitem per la transferència del solvent aquós al orgànic (també es pot elaborar al inrevés). Un exemple es canviar els residus des de aigua cap a octanol, aquells que es troben còmodes tenen un signe positiu com la isoleucina que es troba millor en un solvent orgànic que en l’aigua ja que en general els compostos hidrofòbics en aigua presenten problemes perquè obliguen a aquesta a formar una capa de solvatació el que genera un ordre de l’agua i per tant que el sistema perdi entropia.
Un residu apolar serà també apolar en la proteïna en funció del seu caràcter, de la superfície accessible a solvent de manera que en general trobarem els residus apolars amagats i els polars exposats a la superfície.
8 Judith González Gallego Química i enginyeria de proteïnes T1 Grups ionitzables en aminoàcids Tenim dos grups ionitzables i per tant tenim 2 formes possibles per cada grup el que genera un total de 4 formes possibles tot i que en realitat només tenim 3 formes: protonats per separat, els dos carregats i la forma no iònica per la qual l’aminoàcid no està carregat.
Aquesta forma no iònica existeix en solució ja que una solució sempre té un pH (àcid o bàsic). Suposem que es tracta de la glicina, amb dos grups ionitzables sabem que:  pH àcid (inferior a 2,5): tot està protonat i la càrrega neta és positiva  pH superior a 2,5 però inferior a 9,5 i per tant pH=7: hem perdut el protó del grup carboxílic (que està protonat) però no el del grup amino (segueix tenint càrrega positiva) de manera que la càrrega neta total és nula. Aquest és el punt isoelèctric de l’aminoàcid.
 pH bàsic (superior a 9,5): es perd el següent protó de l’amino i per tant la càrrega neta és negativa.
Hem observat doncs que l’espècie no iònica mai no existeix. En general l’espècie que viu a pH fisiològic és la forma zwitterió i és una molècula que pot actuar tant com a àcid com a base i la seva càrrega neta és nul·la. Existeixen 5 aminoàcids que presenten un grup ionitzable addicional (tindran 3 pKas en comptes de 2): arginina, lisina, histidina, glutàmic i aspàrtic.
En aquests aminoàcids, per exemple el glutàmic, trobarem 3 grups ionitzables: la ionització del α - carboxílic, α - amino i entremig un altre grup, en aquest cas (el del glutàmic) és el carboxílic de la cadena lateral addicional, ens fixem que tot i que sigui el mateix grup (carboxílic) el pKa es diferent per la disposició a l’espai. En aquest cas primer es perdrà el protó del αcarboxílic i després el de la cadena lateral. Això implica que a pH fisiològic tenim càrrega neta negativa.
Ionització dels aminoàcids Els aminoàcids s’ionitzen en 3 o 4 espècies en funció de si la cadena lateral es pot o no es pot protonar. Quan els aminoàcids no tenen càrrega lateral a pH neutre existeix la forma zwiterriònica (explicada anteriorment) mentre que quan tenen càrrega a la cadena lateral la forma que existeixi a pH neutre determinarà la carrega, positiva o negativa en funció de la càrrega que presenti aquesta cadena lateral. Un cas en que la cadena lateral es pot protonar és el glutamat, que presenta 3 pKas en els quals un prové de la cadena lateral.
En els aminoàcids àcids sempre es perd abans el α – carboxílic i després la càrrega lateral.
En aquest cas, a pH neutre predomina la tercera espècie amb càrrega neta negativa. Per tal de calcular la quantitat d’aquesta espècie a un pH determinar s’utilitza l’equació de Henderson – Hasselbach: pH = Pka + log ([A-]/[AH]) considerant l’equilibri del pKa més proper al pH de treball.
9 Judith González Gallego Química i enginyeria de proteïnes T1 Capacitat d’absorció de llum ultraviolada Sabem que la Tirosina, el triptòfan (en gran quantitat) i la fenilalanina en menor quantitat són capaços d’absorbir la llum ultraviolada de manera que quan volem quantificar “quant” tenim d’una proteïna tenim dues maneres de fer-ho:  Quantificar el nombre d’enllaços peptídics amb reactius químics  Quantificar la seva absorbància a 280 nm (quan més alta és la concentració d’aquests aminoàcids més copies tindrem i més gran és la proteïna) Si una proteïna no presenta aquests aminoàcids és més difícil de quantificar. Cal que recordem com a grups funcionals importants el fenol, indol, imidazol i guanidini.
REACTIVITAT DELS AMINOÀCIDS Quan parlem de reactivitat química dels aminoàcids parlem de la capacitat de formar enllaços covalents; alguns grups dels aminoàcids poden formar enllaços covalents reaccionant amb d’altres molècules sota diferents condicions. Tenim dos tipus d’aminoàcids: electròfils i nucleòfils.
Tipus d’aminoàcids reactius Electròfils Aquests tenen afinitat pels electrons i en essència són l’Aspàrtic i el Glutàmic. El que fan essencialment és en la majoria dels casos donar electrons a un enllaç doble de manera que es forma un nou enllaç entre les dues molècules que reaccionaven.
Això només passa quan ens trobem a pH per sota del pKa perquè per tal que la reacció es doni lloc necessitem l’hidrogen unit.
10 Judith González Gallego Química i enginyeria de proteïnes T1 Nucleòfils Són molècules que tenen tendència a donar electrons i per tant reaccionen quan ens trobem a pH per sobre del pKa. Trobem dins d’aquest grup la Tirosina, Histidina (les dues anteriors en menor quantitat), Lisina i Cisteïna (grup més reactiu). Sabem que les proteïnes només tenen un grup α – amino en posició N-Terminal, al principi de la cadena.
Aquests grups són importants perquè essencialment el carboxílic del glutàmic, aspàrtic i cisteïna es poden modificar molt fàcilment perquè tenen tendència a formar enllaços de manera que això ens serveix per col·locar un grup fosforescent i observar-los. Quan volem fer reaccionar un grup químic amb una proteïna tenim aquestes molècules per elaborar-ho.
La cisteïna quan està per sobre del seu pKa perd el protó del grup tiol i aquesta fora és extremadament reactiva. Una de les coses que voldrem fer durant l’anàlisi de proteïnes es trencar els seus ponts disulfurs (introduint condicions reductores) i el problema d’aquesta reducció és que a pH neutre tenim una part de les molècules molt reactives el que genera novament la formació. Si volem fer un anàlisi proteòmic necessitem sempre que la proteïna estigui lineal (sense protons) i el problema és que si només reduïm el pont es tornarà a fer de manera que el que haurem de fer es bloquejar les cisteïnes provocant la seva reacció amb iodeacetat el que permet la unió de les molècules i que no es formin ponts disulfurs.
Un enllaç molt important també dins les proteïnes és la formació del pont disulfur. Aquesta és una reacció d’oxido – reducció i no és un atac nucleofílic ja que treballem per sota de pKa. Com les proteïnes es troben en un ambient aquós, amb oxigen atmosfèric, que es suficient per promoure l’oxidació dels dos tiols i formar un pont disulfur, una unió covalent i estable.
Aquesta reacció allibera aigua i és molt fàcil de formar i per tant, difícil de trencar.
Per trencar un pont disulfur hem de reduir: necessitem una molècula com el β – mercaptoetanol o el ditiotreitol (si és molt ric). El primer que elaborarem és desnaturalitzar la proteïna, trencar-la i obrir – la. Per tal de trencar els enllaços introduïm aquestes dues molècules que tenen un grup tiol lliure, que en la majoria dels cassos és més reactiu que el de les cisteïnes de manera que ataca als sofres del pont, formant un enllaç amb ell el que provoca que es trenqui l’enllaç preexistent. Sempre que aquestes molècules estiguin en el medi estaran reduïdes mentre que si ho traiem es tornaran a formar.
11 Judith González Gallego Química i enginyeria de proteïnes T1 Importància dels grups reactius Sabem que una de les utilitats més importants de la reactivitat dels aminoàcids es saber quin és el N-Terminal d’una proteïna ja que s’aprofita la reactivitat del α – amino. El que farem és un atac nucleofílic i per tant treballarem a pH àcid introduint un reactiu anomenat clorur d’acil, que presenta color. La reacció provoca que el clorur s’uneixi al nitrogen de l’extrem formant un enllaç amida entre el reactiu i la proteïna.
A continuació el que es fa (en realitat és una tècnica en desús) és introduir un pH molt àcid amb 1M d’àcid clorhídric en una ampolla tancada a 100 graus i el que volem és trencar tots els enllaços peptídics de les proteïnes, enllaços molt estables que per trencar-se necessiten condicions extremes com les indicades. El que fem és separar tots els diferents aminoàcids i només estarà marcat el que hi havia inicialment en N-Terminal.
Per tal de conèixer quin aminoàcid és tenim una columna en la qual jo separo els aminoàcids en funció de les seves propietats (de la seva càrrega o al seva hidrofobicitat) de manera que comprem un patró comercial en el qual tots els aminoàcids estan marcats i al punxar-lo a la meva columna puc saber quin és el moment en que ha d’eluir el meu aminoàcid. Un cop calibrada la columna introduïm la mostra i obtindrem un únic pic, corresponent a l’aminoàcid en posició N – Terminal.
Aquesta tècnica doncs aprofita el fet de poder atacar específicament l’extrem N – Terminal de la proteïna. Cal tenir present que perquè es marqui únicament aquest extrem i no els altres juguem amb un pH entremig en que no tot està protonat i podem determinar i decidir, en funció del pH, quines de les amines sigui el grup més reactiu.
Columna d’elució dels aminoàcids.
12 Judith González Gallego Química i enginyeria de proteïnes T1 CLASSIFICACIÓ DELS AMINOÀCIDS Els aminoàcids es poden classificar, essencialment en funció de la seva càrrega, aromacitat, hidrofobicitat... i a més d’altres propietats com alifàtics, aromàtics, hidroxílics, presència de sofre, grans, petits... Això és molt important perquè els aminoàcids que s’assemblen en propietats (com la mida o la hidrofobicitat) els podem intercanviar entre ells en una proteïna de manera que com més aspectes o característiques tinguin en comú més s’assemblaran i més fàcil serà elaborar el canvi.
Aquest fet doncs és molt important perquè ha determinat al llarg de l’evolució quines són les substitucions que s’han donat lloc.
S’han agafat proteïnes que estaven emparentades evolutivament si s’han simulat mutacions puntuals en el DNA i quin seria l’efecte d’aquestes. A més, s’ha comparat la situació teòrica que aquestes mutacions es produeixin amb el fet que realment hagi passat de manera que si el canvi el trobo molt en l’evolució es poden substituir els aminoàcids i si mai no el trobo no es poden substituir.
Ens fixem en la següent taula i estudiem alguns dels canvis produïts sabent que els residus més propers són els més semblants: 13 Judith González Gallego Química i enginyeria de proteïnes T1 Canvi de serina per glicina Teòricament si la mutació és random i no hi ha cap factor que el fixi és igual quin residu hi hagi. El canvi de serina per glicina es produiria unes 16 vegades (teòricament) i si mirem les vegades que s’ha produït al llarg de l’evolució sabem que és més superior, al voltant de 46 vegades, és a dir, existeix una selecció a favor. Aquests dos residus són petis i en certes regions hi caben els dos de manera que si la regió no és estructuralment o funcionalment molt important no és estrictament necessari la presència d’un aminoàcid més afavorit que l’altre Canvi d’isoleucina i valina El canvi teòric es produeix unes 18 vegades i el real 66. En aquest cas els aminoàcids no tenen el mateix tamany però a l’escala de la hidrofobicitat són molt pròxims de manera que si estan els dos aminoàcids en una zona hidrofòbica i els dos caben en la mateixa posició és indiferent el que trobem.
Canvi de prolina per treonina En aquest cas la probabilitat teòrica és de 28 vegades mentre que la real és de 7. Sabem que la prolina és un residu molt especial ja que està ciclat i per tant no la podem canviar pràcticament per res ja que és un residu molt petit i només es pot canviar quan no té funcionalitat i a l’espai hi cap un altre aminoàcid.
Podem observar altres exemples com el canvi de Arginina per Lisina que és molt produït o el de Lisina per glutàmic en que cal tenir present que tot i que els dos estiguin carregats en molts llocs el canvi no es pot produir.
Observem la següent taula on també veiem una comparació entre els canvis reals i la random, en general tenim un valor que prové de canvis reals / canvis per atzar * 10.
Observem que el triptòfan es canvia per triptòfan amb un valor de 414, un valor elevat ja que és un aminoàcid molt especial que no es canvia per cap altre. En general els canvis entre aromàtics tenen valors superiors a 10, el que vol dir que es tolerant. Quan hem de canviar un triptòfan preferiblement el canviarem per un altre triptòfan o per un altre aromàtic en que l’acomodació és millor.
14 Judith González Gallego Química i enginyeria de proteïnes T1 Si el valor que trobem és de 10 vol dir que el canvi és indiferent. Si el valor és superior a 10 doncs, el canvi estarà afavorit (òbviament cal tenir present que és millor no canviar cap residu) i si és inferior a 10 és que el canvi pràcticament no es dona.
La cisteïna també té un valor molt gran però es canvia per cisteïna molt probablement perquè elaboraran un pont disulfur de manera que si canviem aquesta cisteïna per un altre residu el pont no es podrà formar. La metenonia està casi sempre en random perquè té un sofre i la cisteïna té u paper estructural en ocasions es poden canviar.
En general sabem que no tots els canvis són possibles, hem observat que si molts canvis tenen llocs aquests seran fixats mentre que si la proteïna no pot funcionar degut al canvi aquest no serà fixat ni afavorit.
Relació del codi genètic i els aminoàcids Els investigadors s’han adonat que el codi genètic agrupa els aminoàcids en funció de les característiques fisico – químiques, de manera que els canvis i mutacions tenen un impacte menor. Si hi ha un canvi en una proteïna aquest ha de ser per un aminoàcid que tingui una característica similar al inicia.
Hi ha mutacions que es poden fixar perquè no provoquen un canvi el la lectura d’aminoàcids i això sempre passa en el 3r codó mentre que si la mutació es produeix en el 2n codó és molt més complicat. En general en el 3r codó sempre tenim una aminoàcid de caràcter hidrofòbic de manera que si passem d’una leucina a isoleucina no existeix un gran problema perquè són aminoàcids semblants que permeten el plegament de la proteïna i que aquesta sigui funcional, i en general, s’espera a que l’evolució reverteixi el canvi.
Observem que el triptòfan està rodejat per tres codons STOP perquè és un aminoàcid que està molt fixat, és a dir, no es pot canviar per res perquè cap altre aminoàcid es pot acomodar de la mateixa manera.
El codi genètic ha evolucionat perquè els canvis a les seqüències siguin tolerables. Les proteïnes ancestrals el que feien era ajudar a la replicació del DNA (primeres proteïnes) i amb la observació del codi genètic actual es genera el dubte si les primeres proteïnes ja van utilitzar aquest codi o si van utilitzar els 20 aminoàcids que avui en dia coneixem. El senyor Pudritz va elaborar un estudi en que va observar quina era la freqüència dels aminoàcids en proteïnes de bacteris i com això es correlaciona amb l’energia requerida per sintetitzar aquest aminoàcid (ho elabora pels 20 aminoàcids). D’aquest estudi s’observa una correlació lineal a dalt de la taula que desprès es perd: les primeres proteïnes estaven formades per aquest conjunt d’aminoàcids i la seva freqüència corresponia als aminoàcids disponibles o com de difícil era sintetitzar aquest aminoàcids. Aquest paràmetre va ser el que es va fer servir per construir les primeres proteïnes (els grups que costen molt de sintetitzar com els cíclics no s’utilitzaven ja que era necessari un gran requeriment energètic).
15 Judith González Gallego Química i enginyeria de proteïnes T1 Hi ha aminoàcids que van aparèixer per refinar l’estructura o funció, en l’esquema els que estan més a sota apareixen més tard per aquest motiu eren necessaris ja que per exemple, el triptòfan no hi era ancestralment perquè costava molt de sintetitzar i és un aminoàcid molt específic.
Aquests aminoàcids (hidrofòbics, carregats positivament i aromàtics) no hi eren perquè les proteïnes estaven empaquetades a baixa densitat i només necessitaven d’un hidrofòbic per tancar l’estructura. Les proteïnes que coneixem avui en dia són proteïnes compactades i molt orientades motiu per el qual necessiten d’aminoàcids grans i hidrofòbics per generar l’estructura. Observem també que si que apareixen els aminoàcids carregats positivament però que inicialment només trobàvem aquells carregats negativament com aspàrtic i glutàmic.
Així doncs podem dir que el codi ancestral és un codi que ho tenia tot però és un codi simplificat. Actualment si que es podrien generar proteïnes amb aquest codi i un exemple és que en un laboratori es va generar un domini H3 amb un codi antic, una mica més complex que l’ancestral i es va aconseguir que la proteïna fos funcional in vitro tot i que presentava dos problemes bàsicament:  Era extremadament inestable ja que no estaba gaire empaquetada i això provocaba que no pogués actuar in vivo  No només és important l’estructura final de la proteïna sinó també ho es el plegament (en les proteïnes normalment és curt i varia entre nsegons o segons). Sabem doncs que aquesta proteïna presntava un plegament molt lent que conduïa a un segon problema que era l’exposició a solvent dels residus hidrofòbics, que tendeixen a unir-s eentre ells, a formar agregats el que provoca malalties (com l’alzehimer).
16 ...