Tema 10 - Transformació (2014)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Genética - 2º curso
Asignatura Biologia Molecular Procariotes
Año del apunte 2014
Páginas 8
Fecha de subida 26/12/2014
Descargas 15
Subido por

Vista previa del texto

BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 TEMA 10 – Transformacio TRANSFORMACIÓ BACTERIANA 17/12/14 La transferència gènica en bacteris pot donar-se de diferents maneres: La transformació és un sistema important per permetre desenvolupar sistemes de manipulació genètica en microorganismes.
En la transformació, en tenim dos tipus: la natural, que inclou les cèl·lules capaces d’introduir DNA exogen com en l’experiment de Griffith; i la induïda, que inclou la desestabilització de l’envolta cel·lular i la formació de protoplasts per xoc tèrmic, per electroporació, CaCl2...
TRANSFORMACIÓ NATURAL Recordem que Griffith no sabia que passava, només veia que les característiques d’una soca morta podien passar a una que estava viva. A més de confirmar que el DNA era el principi transformant, això confirmava també que eren capaços d’incorporar coses de l’exterior.
107 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 Existeixen molts bacteris capaços d’incorporar activament DNA de l’exterior, tant grampositius com gramnegatius. Parlem de forma activa ja que el punt clau és que es permet l’entrada a través de la paret cel·lular, hi ha sensors a la paret que capten DNA “conscientment”.
Com funciona? Tenim DNA lliure al medi provinent de la mort i lisi d’un bacteri donador. En la imatge, el DNA blau de doble cadena és reconegut per uns mecanismes (transportadors de paret) que ancoren aquest DNA. Aquest DNA extern és de doble cadena, però quan entri en la cèl·lula receptora ho farà en forma de cadena senzilla. Això és perquè el sistema de transport reconeix el DNA i el transloca utilitzant l’energia que li proporciona el trencament dels enllaços fosfodièster de la cadena que es degrada.
Hi ha microorganismes, sobretot els gram+, que no seleccionen específicament quin DNA incorporen en el seu interior. Aquestes tenen uns mecanismes de transport que simplement detecten i capten dsDNA i incorporen una cadena. En canvi els gram- detecten una seqüència concreta de dsDNA i un cop detectada iniciaran la translocació del DNA.
ESTAT DE COMPETÈNCIA En cap d’ells la cèl·lula està receptiva a incorporar DNA al seu interior. És a dir, muntar l’estructura de paret que permet l’entrada de DNA requereix de molta energia, i per tant els sistemes de transport no s’expressen de forma constitutiva. Qui ho controla? No se sap (condicions ambientals – variant condicions de cultiu, podem induir la competència).
La competència és un estat fisiològic característic per cada espècie influenciat per diferents paràmetres com ara la densitat del cultiu (fase de creixement), la temperatura, pH, la font de carboni. L’estat de competència varia en cada microorganisme, cadascun expressarà la maquinaria en el seu moment òptim que serà diferent dels demés.
108 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 Sistema de transport en els gram+: tenim unes bolitas que degraden una cadena a l’atzar i integren l’altre. Quan hi ha ssDNA en una cèl·lula, s’activa RecA, ja que reconeix, nucleofilamenta al voltant del DNA i intenta que hi hagi recombinació homòloga. Per tant, si aquest DNA que entra té homologia amb el DNA de la cèl·lula receptora, es podrà introduir el DNA exogen a l’interior de la cèl·lula per doble recombinació, i diem doble perquè el DNA que entra és lineal. Si féssim un intercanvi simple deixaríem obert el cromosoma bacterià i la cèl·lula moriria. Per tant es vehicula una doble recombinació per incorporar el DNA en les regions on hi ha homologia.
Però la majoria de vegades el DNA que entra serà degradat. Aquesta recombinació només es podrà donar en els casos que hi hagi homologia.
109 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 Sistema de transport en els gram-: La seqüència concreta que detecten els gram- acostuma a ser curta. Aquestes seqüències es troben en major quantitat al genoma de bacteris del què s’esperaria tenint en compte la combinatòria de les seves bases. És a dir, per estadístics (SD) hauríem de trobar unes 500 vegades una seqüència en concret (la primera en la taula), però en la realitat pareix 1471. Per tant el bacteri està seleccionant que aquesta seqüència es repeteixi en el seu cromosoma. A més, la repetició d’aquestes seqüències és més o menys equidistant – cada 800pb aproximadament et vas trobant aquesta seqüència. Per tant s’ha seleccionat que aquest microorganisme tingui el DNA marcat cada x pb. Aquesta seqüència serà la que determinarà si introduirà o no el DNA exogen.
Per exemple, H. Influenzae només introduirà DNA que contingui la seqüència AAGTGCGGT.
PROCÉS DE TRANSFORMACIÓ Sobretot en gram-, el DNA és reconegut pels pilis. La cèl·lula té una estructura de pili que surt a l’exterior, detecta el DNA i comença a translocar-lo. Tindríem moltes proteïnes associades a la membrana interna, algunes associades a més a la membrana externa. Aquests pilis poden ser més o menys llargs. L’entrada del DNA es fa via proteïnes periplasmàtiques que permeten la seva entrada al citoplasma.
110 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 SIGNIFICAT BIOLÒGIC DE LA TRANSFORMACIÓ NATURAL Hi ha dues vessants de la interpretació de la transformació natural. Hi ha gent que diu que no és més que un sistema de nutrició per la cèl·lula, i que per casualitat es pot donar la recombinació, però sense ser més que processos casuals.
Altra gent que no creu que els sistemes de transformació s’usin com a nutrició es basen en que el balanç d’energia no és positiu, i que en el cas dels gram- sembla que la cèl·lula busqui un DNA similar al seu per recombinar (perquè busquen una seqüència en concret). També diuen que la presència de DNA exogen no és habitual (no és habitual que les cèl·lules es lisin), sinó que es dóna en situacions d’estrès o d’abundància de bacteriòfags o d’antibiòtics, etc. cosa que comporta que la concentració de RecA sigui molt elevada.
Per tant el DNA entrant és susceptible a ser recombinat, perquè la cèl·lula està receptiva, està necessitada de canvi. El DNA pot tenir el potencial de no morir tot i que mori; llavors quan les altres cèl·lules l’agafin tindran la mutació. És a dir, pot ser que una cèl·lula abans de morir ja hagi fet canvis que li haguessin permès sobreviure, però per ella ha estat massa tard i ha mort.
Però una cèl·lula que agafi aquest DNA, l’agafarà ja mutat.
El sistema restricció-modificació afecten el DNA que entra en una transformació natural ja que és un DNA de doble cadena. A més per molt que afectessin, aquest DNA que està entrant ve d’un bacteri germà amb el DNA igual de metilat.
TRANSFORMACIÓ INDUÏDA Sovint no es treballa en transformació natural, el més habitual és fer-ho amb transformació induïda. Generem un estat de competència en les cèl·lules, les fem competents. El que fem és obligar-les de forma artificial no a tenir una maquinària compatible, sinó a que siguin competents. Ho podem fer mitjançant diversos mètodes.
Quan introduïm DNA en una transformació induïda o artificial, el DNA que s’internalitzarà serà el que nosaltres decidim, tan pot ser dsDNA, ssDNA o circular. Si és DNA de doble cadena entra a l’interior de la cèl·lula s’activaran sistemes de restricció modificació, CRISPS etc.. Si és lineal, el que ha de passar perquè s’estabilitzi és que s’integri – necessitem homologia. Si és circular, el que ha de passar perquè s’estabilitzi de forma extracromosòmica és que tingui un origen de replicació per la seva transmissió vertical. Si és circular però no té origen de replicació, s’haurà d’integrar, tornarem a necessitar homologia. En aquest cas, es necessitarà únicament un element de recombinació (recombinació simple). Amb doble recombinació estaríem substituint un element del cromosoma pel DNA que estiguéssim entrant.
Totes aquestes cèl·lules modificades s’anomenen cèl·lules competents.
111 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 MÈTODES QUÍMICS CATIONS COVALENTS Els cations com el calci, el cobalt o altres cations divalents són capaços de generar alteracions a la paret – porus a través dels quals passarà el DNA. Les membranes acostumen a ser fluides, i si incorporem cations divalents (CaCl2) que les fan més rígides, es produeixen porus gràcies a contactes entre membrana externa i interna – el CaCl2 les fan que es puguin desestructurar més fàcilment.
PROCEDIMENTS HABITUALS PER OBTENIR CÈL·LULES COMPETENTS En el cas del CaCl2 – agafem un cultiu cel·lular i el tractem amb molt CaCl2 i a concentracions elevades. Ho deixem una estona, després eliminem el CaCl2 i deixem les cèl·lules que tenen el CaCl2 integrat en les seves parets en gel i glicerol (medis isotònics). I això és el que ens donen els profesoritos en els super eppendorfs.
El fet que les haguem tractat amb CaCl2 dóna rigidesa, ja que el calci s’adhereix a la membrana interna, cosa que dóna rigidesa a la interna. Això fa que la membrana externa quan es mou una mica toqui amb la interna i es generin porus, ja que les dues estan formades per lípids, i quan toquen es fusionen generant porus. Si ens passem molt adéu cèl·lula (pipetejar poc, no fer vòrtexs, perquè sinó els porus es fan més grans, les parets es trenquen i adéu). Llavors col·loquem el DNA en l’eppendorf i ho deixem una estona. El DNA té càrrega negativa, i el calci té càrrega positiva. Per tant, s’atrauen – el DNA s’adhereix a la superfície cel·lular i intenta contactar amb el calci ubicat a la membrana interna. Per tant comença a entrar pels foradets.
Però les parets són rígides i el DNA és un mamotreto. Llavors fem un xoc tèrmic a 42º per donar fluïdesa a la membrana (estaven en gel les cèl·lules). Encara que hi hagi calci adherit, ara la fluïdesa és molt major i el DNA ja pot entrar. Un cop translocat, ho tornem al gel 5 minuts i ho deixem cultivar perquè expressin fenotípicament les resistències i per reestructurar la deuda la paret. Si l’estructura incorporada és estable es mantindrà, si no es degradarà, etc.
Com més gran és el DNA que volem transformar, més difícil ho té per entrar. Contra més petit és el DNA, més alta és la freqüència de transformació.
112 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 OBTENCIÓ DE PROTOPLAST Obtenció de protoplasts en medis hipertònics. Un protoplast és una cèl·lula bacteriana que només té membrana citoplasmàtica (el peptidoglicà i la membrana externa en el cas dels gram-). S’ha de controlar molt el medi en el qual es treballa perquè pot explotar (lisi). No trenques la cèl·lula – s’ha de trencar només el peptidoglicà, o deixar-lo en la seva mínima expressió. En aquest cas, el DNA té afinitat per la paret i no s’està transformant per un sistema natural, per tant en forçar la incorporació del DNA, entrarà a la cèl·lula tot allò què tu l’hi posis.
ELECTROPORACIÓ S’estableix un camp elèctric on apliquem polsos elèctrics que generen els porus. Si tenim aigua amb pocs soluts, les cèl·lules es converteixen en conductores del corrent. En aplicar alts voltatges, obtenim permeabilitat – es generen porus a les parets cel·lulars a partir dels quals es pot translocar el DNA. Al cap d’una estona es reconstitueix la paret i es tanquen els porus.
Quant a l’electroporació, xoquem les cèl·lules amb voltatges molts alts. El xoc elèctric es fa dins unes cubetes d’electroporació amb dos parets que són elèctrodes metàl·lics i col·loques les cèl·lules al mig, que són poc conductores. Per obtenir les competents, es netegen al màxim les sals que hi ha a l’aigua per obtenir només aigua destil·lada i cèl·lules perquè aleshores serien elles qui conduirien el corrent elèctric a través dels dos pols. De fet amb una solució salina la tapa salta i fa POWA perquè surt una xispa que ho crema tot. Per tant necessitem que no hi hagi sals i siguin les cèl·lules qui transmetin el corrent elèctric perquè serà aquest fet que generarà els porus i permetrà la transformació.
113 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 PARÀMETRES QUE AFECTEN LA TRANSFORMACIÓ INDUÏDA - Mida. A més mida, més dificultat. Com a màxim poden tenir 15 Kb (a més de 15Kb l’eficiència baixa molt).
Puresa. Si tenim un DNA circular que no té talls (nicks) es manté molt bé. Si té discontinuïtats ràpidament les exonucleases se’l carreguen (extrems 5’ lliures).
Estat del plasmidi. Si intentes transformar un plasmidi desplegat és difícil, si està molt plegat es difícil, si està lax però fi va bé.
Estat de les cèl·lules. Han de ser viables Temps d’expressió fenotípica. Temps suficient perquè els gens que permeten la selecció s’expressin.
Catió utilitzat per estat de competència.
Diferents segons espècie.
114 ...