PROCARIOTES - 2 - La replicació del DNA (2014)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Genética - 2º curso
Asignatura Biologia Molecular de Procariotes
Año del apunte 2014
Páginas 33
Fecha de subida 01/11/2014
Descargas 15
Subido por

Vista previa del texto

BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 1 LA REPLICACIÓ DE DNA EN PROCARIOTES COMPONENTS DE L’APARELL DE REPLICACIÓ – Què necessitem per replicar? - - - - - DNA Polimerases – les polimerases que intervenen són dues: la DNA polimerasa I i la DNA polimerasa III (en tenim 5). La resta intervindran en moments en els quals la cèl·lula estigui patint (lesions DNA, problemes de replicació). Les DNA polimerases catalitzen la polimerització dels dNTPs (desoxirribonucleòtids) juntament amb una cadena de DNA que actua de plantilla o motlle durant la replicació de l'ADN.
Encebadors (primers) – són creats per la RNA Polimerasa, de la qual només hi ha un tipus. Són un conjunt de proteïnes amb caràcter enzimàtic capaces de polimeritzar els ribonucleòtids per a sintetitzar ARN.
DNA Helicasa – trenca els ponts d’hidrogen que uneixen les bases nitrogenades de les dues cadenes (cadena estàndard i cadena retardada) i les manté estables.
DNA Lligasa – lliga la cadena naixent de DNA de la cadena retardada després que la DNA polimerasa hagi eliminat el RNA primari dels fragments d'Okazaki.
DNA Girasa – és una de les topoisomerases de DNA que actua durant la replicació del DNA per reduir la tensió molecular causada pel superenrotllament. La DNA girasa produeix talls de doble cadena que després són units per les ligasa (fa voltes i el destensa). Regula i gira l’obertura de les dues cadenes i deixa el DNA a punt perquè les dues cadenes puguin ser separades per l’helicasa.
Desoxiribonucleòtids – necessitem tenir suficients nucleòtids per poder replicar.
A més, també és necessari un senyal cel·lular previ a l’inici de la replicació perquè aquesta comenci.
1 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 1 PRIMOSOMA És l’agrupació de proteïnes associades (conjunt d’enzims) que intervenen en la formació del encebador de RNA que permetrà l’inici de la replicació de la cadena líder i dels fragments d’Okazaki. Està formada per: - DnaG (primasa) – és la RNA polimerasa.
Complex DnaB/DnaC – és l’helicasa.
DnaT – assisteix durant l’alliberació de la DnaC.
PriA, PriB, PriC POLIMERASES DE REPLICACIÓ – Polimerasa I i III La DNA-Polimerasa III és la més important en el procés de replicació. És la que realment s’encarrega del procés de replicació. Té una taxa d’error molt baixa, per tant la replicació que fa és molt viable. La DNA-Polimerasa I només és capaç de fer d’una tirada seqüències més curtes, serveix per fer petits fragments de DNA – es desestructura abans, s’equivoca més. Però la I és molt més freqüent dins la cèl·lula i té una activitat que no té la III – l’activitat exonucleasa de 5’ a 3’. Quan polimeritzen (les dues tenen activitat polimerasa) ho fan en la direcció 5’ 3’ i quan tiren enrere (les dues tenen activitat exonucleasa) ho fan en la direcció 3’ a 5’. La diferència és que la I té activitat exonucleasa en la mateixa direcció que polimeritza (5’3’)i això el que permet és eliminar el que té davant, no enrere. Per tant, és qui eliminarà els encebadors dels fragments d’Okazaki enganxant-se als extrems d’aquests, actuarà com a encebador i començarà a polimeritzar, eliminant nucleòtids i polimeritzant DNA (elimina el RNA que hi ha en els fragments d’Okazaki). Entre fragments hi haurà un espai, no hi haurà un enllaç fosfodièster; la DNA lligasa s’encarregarà més tard de produir aquest enllaç.
2 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 1 Com hem dit, les dues tenen activitat exonucleasa de 3’ 5’ (les dues poden tirar enrere si s’equivoquen), que s’anomena activitat proofreading (s’asseguren que allò que han copiat és correcte i ho reparen si està malament). Aquesta activitat, però, és molt més bona en la polimerasa III. Per això la replicació que fa aquesta és més fiable, perquè se n’adona abans dels errors i els corregeix amb més precisió. Per canviar una base que ja ha estat posada és pel que és necessari l’activitat exonucleasa 3’ 5’.
En quant a mutacions de les polimerases: Si la DNA-polimerasa 3 té una mutació, és letal, perquè no es pot dur a terme la replicació. Si la mutació la té la DNApolimerasa 1, hi ha una baixa viabilitat si és defectiva en activitat Exo 5’ 3’.
La DNA ligasa produeix l’enllaç fosfodièster entre els nucleòtids que han quedat separats a causa dels fragments d’Okazaki a la cadena retardada. La DNA-polimerasa 1 comença a replicar a la cadena retardada en els forats que han quedat entre fragments d’Okazaki, va replicant en sentit 5’ 3’ i gràcies a la seva activitat exonucleasa 5’ 3’ pot eliminar els encebadors que es va trobant, i fins i tot continua una mica més i torna a replicar una zona que ja estava replicada abans d’escindir-se. Però com només és capaç de replicar petits fragments, es desenganxa ràpid de la cadena, i no acaba replicant tot el cromosoma un altre cop, sinó que només té el temps suficient per eliminar l’encebador i una mica més. Per això es diu que és una cadena retardada – necessita que es vagin generant fragments d’Okazaki i que la Pol I degradi els ribonucleòtids i posi desoxiribonucleòtids i després que la lligasa li doni continuïtat.
L’altra diferència és que la DNA pol I és monomèrica (codificada per un únic gen) mentre que la DNA pol III és un enzim heteromultimèric, moltes subunitats codifiquen per la seva activitat.
3 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 1 Freqüència d’error de diverses polimerases(molt menor en pol III que en pol I).
DNA polimerases de replicació Totes les subunitats que formen l’holoenzim.
FUNCIONAMENT DEL MECANISME DE REPLICACIÓ 17/09/14 MODEL DEL TROMBÓ L’activitat polimerasa que ve donada per la polimerasa III en una forquilla de replicació es pot observar marcant nucleòtids. Així, s’ha vist que aquesta activitat està concentrada en un punt i no es desplaça al llarg de la cadena – és la cadena la que es va movent i va passant per on es troba el complex replicatiu. En aquell punt té lloc la polimerització (replicació) de la cadena líder i de la cadena retardada.
Això s’explica mitjançant el model del trombó – les figures de DNA que apareixen, al pavo que les va descobrir li recordaven a un trombó.
4 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 1 Com funciona aquest model? L’holoenzim polimerasa III recull les dues cadenes. Una de les seves subunitats és l’helicasa, que separa cada monocadena. Un cop obertes, a cada un dels braços hi ha polimerització, la polimerasa III pot replicar cada una de les monocadenes en sentit 5’  3’. I la cadena 3’  5’? La cadena a replicar de la patró (leading strand, cadena líder) està en el sentit 5’3’ però l’altre no, per tant la retardada crea un loop – una de les cadenes es gira (això és el que recorda a l’asa del trombó). L’helicasa obre les dues cadenes i una d’elles estarà copiant-se de 5’ a 3’ però generarà un loop i un encebador i així és com es canvia a 3’a 5’. Com sabem, la cadena retardada es replica per fragments, els fragments d’Okazaki. La monocadena que queda a l’espera de ser replicada, és estabilitzada per les proteïnes SSB – estabilitzen el DNA de cadena senzilla perquè no es plegui i així es pugui copiar.
També és molt important la proteïna β-CLAMP – és una subunitat que forma part del complex de la DNA Pol III i que permet que aquesta i el DNA es mantinguin units i així es pugui recórrer tot el DNA. En la replicació de la cadena líder, es manté sempre unida, i així aquesta cadena es replica tota d’una tirada. En canvi, en la cadena retardada la, β-CLAMP es va desenganxant i tornant a unir a la polimerasa 3. S’uneix concretament quan detecta un encebador a la cadena retardada. Quan la DNA-polimerasa arriba al següent fragment d’Okazaki ja replicat, la βCLAMP es torna a separar d’ella, de manera que la cadena retardada queda lliure. La polimerasa s’hi tornarà a unir a l’encebador següent. Així es van creant els fragments d’Okazaki en la cadena retardada.
La polimerasa I no té β-CLAMP, per això té un recorregut més curt sobre el DNA. La DNApolimerasa I intervindrà més tard eliminant l’RNA dels encebadors que han quedat a la cadena retardada. El lloc on se situa la DNA-polimerasa III s’anomena replisoma – és el punt on té lloc la replicació, on està la DNA pol III i l’helicasa. Comprèn l’helicasa, la polimerasa i el primosoma.
El primer de RNA el forma el primosoma. Anomenem holoenzim polimerasa.
el que té l’activitat 5 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 1 PASSOS LIMITANTS EN LA REPLICACIÓ 22/09/14 SÍNTESI DE dNTPs (desoxiribonucleòtids) La síntesi de nucleòtids (dNTPs) és un pas limitant de la replicació del DNA. Durant la síntesi, necessitem precursors de nucleòtids per poder dur a terme la replicació del DNA. Per cada 1000 ribonucleòtids (NTPs), tenim 1 sol desoxiribonucleòtid (dNTP). Hi ha més ribonucleòtids que desoxiribonucleòtids perquè hi ha més transcripció que replicació, i a més tenim monedes de canvi com ATP i diGMP (la cèl·lula contínuament està transcrivint, i té moltes molècules com l’ATP).
En el moment de la replicació, és necessari passar NTPs a dNTPs. L’enzim encarregat d’això és la Ribonucleotide-reductasa, que està composta per dos monòmers (actua com a dímer).
6 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 1 Aquest enzim per actuar necessita energia. L’estat energètic de la cèl·lula, per tant, regula aquest enzim – hi ha un lloc d’interacció per l’ATP que activa l’enzim, de manera que quan la cèl·lula nota que té molt ATP (quan està metabòlicament molt activa), està indicant que necessita dNTP perquè intentarà dividir-se en breus – necessita ribonucleòtids llestos per poder treballar. Com més ATP, menys inhibició al·lostèrica, perquè necessitem tenir més nucleòtids. Si tenim poc ATP, l’enzim voldrà dividir-se amb la calma.
És important que la cèl·lula controli que només es passin els necessaris per la replicació, perquè els NTP de la cèl·lula també els necessita per transcriure i fer funcionar la cèl·lula correctament. Només se passa de NTP a dNTP quan la cèl·lula es vol dividir.
El control de la síntesi es fa doncs per feedback del producte (té uns punts d’interacció al·lostèrica de substrat que permeten que la concentració del producte final reguli l’enzim i la síntesi de nou producte). Això fa que els dNTPs es produeixin equilibradament – la ribonucleotidil reductasa manté l’equilibri de % de guanina i citosina, que ha de ser el mateix, i també ho fa amb l’adenina i la timina. L’enzim es va ajustant per feedback per mantenir aquest equilibri a la replicació – produeix les 4 bases per igual (proporció equimolar) i a cada bixarraco l’enzim s’ajustarà de forma correcta.
Les citosines (dCTP) són les úniques que no fan feedback, el fan els altres nucleòtids. Les dTTP són especials, ja que l’enzim produeix dUTP a partir d’UTP, i després hi ha molts passos addicionals amb molts enzims per convertir el dUTP en dTTP.
El que fa feedback, però, és el dTTP, per tant diem que la ribonucleotidil és un enzim controlat per punt final. La dTTP és la que inhibeix més perquè tarda més 7 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 1 a produir-se, i és la que marca més l’equilibri.
Hi ha microorganismes amb % de GC diferents a d’altres (abans es feia servir per classificarlos), i això és important a nivell de l’enzim – s’acabarà produint més GC que AT.
MARCATGE DE DNA IN VIVO En molts casos, ens és necessari marcar els nucleòtids del DNA d’un procariota pels nostres experiments. Això es fa amb anàlegs de timina que són reconeguts per la cèl·lula i incorporats a la cadena de DNA. Aquesta timina anàloga està marcada de forma fluorescent. Per què només de timina? Perquè la T només està al DNA. Si utilitzéssim adenines, podríem tenir marcat RNA. A més, les timines no poden retornar mai a la seva forma de ribonucleòtid d’uracil (és l’únic dNTP que no pot fer el pas enrere cap a NTP).
Per marcar el DNA també es poden obtenir mutants incapaços de produir timina. Llavors se’ls ha d’inserir anàlegs de timina marcats (en el cas anterior, el bacteri produïa timines pròpies a més de les subministrades). Els anàlegs de timina no participen en el control al·lostèric.
L’enzim ThyA és específic de dTTP i està codificat pel gen thyA. ThyA és capaç, en diferents passos, d’inhibir la incorporació de dTTP exògena. La cèl·lula normalment no incorpora dNTP de l’exterior perquè ja li va bé produir els seus propis per regular la replicació.
Però si inhibim el gen thyA i per tant no hi ha enzim ThyA, la cèl·lula pot (i necessita) incorpora dTTP de l’exterior. Les cèl·lules sense ThyA són inviables si no hi ha dTTP a l’exterior.
Per tant, el problema ve quan les cèl·lules no incorporen els anàlegs de timina que nosaltres li posem al medi. Per què no la incorporen? Existeixen uns transportadors per la timina, però estan inhibits de forma indirecta per la presència d’un enzim, el Timidilat sintetasa (ThyA) – és l’enzim que passa d’uracil a timina (de dUMP a dTMP, que posteriorment acabarà sent dTTP gràcies a una kinasa). Aquest enzim, per actuar, necessita un cofactor (molècula que afegida Control de la síntesi de dNTP. Cada desoxiribonucleòtid regula a l’enzim l’ajuda a funcionar) – per produir la timina necessita incorporar a la seva estructura la seva pròpia síntesi i la de la resta de desoxiribonucleòtids.
aquest cofactor que és l’àcid tetrahidrofoli (THF), que passarà a ser àcid dihidrofoli (DHF). Un altre enzim (Dihydrofolate reductasa) és el que fa el pas de THF a DHF i també el pas novament de DHF a THF per reciclar-lo.
Existeix un antibiòtic, el TRIMETOPRIM, que mata les cèl·lules (bactericida). Per què les mata? Perquè bloqueja la Dihydrofolate reductasa (impedeix el pas de DHF a THF). Les cèl·lules llavors es moren perquè no són capaces de sintetitzar timina en faltar-li el cofactor a l’enzim encarregat de sintetitzar-la (sense THF no es produeixen Dttp per molt que la cèl·lula tingui ThyA). Aquestes cèl·lules, si les posem en un cultiu amb timina, es moren igual tot i que tenen timina a l’exterior perquè, en tenir ThyA, es pensen que estan produint timines i la incorporació de l’exterior està inhibida, però en realitat no en té i mor.
8 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 1 Però sempre hi ha una pressió selectiva i una selecció natural i trobarem algunes cèl·lules resistents a l’antibiòtic. Les cèl·lules que resisteixen al TRIMETOPRIM, les que muten i segueixen creixent al cultiu, són cèl·lules que han mutat l’enzim ThyA, de manera que no és funcional i no bloqueja el transportador de timina– el cofactor no és funcional però el ThyA tampoc i llavors poden incorporar la timina del medi (la cèl·lula reconeix que no està produint timines).
TOTAL. Que si volem marcar el DNA volem un mutant que no sintetitzi timina perquè així tota la que tindrà serà la del medi, i només podem saber quines tenen la ThyA mutant si les fotem amb TRIMETOPRIM. La Ribonucleotide-reductasa no ens la podem carregar – la gràcia és que la timina no tingui punt de retorn per la ThyA (és l’enzim que bloquejava el transportador de timina).
Com obtenim un mutant així? Necessitem eliminar el gen thyA per tal que siguin ThyA-. El podem construir de forma dirigida o simplement podem posar TRIMETOPRIM i quedar-nos amb les cèl·lules capaces de créixer – aquestes seran les que tindran petat aquest enzim i podran incorporar la timina exògena. A més, els anàlegs de timina no entren en el lloc al·lostèric de la Ribonucleotide-reductasa, de manera que no afecten a la síntesi d’altres nucleòtids.
NOTA: És resistent al bactericida pel fet que segueix creixent amb ell al medi, però no perquè no faci efecte – el TRIMETOPRIM mata l’enzim que toca igualment, l’únic que al bixito pos li suda perquè te l’altre enzim raro i li entra la timina fluorescent de fora i no necessita sintetitzar-la.
LA REPLICACIÓ EN PROCARIOTES – O Incio On comença la replicació del cromosoma? Qui i quan s’inicia la replicació? Hi ha una única proteïna que controla tota la resta – la DnaA. És la que activa la formació de forquetes de replicació. L’inici de la replicació es produeix a l’OriC.
NOM BACTERI  Escherichia coli (1r cop). E. Coli (2n cop).
- NOM GEN  dnaA NOM PROTEÏNA/PRODUCTE GÈNIC  DnaA ANATOMIA DE L’OriC D’E. coli Tots els orígens de replicació es caracteritzen per tenir uns llocs de reconeixement de la proteïna DnaA, una seqüència de DNA per la qual la proteïna DnaA té afinitat, i que anomenem caixes de DnaA.
Aquestes caixes poden ser d’alta o baixa afinitat – la seqüència de més afinitat és TTATCCACA, i com més diferències hi hagi respecte aquesta seqüència, menys afinitat tenen les caixes (s’anomena seqüència consens). A vegades interessa tenir regions molt afins i regions no tant afins. Per cada microorganisme, la seqüència serà una concreta. En l’origen de replicació n’hi ha vàries successives (repetides vàries 9 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 1 vegades) i poden estar orientades en direccions contràries.
NOTA: Una "seqüència consens" especifica quins són els elements comuns a les seqüències trobades en diferents situacions (gens, espècies ...) per a una mateixa funció. La mera existència d'aquest consens, és a dir, la presència sistemàtica d'aquests elements comuns, és informativa perquè ens indica que són importants per a la funció. Majoritàriament, predominen uns nucleòsids.
En l’OriC també trobarem regions riques en A i T. Per què? Hi ha 3 seqüències de 13pb que s’organitzen en repeticions en tàndem. Com que aquestes dues bases s’uneixen per 2 ponts d’hidrogen, costa menys separar les 2 cadenes per aquestes regions – si busquem una regió feble serà una regió rica en A – T perquè la força que has de fer per obrir-les és menor.
A prop d’aquestes regions AT també tenim una regió d’interacció de l’helicasa.
OriC d’E. coli L’helicasa no pot interaccionar amb un lloc de reconeixement si és de doble cadena. Les proteïnes DnaA, en unir-se a les caixes de DnaA, fan que les dues cadenes se separin per la zona rica en AA i T, i llavors quan és de cadena senzilla l’helicasa s’hi uneix i munta el replisoma.
Per tant, l’inici de replicació comporta l’obertura de les dues cadenes en una regió rica en A T perquè es munti l’helicasa, el primosoma i el replisoma complet; no és l’helicasa qui obre les cadenes, és la DnaA.
A part de tot això, ens trobarem moltes regions amb seqüències GATC (gats catalans).
Les seqüències GATC són les regions reconegudes per una metilasa. En OriC, GATC és una regió reconeguda per la metilasa-DAM que metila les adenines d’aquestes seqüències. Recordem que el DNA de normal està metilat, i quan passa la forquilla de replicació, una cadena queda metilada i una no (replicació semi conservativa). La metilasa-DAM és l’encarregada de metilar la cadena nova. La combinatòria fa que tinguis un GATC cada X parells de bases, però en l’origen de replicació n’hi ha més i no per atzar; allà n’hi ha d’haver més dels que tocaria per aleatorietat. El motiu és que la seva funció està relacionada amb l’inici de la replicació. * 10 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 1 En altres S’INICIA bacteris, si mirem COM LA l’OriC, veiem que l’estructura és molt similar REPLICACIÓ? (les boxes poden ser més grans o més petites, la seqüència rica en AT també pot ser mésCOOPERATIVA gran o més petita).
UNIÓ DE LA DnaA S’ha de muntar el replisoma en l’origen de replicació. Recordem que l’helicasa necessita que algú li obri les cadenes per incorporar-se i començar a trencar els ponts d’hidrogen.
La proteïna DnaA és essencial ja que no només reconeix el DNA en les caixes d’interacció – també té interacció cooperativa. Qué quiere desir eso? La proteïna DnaA necessita una caixa d’alta afinitat per unir-se al DNA. Un cop unides, és una mica més fàcil que una altra proteïna s’uneixi al DNA. Quan tens dos, és encara més fàcil que una altra s’uneixi. Arriba un punt que no cal una caixa DnaA – la unió cooperativa implica que la proteïna interacciona amb el DNA en les caixes d’alta afinitat fins que n’ha ancorat unes quantes, ja que llavors arriba un moment que no necessita que a la seqüència del DNA on s’està unint hi hagi una caixa d’alta afinitat. Per tant, nucleen la interacció en aquella regió – la proteïna ancorada al DNA el que fa és nucleofilamentar al voltant del DNA enganxant-se entre elles fins que embolcallen el DNA.
11 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 1 ATP-DnaA = vermell Caixes ATP-DnaA = blau Caixes d’alta afinitat =magenta La interacció entre les proteïnes al final de la unió és molt forta – arriba a ser més forta la força que fan aquestes proteïnes entre elles que els ponts d’hidrogen que fan els nucleòtids que estan embolcallant. Descubierto el perejil. Si entre elles la unió és tan forta que poden trencar els ponts d’hidrogen, sobretot si es tracta d’una zona rica en AT, el complex s’obre i l’helicasa ja serà capaç d’interaccionar i podrà obrir el DNA (separar cadenitas).
Un cop el complex queda obert, l’helicasa (o DnaB) s’incorporarà en la zona de reconeixement i faran la seva funció, que és continuar obrint la doble cadena a partir del punt on ho han fet les DnaA. Per això aquestes ja no són necessàries i salten. Finalment es carrega el β-clamp, les dues polimerases i la girasa (que el que farà és girar en direcció contrària a l’helicasa per generar sobreenrotllament negatiu i així contrarestar el sobreenrotllament positiu que genera l’obertura de la doble cadena, evitant així que el procés s’aturi), per tant ja tenim muntat el primosoma. Finalment arriba la topoisomerasa, que se situa davant la DNA polimerasa III dels dos complexos i va enrotllant les dues noves cadenes de DNA.
CONTROL DE L’INICI DE LA REPLICACIÓ La replicació del DNA per iniciar-se necessita que hi hagi suficient concentració de proteïna DnaA com per ocupar els llocs d’interacció, nucleofilamentar (una fibra en la cromatina és un nucleofilament – és aproximadament 10 nanòmetres en diàmetre i es compon de DNA embolicat al voltant de nuclis nucleosoma) i separar les dues cadenes.
La cosa és que, un cop muntades les primeres forquilles, la replicació pot tornar a començar quan es torna acumular la suficient quantitat de proteïna DnaA. Si dius me voy a dividir, muntes la forquilla i et repliques. Així que la única premissa per començar a replicar el cromosoma bacterià és la concentració de proteïna DnaA – un cop l’has obert i has muntat un replisoma, si acumules otra veh suficient concentració pots tornar a obrir l’origen de replicació (tan el vell com el nou) sense necessitat que el primer hagi acabat de replicar el cromosoma o hagi dividit la cèl·lula encara. És a dir, que una cèl·lula pot tenir més d’un cromosoma en marxa. Valen o no? Però que s’estarà dividint en diverses tongades d’inicis de replicació – el 12 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 1 bacteri inicia la replicació cada cop que la concentració de proteïna sigui suficient, independentment que s’hagi donat a terme la replicació del tot.
CONTROL DE LA DISPONIBILITAT DE DnaA-ATP EN L’ORIGEN Llavors això quan para? Esto es un follón. Com es regula perquè aquest orígens no sobrin constantment encara que tinguem suficient DnaA? Tenim vàries formes de modular una mica els inicis de la replicació.
- - La DnaA quan salta no es degrada per proteases (té una vida mitjana més llarga) – la DnaA que interacciona amb boxes és una proteïna carregada amb ATP. En el moment que salta, salta la proteïna amb ADP i no té capacitat d’interaccionar amb el DNA, per tant tens una mica de pausa entre replicació i replicació.
Un altre manera de control a nivell transcripcional, regulant quanta proteïna DnaA es produeix.
Control transcripcional 13 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES - - - - PARCIAL 1 També es regula a nivell de la disponibilitat dels boxes – bloquejant l’accés de DnaA a les zones d’interacció.
Tornant a la forqueta – acabem de muntar el replisoma i ja s’estan col·locant els βclamps. El gen dnaA està molt a prop de l’origen de replicació. El promotor d’aquest gen dnaA està associat al bloqueig de la transcripció per feedback de la pròpia proteïna quan s’enganxen DnaAs amb ATP en aquella regió (cercle groc en l’anterior imatge). Així doncs, quan iniciem la replicació no crearem més DnaA innecessàries i evitarem més replicacions – la DnaA-ATP s’uneix al promotor del gen dnaA i fa un feedback negatiu.
A més, tenim la proteïna Hda associada al βclamp (en verd a l’anterior imatge) que facilita el pas de DnaA-ATP a DnaA-ADP. En un procariota, la replicació, transcripció i traducció tenen lloc al mateix punt. Si acaba de passar la forquilla i l’helicasa i ha saltat la DnaA associada al promotor, comences a transcriure i produeixes la proteïna, i encara que produeixis noves βclamps, la Hda te la tornarà a ADP – dice no empieces loca que acabas de empezar. Això dóna un temps entre dos inicis de replicació.
A prop de l’OriC també hi ha una regió anomenada datA – és una regió que acumula caixes de dnaA. Així es regula la quantitat de DnaA-ATP disponible – datA acumula 5 caixes d’alta afinitat per DnaA.
Al llarg del cromosoma també hi ha més regions amb alta interacció (gidA, DnaA, mioC, trp, uvrB...). Què fa això? Com són regions d’alta afinitat, el DnaA està anant allà, per tant necessites més concentració de DnaA per tornar a començar a replicar.
La concentració real de DnaA serà més gran de la que necessitaries si només interaccionés amb l’origen de replicació. La prioritat número 1 seran aquestes caixes que té la datA i després l’origen de replicació. Això també dóna una pausa entre dos replicacions seguides. A més, hem de tenir en compte que totes aquestes caixes de DnaA van augmentant en nombre com més s’allunya la forquilla de replicació de l’OriC, de manera que cada cop hi ha més proteïnes DnaA unides a elles.
És a dir, el número de caixes DnaA que hi ha al cromosoma no és fix – va variant en funció de com avancen les forquetes de replicació. Com més a prop de l’origen, més còpies de gen.
14 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES - - PARCIAL 1 La cèl·lula també té una seqüència propera a l’OriC que transfereix la DnaA-ADP a DnaA-ATP; això té lloc a les regions DARS1 i DARS2. De normal, les caixes reconeixen DnaAATP, excepte en aquestes regions que uneixen DnaA-ADP. En aquestes regions, quan s’escindeix la proteïna, ho fa en forma de DnaA-ATP. És una forma de reciclar la proteïna quan està en baixa concentració, ja que s’ha de mantenir un equilibri amb els mecanismes que redueixen el nombre de DnaA-ATP.
Un altre mètode de control és el de les seqüències GATC. Aquestes regions que dèiem d’alta afinitat per DnaA no s’obren perquè a prop no hi ha cap regió rica en A-T (regions febles). Això fa que no funcionin com a orígens de replicació, sinó com a llocs de segrest de DnaA. És a dir, tot això passa gràcies al segrest, gràcies a les caixes GATC.
Com funciona aquest mecanisme? Els GATC són reconeguts per la proteïna SeqA.
Aquesta proteïna està associada a la membrana de la cèl·lula i reconeix GATC hemimetilats, quan només una de les cadenes està metilada. Aquesta situació es dóna justament després de la replicació, quan la nova cadena encara no està metilada ja que a la DAM-metilasa encara no li ha donat temps a metilar. La proteïna SeqA associada a la membrana ho reconeix i s’hi enganxa. En el moment en el qual passa la forquilla, com que SeqA és molt gran, evita que les altres proteïnes vegin la DnaA– amaga la regió i espera a que passi un ratet. D’aquesta manera, com que no deixa a la vista les DnaAs, no s’hi enganxen més i no es torna a replicar innecessàriament. Quan deixa el DnaA la SeqA? Quan estigui metilada, quan vingui la DAM-metilasa (la DAMmetilasa sí que la veu). El motiu del segrest evita que el DnaA s’uneixi a l’origen massa ràpid i la replicació sigui massa continua.
15 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 1 REPLICACIÓ BIDIRECCIONAL DEL CROMOSOMA – E. coli 23/09/14 Quan entra el replisoma al cromosoma, aquest va avançant per si sol i va replicant a banda i banda d’OriC. La replicació és bidireccional perquè a l’OriC s’instal·len dues forquilles de replicació, dos replisomes. Això vol dir que entren en joc dues helicases, dues polimerases III,, etc. per cada replisoma. Una meitat del cromosoma serà responsabilitat d’una forquilla, i l’altra meitat de l’altra.
En altres microorganismes només hi ha una forquilla de replicació. Fins i tot, en microorganismes amb més d’un cromosoma, pot ser que cada un es repliqui de forma diferent: amb una forquilla o dues.
16 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 1 Observant una imatge d’un cromosoma dividint-se podem saber si hi ha una o dues forquilles, sempre que també sapiguem on és l’OriC.
17 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 1 ELONGACIÓ DEL DNA LA REPLICACIÓ EN PROCARIOTES – O final Com es paren els dos replisomes que van avançant? Com ho fan per no passar-se després d’haver replicat la meitat del cromosoma, de manera que no continuïn replicant una part que ja hagi replicat l’altre replisoma? Intervenen la proteïna TUS (Terminus Utilization Substance) i les seqüències Ter. TUS són proteïnes de terminació de replicació del cromosoma bacterià – bloquegen l’helicasa DnaB (bloquegen el complex de replicació). Les seqüències Ter són el lloc d’unió de les proteïnes TUS, són les que disminueixen la velocitat del replisoma. Quan s’uneixen, és quan té lloc la inhibició de l’acció de la proteïna DnaB seguida del bloqueig del complex de replicació.
FINALITZACIÓ DE LA REPLICACIÓ CROMOSÒMICA A E. Coli Cada replisoma es veu aturat per les TUS i seqüències Ter més llunyanes, les que estan situades més enllà de la meitat del cromosoma que replica (és a dir, les roses aturen el replisoma verd, i les taronges aturen el replisoma vermell).
18 Unió a les regions específiques Ter.
BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 1 Les regions Ter i les proteïnes TUS tenen direccionalitat. Tenim diferents regions Ter on s’uneixen les proteïnes TUS, però una forquilla de replicació veu unes regions Ter i les altres les ignora, i l’altre forquilla que ve per la banda contrària fa el mateix amb les regions contràries.
Independentment del nom de les proteïnes, l’ancoratge de les TUS té direccionalitat – si la forquilla ve pel costat que li és permès, la proteïna l’aturarà. Si ve per l’altre, no frenarà el replisoma. Quan la forquilla arriba pel costat no permissiu, la forquilla salta. Les raons per les quals salta encara s’estan investigant. Les teories són: - - Model actual: es creu que les TUS interaccionen amb el β-CLAM, fent que aquest reaccioni (canvi conformacional) i salti. Llavors ja no manté la polimerasa unida al DNA.
Model vell: el replisoma no pot passar ja que el DNA està ocupat per les TUS, i acaba saltant. És a dir, les TUS piquen amb la DnaB (helicasa) i la fan fora, i com la polimerasa no pot avançar es desmunta el replisoma.
Estructura de la regió Ter del cromosoma de Bacillus subtilis.
En A, les forquilles de replicació poden travessar terA i terB en una sola direcció, la contrària a la indicada per les fletxes. En B, quan es troben, entre (o dins) una de les dues bandes, la replicació del cromosoma acaba. fL és la forquilla que iniciava la replicació cap a l’esquerra i es movia en la direcció contraria a un rellotge. fR és la forquilla que iniciava la replicació cap a la dreta i es movia en la direcció del rellotge.
19 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 1 Si el replisoma passa la proteïna TUS per la part permissiva, fa saltar la proteïna TUS del DNA, i aquesta no es torna a unir. Així que en teoria està traient proteïnes TUS per aturar l’altre replisoma, però ara veurem que en realitat les proteïnes TUS només fan aturar un replisoma, i que l’altre acaba d’una manera diferent.
Si la polimerasa arriba per la regió no permissiva: el que tindrem és que l’helicasa intentarà obrir la cadena i xocarà amb la proteïna TUS – llavors es desacobla el replisoma, salta l’helicasa i la polimerasa i s’atura la replicació.
FOLLÓN: hi ha més d’una regió Ter i més d’una proteïna TUS perquè no sempre això passa a la primera, a vegades aquesta polimerasa que entra per la regió no permissiva és capaç de no desestructurar-se. Es podria dir que el que fan les TUS és anar alentint els replisomes fins que, al final, com les senyals són reiterades, algun l’atura.
Si els dos ho fan bé (un arriba fins lo blau i l’altre fins lo vermell) hi ha un tros duplicat. Si ho fan malament, tindrem un trosaco duplicat. Com arreglem això? Ho resolem amb el model de Holliday.
20 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 1 MODEL DE HOLLIDAY 1. Les dues forquetes estan intentant avançar. Tens una regió ter. La de l’esquerra para (STOP) perquè la regió ter té direccionalitat per parar-la. Aquesta forquilla ja no avança més, de l’esquerra ja no tenim més síntesi de DNA (una de les forquilles para i salta abans que l’altra perquè no es poden trobar les dues alhora obrint cadenes). La de la dreta segueix avançant perquè no ha trobat les seves ter.
Continua copiant i arriba a la ter on està unida la proteïna tus però com no està direccionada correctament la supera, i com la supera tens dues còpies d’aquesta regió ter. És a dir, la que queda replicant supera el punt on s’havia parat l’altre, i aquest replisoma agafa les dues cadenes velles.
Ara, aquestes ja estan en cromosomes diferents perquè aquesta part havia estat replicada pel replisoma que s’ha aturat primer. Per tant, tenim l’helicasa i la girasa amb les dues cadenes velles; quan arriben a la proteïna TUS, tenim una vella i una nova per una banda, i una vella i una nova per una altra banda. La topoisomerasa gira i les dues velles que té les torna a ajuntar, de manera que les dues noves es queden soles i, com són complementàries entre elles, s’enganxen! No són un cercle, estan sueltas però com les seves progenitores eren complement elles també ho són.
Això fa que es creï un creuament. Com separem llavors els cromosomes? 2. La cèl·lula veu que hi ha tres regions homòlogues, de manera que du a terme un procés de recombinació homòloga – la proteïna RecA (recombinasa principal) se n’adona, detecta regions d’homologia, i fa un corta pega i ho arregla (veu que això i això és igual, intercanvia les cadenes i les enganxa i lo que sobra ho elimina).
És a dir, que un cop les velles estan amb les velles i les noves amb les noves, ve la proteïna RecA i diu ie no esteu ben col·locades, i les recombina. Mira la seqüència i, on hauria de continuar, ho empalma eliminant el que sobra.
Depèn d’on actuï, les enganxarà més aviat o més tard. Al final el que tenim és un cromosoma sense res duplicat.
3. Però un cop restaurat això (hem agafat les dues noves, hem enganxat una nova amb una nova i una nova amb una vella), entre els dos cromosomes que s’estan generant hi ha un crossing!, cosa que comporta un pollo perquè tenim els dos cromosomes enllaçats per una de les cadenes perquè les hem creuat. Aquesta estructura d’encreuament rep el nom d’estructura de Holliday.
D’alguna manera hem de separar l’encreuament per tenir els 2 cromosomes.
21 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 1 Com es desfà l’estructura de Holiday? Els dímers de cromosomes es resolen gràcies a l’acció de les resolvases XerCD que, a través de processos de recombinació específica en la regió dif durant el procés de citokinesis, resolen l’estructura.
Holliday junction: intermediari de DNA on dues cadenes de doble cadena estan connectades per cadenes de DNA creuades.
Invasió de cadenes d’una còpia de DNA a l’altra. Una cadena ha anat cap a baix i l’altre cap a dalt. El canvi de color és on el Rec A ha fet el corta pega.
Branch migration: la unió de Holliday migra des del lloc originat, formant-se regions d’heterodúplex (amb possibles desaparellaments). L’estructura es pot moure – si la desplacem com veiem en la següent figura, segueix sent complementari.
Per tant, Holiday pot avançar però segueix estant encadenat perquè és un cercle i està tancat.
En aquesta imatge, la primera estructura és difícil de trencar. Però la de baix és més propensa a que els enzims la trenquin per on es torcen (els és fàcil accedir), de manera que es restableixen els enllaços fosfodièster i acabes tallant o por 1 o por 2.
És a dir, els enzims entren i tallen les cadenes, tornant-les a ajuntar després.
Els enzims que fan això són les resolvases. D’aquests n’hi ha diferents tipus.
A alguns els hi és igual on es produeixi aquest encreuament, però sempre que passa en la replicació, l’encarregada és XerDC. Aquesta proteïna té dues subunitats (XerD i XerC). Només actua sobre una regió molt concreta del DNA, molt a prop de la regió de terminació de la replicació.
XerDC funcionen com dues resolvases que actuen juntes. S’anomenen dif les regions on la XerDC actua. L’estructura de Holiday es mou fins a aquestes regions perquè puguin actuar aquestes resolvases.
22 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 1 El que acabes tenint són les cadenes separades com veiem en la imatge següent on hem ja rotat les cadenes per facilitar la visió de la Holliday junction.
- Tall en el primer lloc (1st site) dona lloc a productes recombinats o creuats.
Tall en el segon lloc (2nd site) no dona lloc a productes recombinats.
Si es talla pel primer lloc, els productes són recombinats o creuats, i no interessen. Només se separen bé els dos cromosomes si es talla pel segon lloc.
23 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 1 FASE D – DIVISIÓ CEL·LULAR Les resolvases interaccionen amb una proteïna que rep el nom de FtsK. Aquesta és una proteïna que forma part del septe/anell que tanca i separa les dues cèl·lules (totes les proteïnes de la família Fts fan això). Les resolvases XerD i XerC estan associades a la proteïna majoritària del septe, la K; això vol dir que, mentre es dóna la replicació, els orígens de replicació es van separant cap als pols, i al centre queda el punt d’intercanvi on s’ha de donar la recombinació i separació dels dos cromosomes i també queden XerD i XerC que interaccionen amb FtsK que forma part del septe de la cèl·lula que ve a separar-ho.
Figura – Formació del cromosoma dimèric i la seva resolución cap a la divisió cel·lular.
A.
B.
Un cromosoma parcialment replicat conté dues cèl·lules filles naixents, dues forquilles de replicació i una regió terminal encara no replicada. Hi ha hagut recombinació a prop d’una forqueta de replicació.
Quan la replicació es completa es produeix un dímer circular amb dos complexos dif/XerC/D. Tant la divisió cel·lular com el domini citoplasmàtic de la proteïna FtsK són requerides per la resolució cap a monòmers.
Les línies ratllades representen l’embolcall cel·lular.
El septe de la cèl·lula es produeix per un conjunt de proteïnes Fts que el que fan és polimeritzar les unes amb les altres i fan un septe que es va estrenyent fins la divisió de la cèl·lula.
Quan el septe va estrenyent la cèl·lula, va corrent l’estructura Holiday i també se situa al centre. Ta to pensao! A part del creuament entre les cadenes filles, el que també pot passar en la replicació és que els dos cromosomes s‘hagin quedat entrecreuats entre ells (anellats). Es diu que apareixen concatèmers de cromosomes. Això ho soluciona la topoisomerasa de tipus II – tallen les cadenes. En E. coli és la tipus IV. Això es produeix perquè mentre es replica, el nucleoide continua compactat. El replisoma va descompactant el que ha de replicar i compactant el que ja ha replicat. Així, es van generant dos nucleoides separats.
És a dir, el nucleoide no es desempaqueta – el cromosoma bacterià no és tan xaxi com a les fotos, està compactat. Per tant quan el replisoma avança i replica, el que replica ho compacta, i va descompactant la regió intermèdia de manera que no podem permetre’ns desempaquetarho tot de cop. Si en una zona no està passant res, no es trobarà desempaquetada. Les NAPs ajuden a posicionar els nous nucleoides.
24 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 1 FORMACIÓ DEL SEPTE – Hi ha vàries teories - - - El septe es produeix per l’acumulació de moltes proteïnes Fts(lletra aleatòria).
Aquestes proteïnes polimeritzen i generen un septe que es va estrenyent, i al final separa la cèl·lula en dues. Les proteïnes del septe tenen molta afinitat entre elles, però llavors perquè no es forma el septe sempre? Perquè les proteïnes del septe normalment no tenen lloc per generar el septe a causa del molecular crowding. El que fan és pulular per la cèl·lula (algunes teories diuen que són com una molla, polimeritzen a un cantó i en un punt trenquen la polimerització i se van al otro lao). El septe s’ha de posar al mig de la cèl·lula. Però es creu que en una cèl·lula que encara no s’està dividint, es va muntant i es va desmuntant i tal i així van mesurant com de gran és la cèl·lula, i fins que no és prou llarga no es forma del tot el septe.
Una altra teoria és la dels inhibidiors. Es creu que hi ha inhibidors del septe. Per tant, per molt que tinguis proteïnes per fer el septe, els inhibidors ho eviten. A mesura que es va fent gran la cèl·lula, la concentració d’inhibidor disminueix (el color verd no és tan verd) i llavors el septe es munta, avança i es tanca.
Hi ha gent que diu que és la presència dels nucleoides qui ho dicta, que quan el nucleoide està al mig no deixa muntar el septe.
La formació del septe depèn de l’oclusió que genera el nucleoide.
Septació en E. coli 25 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 1 PAPER DEL CITOESQUELET Els nucleoides, en una soca normal es van movent, es centren i fan el septe. Però en soques mutants on t’has carregat gens que codifiquen per proteïnes del citoesquelet (NAPs associades al nucleoide com ara el gen muk que codifica per proteïnes Muk) el que passa és que el nucleoide es desubica. Al principi tot normal, però quan divideixes el nucleoide no se centra i tens cèl·lules que semblen fantasmes de citoplasma i cèl·lules amb 2 nucleoides. Per tant, la formació del septe depèn de l’oclusió que genera el nucleoide, i sabem que hi ha NAPs associades al citoesquelet.
En resum, el septe es col·loca on pot i el nucleoide es mou a través del citoesquelet.
26 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 1 SEPTACIÓ Partició del cromosoma en la cadena de E. coli en una soca normal i en una mutant en muk que és deficient en el posicionament dels cromosomes en les cèl·lules filles.
REPLICACIÓ DE CROMOSOMES AMB HAIRPIN TELOMERE 27 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 1 REPLICACIO DE CROMOSOMES LINIALS AMB INVERTRON TELOMERE La DNA-polimerasa III no necessita primosoma (són els únics cromosomes que no necessiten encebador). El primer nucleòtid de la cadena necessari per replicar (adenina) l’aporta la proteïna que fa de tap al telòmer. Es copien les dues cadenes de cop i no hi ha fragments d’Okazaki.
Tenim una proteïna bola que protegeix l’extrem. La negra està allà, ve la groga, es col·loca quan comença la replicació i té una adenina i ve la topoisomerasa i allarga la cadena i acabes tenint dos cromosomes amb una proteïna antiga i una proteïna nova. Aquí nomes es polimeritza en una sola direcció. Ni trombó ni Okazaki ni hòsties.
TOTAL.
Que la proteïna que està associada als extrems porta un nucleòtid (A) que fa de encebador. La proteïna terminal sempre estarà unida.
28 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 1 CICLE CEL·LULAR La única proteïna implicada en E. Coli en l’inici depèn de l’estat metabòlic. Per tant la fase I depèn del cultiu, de l’entorn.
La fase C i D, un cop s’ha acumulat prou DnaA, duren més o menys el mateix.
El fet de produir i tancar el septe també és bastant constant. Per tant, una cèl·lula dura uns 1h20 per fer tot un cicle cel·lular.
Distingim medis perquè l’inici està marcat per la quantitat de proteïna DnaA. Per tant en medi ric serà molt més heavy que en medi mínim.
29 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 1 CICLE CEL·LULAR BACTERIÀ Quan acaba la fase I, en veritat ja estàs acumulant proteïnes per una altra replicació. Això el que pot fer és que tinguis cèl·lules en les quals no és que hi hagi un cromosoma, sinó que les filles rebin un cromosoma i mig perquè s’està fent ja una altra replicació.
TEMPS DE GENERACIÓ (τ) 60 min Les cèl·lules acumulen tant DnaA perquè el temps de la fase I coincideixi amb el temps τ o de cultiu bacterià, C i D vamos, que duren 60 min. Això permet que quan la cèl·lula es divideixi, cada cèl·lula filla tingui un cromosoma.
30 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 1 TEMPS DE GENERACIÓ (τ) 30 min Aquí quan la fase C acaba, ja has començat una segona iniciació de cromosoma, la cèl·lula està dividint el cromosoma i ja comences a dividir un altre. Quan arribes al final de C1 l’altre cromosoma encara no ha acabat així que tindràs cromosoma i 1/3 part de l’altre cromosoma a les cèl·lules filles. I tindràs una cosa semblant a: 31 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 1 TEMPS DE GENERACIÓ (τ) 20 min 29/09/14 En la fase I es dóna l’acumulació de DnaA. En la fase C s’inicia la replicació, però ja estem acumulant DnaA un altre cop.
Llavors, en aquest temps de generació, quants cromosomes tindrem per cèl·lula un cop s'ha dividit? Biològicament, és impossible per una cèl·lula tenir 3 o 5 còpies d'un cromosoma, perquè d’un passa a dos, de dos a quatre i així successivament.
* El que passa és que, just després de la 1a divisió, tindríem a cada cèl·lula filla 2 cromosomes sencers i 2 mitges parts de cadascun d’aquests dos cromosomes que han iniciat la replicació i tenim per tant mig copiat.
Si en algun moment d’aquest cicle la concentració de DnaA disminueix, llavors la fase I s’allargarà, però no ho farà C, de manera que les cèl·lules filles de la primera divisió després de que passi això tindran una quantitat de cromosomes menor.
Amb més còpies de cromosoma hi ha més dosi gènica, i aquesta és més gran per uns gens que per uns altres. Això passa perquè certes proteïnes seran més necessàries en més quantitat pel medi on viuen.
Això té una implicació en la cèl·lula – tots aquells gens a prop de l’origen de replicació produeixen més dosi gènica. En aquest cas? Cada cèl·lula filla té 4 còpies d’un gen prop de l’OriC i 2 còpies dels que estan més lluny – tindrem els gens propers representats en cada una de les cèl·lules filles, però si no estan a prop, en tindrem dos. Per tant, el número de còpies real dels gens en l’interior de la cèl·lula és diferent, perquè si una cèl·lula té un cromosoma, tenim un gen de cada. Si són gens dins la regió dels 3/4 tindrem 2 còpies, però de lo que està dins el 1/4 en tindrem només una! Evolutivament, s'ha anat determinant la posició dels gens respecte l’origen en funció de la importància de cada gen. Per exemple, els gens ribosomals són gens que s’usen molt quan la cèl·lula està metabòlicament activa (es necessiten molts ribosomes que tradueixin molt). En la majora de microorganismes, aquests gens estan a prop de l’origen de replicació, perquè quan estiguis creixent lent tinguis X còpies d’allò, però quan et repliquis molt, perquè les condicions són favorables, tinguis 4 X d’allò (incrementes la dosi gènica).
32 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 1 Per tant, la ubicació en procariotes és un 1r nivell de control de l’expressió gènica – en funció d’on estàs ubicat, tens alguna cosa que et pot fer canviar en funció de les condicions de cultiu on creixes.
El canvi de dosi gènica permet que el que hagi de passar en 80 min passi en 20 – quan tornin a passar 20min, els cromosomes mitjos ja s’hauran replicat, i en 20 min s’hauran acabat i es tornaran a obrir els orígens de replicació.
Si tornem a tenir condicions en què dnaA no s’acumula tan ràpid, es tornen a allargar les fases d’inici i tornem a tenir menys quantitat de DNA.
Però no per el temps d’elongació, sinó per l’acumulació de proteïna.
Quines conseqüències té el cicle cel·lular bacterià? I la proximitat dels gens a l’OriC? La distància dels gens respecte l’OriC no només determina la producció gènica, sinó que també incrementa les possibilitats per aquelles regions més properes de patir recombinacions i reordenacions. A més, tenir més còpies pot ajudar en processos de reparació cel·lular.
33 ...