Tema 14 Modelos de estudio (2015)

Apunte Español
Universidad Universidad de Lleida (UdL)
Grado Ciencias Biomédicas - 2º curso
Asignatura Patología celular y molecular
Año del apunte 2015
Páginas 12
Fecha de subida 03/05/2016
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2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV PATOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR TEMA 14. Modelos de estudio es patología celular y molecular En cada nivel (sistema, órgano, tejido, célula, …) pueden buscarse alteraciones responsables del desarrollo de una patología.
Para estudiar patología celular y molecular, los principales modelos de estudio en investigación son: - Modelos in vitro: cultivos celulares.
- Modelos in vivo: organismos modelo. Se emplean virus, bacterias o levaduras, insectos, anfibios, peces, mamíferos y plantas.
MODELOS "IN VITRO" - CULTIVOS CELULARES Primarios: establecidos a partir de un tejido u órgano de un organismo, que puede ser una persona o un animal de investigación.
Líneas celulares: son cultivos ya establecidos de un determinado tipo celular. Se habla de líneas celulares sobre todo de células tumorales que pueden conservarse indefinidamente.
A partir de un cultivo primario pueden establecerse líneas celulares que se conservan en el tiempo (las células pueden adquirir alteraciones).
Hay diferentes metodologías a la hora de elaboras cultivos celulares: Cultivos en suspensión - se habla de cultivos en suspensión cuando las células se encuentran "flotando". Por ejemplo, un cultivo de linfocitos que no son células adherentes.
Cultivos adherentes Además, existen diferentes técnicas de cultivo: Cultivos en dos dimensiones - se hacen crecer las células en monocapa. Se emplea esta técnica sobre todo para cultivos de células adherentes.
Cultivos en tres dimensiones: se intentan poner unas condiciones de cultivo adecuadas para que las células adquieran una conformación tridimensional similar a la que tienen en el órgano del que son modelos y puedan mimetizarse con él.
A la hora de comenzar a trabajar con cultivos celulares, debe encontrarse el modelo celular adecuado. Es decir, deben emplearse líneas celulares o cultivos de las células que quieren estudiarse. Hay casas comerciales que venden líneas celulares - debemos buscar aquella que sea un buen modelo de la patología que queremos estudiar.
1 Patología molecular y celular EJEMPLOS DE USO DE CULTIVOS CELULARES  Estudio de los mecanismos de la inducción de la muerte apoptótica en células tumorales.
 Enfermedades neurodegenerativas Por ejemplo, cultivo celular primario de ganglios simpáticos de ratón que permita estudiar los factores requeridos por las células para mantenerse vivas. La siguiente imagen en de un estudio de las vías de señalización en muerte neuronal asociada a las enfermedades neurodegenerativas en cultivos primarios de neuronas.
2 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV  Uso de cultivos tridimensionales para estudios de alteraciones en la polaridad celular.
Se ponen las células en condiciones que permitan que adquieran conformaciones en 3D similares al órgano o estructura que se quiere estudiar. Por ejemplo, en forma de glándulas del endometrio para poder estudiar cambios en la morfología y función celular - las células pierden la polaridad cuando se las trata con corticoides. Los cultivos en 3D nos permiten acercarnos más a la realidad.
MODELOS "IN VIVO" - ORGANISMOS MODELO Los modelos animales son muy útiles para la investigación traslacional, ya que permiten aplicar la investigación básica a la mejora de la clínica.
Los organismos modelo pueden dar una pista de lo que ocurre en las patologías humanas  podemos llegar a entenderlas y encontrar posibles tratamientos aplicables a humanos.
Hay diferentes modelos animales. Lo más importante a la hora de elegir un modelo, es saber qué queremos estudiar. Por ejemplo, para estudiar control del ciclo celular, es más fácil emplear organismos más sencillos, como las levaduras. Pero para estudiar cómo la desregulación del ciclo celular puede provocar un cáncer, es necesario un organismo más complejo, como el ratón.
Las líneas y cultivos celulares son adecuados para el estudio de mecanismos moleculares y celulares.
Cuando interesa observar la relación entre células, ya es necesario estudiarlo in vivo.
3 Patología molecular y celular De un organismo modelo esperamos FIDELIDAD GEN MUTADO  PROTEÍNA ALTERADA  FENOTIPO (PATOLÓGICO) Buscamos que el gen ortólogo en el modelo sea el mismo mutado en la patología humana, que dé una proteína similar, sobre todo en función, a la proteína humana y que la patología sea similar a la humana. Es decir, el organismo modelo debe servir para reproducir la patología.
La conservación filogenética ayuda a encontrar un modelo fiel, ya que las secuencias y los genes más importantes están muy conservados en la evolución. Esto nos permite emplear organismos inferiores como modelo, más fáciles de manipular.
4 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Por ejemplo, el gen eyeless de la mosca es homólogo del gen Pax6 de humanos, lo que convierte a la mosca en un buen modelo  las mutaciones en ambos genes homólogos provocan efectos similares en el organismo.
Ocurre algo similar con el ratón y el pez cebra (zebrafish), que también constituyen buenos modelos para las patologías del ojo.
 El organismo modelo por excelencia es el ratón.
DISEÑOS EXPERIMENTALES CON ANIMALES Existen básicamente dos grandes estrategias: - Estrategia guiada por genes La enfermedad humana es causada por una mutación conocida y se quieren estudiar los mecanismos de patogénesis. Para ello, se provoca dicha mutación en el ratón. Mediante esta estrategia pueden estudiarse, por ejemplo, terapias para las patologías.
5 Patología molecular y celular - Estrategia guiada por el fenotipo/sintomatología Esta estrategia se emplea cuando el investigador se encuentra ante una patología de causa desconocida o multifactorial. Se buscan animales con síntomas o manifestaciones fenotípicas similares a las que se presentan en la patología humana. Así, pueden probarse tratamientos o bien buscarse las alteraciones o mecanismos que subyacen a la patología.
MUTAGÉNESIS EN EL ANIMAL GENERACIÓN DE MODELOS DE ESTUDIO DE PATOLOGÍA POR FENOTIPO Se intentan generar patologías por mutagénesis no dirigida. Suele usarse el agente mutágeno ENU, que provoca transversiones. Se trata de un agente alquilante que tiene preferencia por las transversiones T-A. Este mutágeno induce mutaciones puntuales (al azar) que pueden ser de pérdida o de ganancia de función - como induce mutaciones puntuales, el investigador puede identificar un único gen candidato responsable del fenotipo. Las mutaciones puntuales se dan aproximadamente en intervalos de 1/2Mb y se producen con una frecuencia aproximada de una mutación por cada 700 gametos (ENU actúa sobre células madre de espermatogonias).
Después, se realiza el fenotipaje del animal, para lo que se realizan: estudios de comportamiento, análisis fisiológicos, análisis bioquímicos y análisis fenotípicos. Se buscan fenotipos anormales y se intentan buscar fenotipos homólogos.
Cuando se obtiene un organismo mutado que presenta un fenotipo similar al de una patología humana, se busca dónde han caído las mutaciones  se analiza el genotipo . Así se intenta buscar cuál es el gen que causa la patología en los humanos.
6 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV GENERACIÓN DE MODELOS DE ESTUDIO DIRIGIDA POR GENES Se modifica un gen o un conjunto de genes concreto para crear un modelo para una patología  mutagénesis dirigida.
Esta estrategia es la que se emplea cuando se conoce cuál es el gen mutado causante de la enfermedad en los humanos. A menudo se conoce cuál es el gen pero no se conoce cuál es su función en la célula - nos "cargamos" la proteína para la que dicho gen codifica en el organismo modelo para saber en qué está implicada.
La mutagénesis dirigida puede realizarse a través de "Gene traps" - creación de animales knock in y knock out, o a través de tRNA -animales knock down.
GENE TRAPS Permiten identificar proteínas con una determinada función.
Se introduce dentro de un animal mediante transgénesis una construcción con un gen reportero (por ejemplo, lac Z, que da color azul). Este gen se flanquea con una secuencia aceptora de splicing y una secuencia de poliadenilación (para acabar transcripción). Cuando el vector lac Z (o el gen que hayamos elegido como reportero) se integra en el genoma, se genera una proteína híbrida entre la proteína endógena y lac Z. Es decir, el gen reportero se transcribe conjuntamente con el gen de la proteína endógena  proteína de fusión.
La secuencia de acepción se splicing que se añade al gen reportero es para que éste sea interpretado como exón. Así se consigue mutar la proteína y saber cuándo se expresa.
Por tanto, los gene traps nos permiten realizar una mutagénesis no dirigida  el gen reportero se integra donde puede.
GENE TARGETING Esta técnica se emplea en la generación de animales knock out e implica disrupcionar un gen endógeno mediante la recombinación homóloga.
Los animales knock in y knock out son aquellos que han sufrido una mutación puntual.
Se construye un targeting vector - un plásmido en el que hemos puesto una región de homología a la región que queremos mutar, una región neo (resistencia al antibiótico neomicina) y un 2º brazo de homología.
7 Patología molecular y celular Se coloca dicho plásmido en células madre embrionarias, dentro de las cuales se producirá recombinación homóloga entre el gen del targeting vector y el gen endógeno.
Para generar un modelo de patología causada por mutación puntual, se introduce un targeting vector con una mutación.
Las células en las que ha habido recombinación se seleccionan gracias al antibiótico neomicina.
8 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV RNAi - KNOCK DOWN Para crear un ratón knock down basta con poner en el animal una construcción que expresa un shRNA que degrade un RNA determinado que codifica para una proteína concreta.
*Los shRNA reconocen y degradan mRNA concretos.
Esta construcción se inyecta en el genoma del ratón, en las células madre embrionarias. Así, se consigue que disminuya la expresión de la proteína.
Suele añadirse EGFP en la construcción para identificar cuándo se ha incorporado la construcción a la célula.
También, como marcador de selección, se añade un gen de resistencia a la neomicina  las células que incorporan este plásmido sobreviven al tratamiento con el antibiótico.
La construcción entra en el genoma por integración al azar. Como no todas las regiones genómicas son igual de activas transcripcionalmente, no se expresará igual en todos los casos (por ejemplo, si se integra en la heterocromatina no se expresará).
9 Patología molecular y celular Lo primero que hay que hacer cuando se quiere estudiar una patología humana con un modelo animal es buscar si hay modelos hechos para dicha patología. Existen modelos ya hechos de muchas enfermedades y bases de datos donde poder encontrarlos - MGI o MMRC.
10 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Es necesario tener en cuenta las limitaciones que presentan los modelos animales. Por ejemplo, es posible trabajar con ratones y Alzheimer, pero estos ratones no forman placa y no tienen el mismo genotipo. Por eso, muchas veces es más apropiado llevar a cabo los estudios en muestras clínicas en lugar de usar modelos animales. Podemos encontrar estas muestras en los biobancos.
BIOBANCOS Como ya hemos dicho, en los biobancos se encuentran muestras clínicas de personas afectadas por una patología. Los biobancos recopilan las muestras biológicas y los datos clínicos. Podemos encontrar diversos tipos de muestra: DNA, RNA, proteínas, miRNA, … En los biobancos deben tenerse en cuenta las condiciones de almacenaje de cada tipo de muestra. Por ejemplo, las líneas celulares deben conservarse en nitrógeno líquido; las muestras de DNA y RNA deben congelarse y preservarse a -80oC; los trozos de tejido deben de ir muestras parafinadas.
11 Patología molecular y celular Para poder conservar una muestra clínica de un paciente en un biobanco, el paciente debe haber firmado un consentimiento informado.
PROBLEMAS DE LOS BIOBANCOS 12 ...