HH (2007)

Otro Portugués
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Bioquímica - 5º curso
Asignatura HH
Año del apunte 2007
Páginas 28
Fecha de subida 19/10/2014
Descargas 4
Subido por

Vista previa del texto

TEMA 9. DNA recombinant Bioquímica 1. PURIFICACIÓ D’ÀCIDS NUCLEICS Hi ha diferents mètodes de purificació d’àcids nucleics.
Desproteinització i precipitació Aquest mètode és més utilitzat en volums petits (mili-micro). Consta de les següents etapes: 1) Lisis 2) Centrifugació (per treure lípids o restos cel·lulars insolubles) 3) Alliberació del RNA De la centrifugació ens quedem amb una solució aquosa de DNA + proteïnes + RNA (sobre nedant). Cal que el DNA s’alliberi d’aquestes proteïnes i del RNA. Per a aquest procés utilitzarem una RNAasa (si el què volguéssim purificar fos RNA usaríem una DNAasa).
4) Desproteinització Ara només tenim DNA i proteïnes. Per treure les proteïnes es fa una extracció amb solvent orgànic (normalment amb fenol i/o cloroform; normalment els dos, ja que el fenol és més eficient extraient-se i el cloroform separa millor les bases). Posem un volum equivalent al solvent orgànic (DNA + proteïnes) i agitem bruscament, de manera que les proteïnes no solubles al entrar en contacte amb el solvent orgànic es desnaturalitzen exhibint la seva part hidrofòbica. Un cop passa això se centrifuga per separar les fases (la fase densa estarà al fons, en la interfase hi haurà les proteïnes desnaturalitzades i a dalt tindrem una fase aquosa, que és la què ens interessa).
Normalment aquest procés es fa mínim tres cops.
5) Precipitació La fase aquosa obtinguda és DNA en aigua. Per separar-lo cal un volum mínimament gran (mínim 200 microlitres), és a dir, necessitem que el DNA es trobi en un volum més gran del què vulguem. Ara caldrà precipitar-lo (sempre que estigui diluït el precipitarem). Per precipitar-lo cal canviar la solubilitat del DNA traient càrrega negativa: s’augmenta la concentració de sal (fa canviar la polaritat, ja que apantalla, de manera que disminueix la solubilitat; posant sal com NaCl que fan de contraió contra el fosfat (la càrrega positiva del sodi apantalla)) i canviant la constant dielèctrica del medi (propanol o isopropanol; afegint alcohol (com l’etanol) amb l’aigua fa augmentar els components polars). Tot això fa disminuir la solubilitat del DNA, de manera que si centrifuguem tindrem un petit residu, que serà el DNA que ens interessa (pellet). Obtindrem el pellet de DNA, que s’asseca i es re-suspèn en el volum de tampó que vulguem (per saber la puresa cal mirar l’absorbància: DNA = 50 micrograms per mil·lilitre).
1 TEMA 9. DNA recombinant Bioquímica Aquest procés es repeteix varis cops fins que tenim el DNA prou pur. Inconvenients d’aquest mètode: el fenol és tòxic. Les traces de fenol / cloroform inhibeixen processos posteriors.
Electroforesis Un altre possible mètode de purificació és fent una electroforesis en gel de poliacrilamida o en gel d’agarosa. L’electroforesi és un mètode analític (per a petita escala) i és un mètode de separació per mida.
Les separacions per electroforesis es realitzen casi sempre amb gels ( o sobre suports sòlids com el paper), en lloc de dissolucions lliures, per dues raons principals. La primera, els gels suprimeixen els corrents de convecció produïts per petits gradients de temperatura, fet que és un requeriment per a una separació més efectiva. Segon, ells gels serveixen de tamisos moleculars que potencien la separació. Les molècules més petites que els porus de gel es desplacen fàcilment a través del gel, mentre que les molècules molt majors que els porus del gel romanen casi immòbils. Les molècules de mides intermèdies es desplacen a través del gel amb diversos graus de dificultat. Els gels de poliacrilamida són els suports d’elecció per a l’electroforesi, perquè són químicament inerts i es formen amb facilitat mitjançant polimerització de l’acrilamida. A més a més, escollint diferents concentracions d’acrilamida i metilenbisacrilamida (un reactiu que estableix enllaços creuats) i variant els temps de polimerització es poden aconseguir mides de porus controlades.
L’electroforesi en gel d’agarosa és de les més utilitzades per a analitzar i caracteritzar àcids nucleics de diferents procedències. Els gels es comporten com un tamís molecular i permeten separar molècules carregades en funció de la seva forma i mida. Així, molècules de DNA de diferent mida migraran de diferents maneres en una electroforesi d’aquest tipus. A més a més, si a dita electroforesi s’hi aplica marcadors de pes molecular (fragments de DNA de mida coneguda) es pot calcular la mida aproximada del DNA en estudi.
S’utilitzen gels de poliacrilamida per a separar fragments de fins a uns mil parells de bases i gels més porosos, d’agarosa, per a resoldre mescles de fragments 2 TEMA 9. DNA recombinant Bioquímica majors (de fins a 20Kb). Una característica important d’aquests gels és el seu elevat poder de resolució. En certs tipus de gels, es poden diferenciar fragments que difereixen en longitud per un sol nucleòtid, encara que la seva longitud total sigui de centenars de nucleòtids. A més a més, actualment poden separar-se en gels d’agarosa cromosomes sencers, que contenen milions de nucleòtids, aplicant camps elèctrics polsats en diferents direccions.
*En molts tipus de gels la mobilitat electroforètica d’un fragment de DNA és inversament proporcional al logaritme del número de parells de bases, dins d’un cert límit.
Tècniques cromatogràfiques Les tècniques cromatogràfiques són emprades a gran escala. Una tècnica molt utilitzada és la cromatografia en hidroxiapatita, que permet separar una cadena senzilla d’una doble, ja que presenta diferent afinitat pel DNA de cadena senzilla i pel de doble cadena. En el gràfic observem que el DNA de cadena senzilla sortirà primer (observem també una recta que representa el gradient de fòsfor).
Ultracentrifugació (gradients de densitat en CsCl o CsHSO4) S’utilitza per a separar DNA altament repetitiu i separa el DNA segons el contingut de CitosinaGuanina (també pot separar DNA de cadena senzilla i de doble). Aquest mètode s’utilitza, al igual que la cromatografia, en gran escala.
3 TEMA 9. DNA recombinant Bioquímica El què es fa és barrejar el DNA amb CsCl (o si fos RNA amb CsHSO4) i separar-lo segons la densitat de flotació, és a dir, la densitat del gradient (les bandes amb més CG tenen més densitat, mentre que les que tenen poc contingut de CG tindran menys densitat (ex. DNA satèl·lit)).
Mètode amb agents cautròpics: cromatografia de sílice És el mètode de purificació més utilitzat actualment i consisteix en fer passar el DNA per columnes pre-empaquetades amb una matriu de sílice, on podrem unir-hi el nostre àcid nucleic.
Amb aquest mètode, l’àcid nucleic surt més net i no inhibim la reacció.
4 TEMA 9. DNA recombinant Bioquímica De normal, el sílice i el DNA no s’unirien, ja que la matriu de sílice té una capa hidratant i el DNA també. Però si afegeixo una sal cautròpica (sal desestabilitzant) segrestarà H2O, és a dir, traurà la capa hidratant del sílice i del DNA permetent que aquests facin enllaços d’hidrogen entre ells (només serà capaç de fer enllaços d’hidrogen amb el sílice el DNA, les proteïnes s’eluiran per la columna al aplicar tampó). Un cop eluït, per recuperar el DNA ja purificat cal tornar a passar H2O (disminuirà les forces iòniques), de manera que el DNA tornarà a recuperar la capa hidratant i s’eluirà, obtenint DNA en una solució aquosa (si vols separar-lo caldrà tornar a precipitar).
Aquest mètode és vàlid tant per DNA com per RNA.
5 TEMA 9. DNA recombinant Bioquímica 2. SEQÜENCIACIÓ DE DNA DNA polimerases Les DNA polimerases intervenen en la replicació de DNA per a donar a cada cèl·lula filla una còpia del DNA original en el procés de la mitosis. Porten a terme la síntesis de la nova cadena de DNA aparellant els desoxiribonucleòtids trifosfat (dNTP) amb els desoxiribonucleòtids complementaris corresponents del DNA motlle. Els dNTP utilitzats en la replicació de DNA contenen tres fosfats units al grup hidroxil 5’ de la desoxiribosa i depenent de la base nitrogenada seran dATP, dTTP, dCTP o dGTP. La reacció fonamental és una transferència d’un grup fosfat en el què el grup 3’-OH actua com a nucleòtid en l’extrem 3’ de la cadena que està en creixement.
Encara que el DNA polimerasa només té un lloc actiu per aparellar els quatre dNTP diferents, la unió correcta dels parells de bases A-T, C-G és possible basant-se en la geometria d’aquests (si la unió és incorrecta s’alenteix el ritme de catàlisis, fet que fa que la DNA polimerasa afegeixi preferentment les bases correctes).
El DNA polimerasa pot afegir fins a 1000 nucleòtids per segon, la velocitat de catàlisi dependrà del temps que aquesta estigui unida al DNA. El creixement de cadena es produeix de 5’ a 3’, ja que es requereix d’un grup 3’-OH lliure per a l’inici de la síntesis (aquest és el què fa l’atac nucleofílic sobre el fosfat alfa del dNTP). Això vol dir que les DNA polimerases necessiten un iniciador 3’-OH (que pot ser de DNA o de RNA) anomenat cebador, que és sintetitzat per la RNA primasa. L’extrem 3’ del cebador és l’extrem cebador.
Les DNA polimerases també realitzen altres funcions durant el procés de replicació. A part de participar en la elongació del DNA, també desenvolupen una funció correctora i reparadora molt important.
Resumint, en la replicació del DNA intervenen d’una manera interrelacionada i coordinada més de 20 proteïnes. Les DNA polimerases són enzims que catalitzen la síntesi de DNA, ara estudiarem concretament la DNA polimerasa I. Les DNA polimerases requereixen de tres components essencials per a sintetitzar una cadena de DNA: o DNA motlle És essencial un motlle de DNA. El motlle pot ser una sola cadena de DNA, o bé una doble cadena. La doble cadena de DNA és un motlle eficaç només si el seu esquelet sucre-fosfat està trencat en un o més llocs.
6 TEMA 9. DNA recombinant Bioquímica o Cebador de DNA o RNA (extrem cebador –OH 3’) La DNA polimerasa I uneix desoxiribonucleòtids als grups 3’-hidroxil-terminals d’un bri de DNA preexistent. Dit en altres paraules, és necessari una cadena cebadora amb grups 3’-OH lliures.
Cal remarcar que la RNA polimerasa, a diferència d’aquesta, no necessita encebadors.
o dNTPs Cal que hi siguin presents els quatre precursors activats, els desoxiribonucleòsids-5’trifosfat: dATP, dGTP, dTTP, dCTP. També es requereix la presència de magnesi.
La reacció d’elongació de la cadena catalitzada per la DNA polimerasa té lloc mitjançant un atac nucleofílic del 3’-OH terminal de la cadena cebadora (o iniciadora) sobre l’àtom de fòsfor més intern del desoxiribonucleòsid trifosfat recent arribat. Es forma un pont fosfodièster amb eliminació de pirofosfat. La subseqüent hidròlisis del pirofosfat per una pirofosfatasa inorgànica, un enzim omnipresent, fa que la polimerització tiri endavant. La elongació de la cadena es realitza en la direcció 5’-3’.
Cal remarcar que la DNA polimerasa catalitza la formació d’un enllaç fosfodièster només si la base del nucleòtid recent arribat és complementària a la base situada sobre el bri de motlle. La probabilitat de què es formi un enllaç covalent és molt petita, a no ser que la base recent arribada s’aparelli amb la base de la cadena motlle segons el disseny formulat per Watson i Crick.
Així doncs, la DNA polimerasa és un enzim dirigit pel motlle, pren instruccions del motlle i sintetitza un producte amb una seqüència de bases complementaria a la del motlle. Un altre aspecte de la DNA polimerasa I és que corregeix els errors del DNA eliminant els nucleòtids mal emparellats. Aquestes propietats contribueixen a la excepcional baixa taxa de mutació (taxa d’error inferior a per cada parell de bases).
7 TEMA 9. DNA recombinant Bioquímica Seqüenciació de DNA: Mètode del didesoxi de Sanger S’han dissenyat diferents mètodes de seqüenciació, nosaltres ara estudiarem el de Sanger, que permet seqüenciar el DNA generant fragments per interrupció controlada de la replicació enzimàtica.
Actualment aquest mètode és el mètode seleccionat degut a la seva senzillesa. Consisteix en copiar una determinada seqüència d’un DNA d’un bri utilitzant la DNA polimerasa I. El cebador per a la síntesis és un fragment complementari, que pot obtenir-se per digestió controlada per un enzim de restricció o per síntesis química. El medi d’incubació conté, a més dels quatre desoxiribonucleòsids trifosfat (marcats radioactivament), l’anàleg 2’,3’-didesoxi d’un d’ells. La incorporació d’aquest anàleg impedeix tot el creixement posterior de la nova cadena, perquè li manca el grup hidroxil 3’, que és essencial per a la formació del següent enllaç fosfodièster.
Així, es produeixen fragments de diferent longitud que contenen l’anàleg didesoxi en l’extrem 3’. Se separen per electroforesi quatre sèries de dits fragments de cadena interrompuda (una per cada anàleg de didesoxi) i la seqüència de bases del nou DNA es llegeix a partir de l’autoradiograma.
En la fotografia de les bandes observem com es pot llegir de baix a dalt l’ordre de la seqüència.
A dalt hi ha els fragments de la cadena més llarga (ho han incorporat més cap al final).
Un problema que pot suposar aquest mètode és que la lectura de la polimerasa al final i a l’inici pot ser difícil, problemàtica, és per això que cal fer vàries passades per bri (mínim tres).
8 TEMA 9. DNA recombinant Bioquímica Seqüenciació automàtica Una alternativa molt eficaç a l’auto-radiografia és la detecció per fluorescència. S’uneix un marcador fluorescent al oligonucleòtid cebador, diferent del color per a cada una de les quatre barreges de reacció de cadena interrompuda. Les barreges de reacció s’ajunten i són sotmeses a electroforesi (per capil·laritat). Les bandes separades de DNA es detecten aleshores per fluorescència al sortir del gel, i la seqüència de colors ens dóna directament la seqüència de bases. D’aquesta manera poden determinar-se seqüències de fins a 500-800 parells de bases.
La detecció per fluorescència és avantatjosa, ja que s’elimina l’ús de reactius radioactius i el mètode pot ser fàcilment automatitzat.
Amb les seqüències automàtiques, mètode actual, pots fer 67000pb/h en plaques de 96 pous.
Seqüenciació a gran escala La seqüenciació a gran escala permet seqüenciar genomes (moltes semireaccions a la vegada i en la mateixa placa).
En aquest mètode tenim esferes (nano) que tenen seqüències de DNA (oligonucleòtids de seqüència coneguda) units covalentment. Agafem el DNA de seqüència desconeguda, el fragmentem i se li enganxa un octàmer (seqüència de DNA complementària perquè s’enganxi).
9 TEMA 9. DNA recombinant Bioquímica a) Fragmentació per mètodes mecànics b) Enganxem oligonucleòtids coneguts per a poder hibridar c) Emulsió La bola enganxa amb un extrem i hibridem el que queda lliure: agitem (microgotes amb primer, bola, nucleòtids...) i amplifiquem de manera que la bola queda folrada (amplificarà la senyal).
d) Els fragments amplificats s’uneixen per un extrem a la bola (bola folrada) e) Inici de l’amplificació A aquí comença l’amplificació en plaques de picotítols. La mida de la placa només pot atrapar una bola.
En cada pou només vestim un únic tipus de dNTP.
Cal incubar el DNA en un lloc on hi hagi més partícules que DNA, perquè hi hagi una boleta per DNA (fase d’amplificació: amplificar número de còpies de DNA a seqüència, templet). Un cop incubat s’afegeix polimerasa, que va fent còpies, de manera que vas folrant la boleta i es dissocia el segment. Finalment, fas la seqüenciació: cada partícula de bola la posen en una nano-placa (hi haurà un pou per boleta) i hi unim una resina (permet unir covalentment l’enzim i que no es perdi l’activitat; sulfurilasa i luciferasa) i el cebador complementari (polimerasa i UN dNTP per pou). Si la seqüència té C, per exemple, la polimerasa la incorporarà i alliberarà PP, que amb la resina donarà llum (si ho incorpora farà llum).
Val a dir que és un mètode lent, 25000000 pb/h, que són poquetes, ja que a l’ordinador li costa unir i cal repetir el procediment varis cops.
10 TEMA 9. DNA recombinant Bioquímica 3. CLONATGE DE DNA Enzims de restricció En el clonatge de DNA, a l’hora d’afegir un inserto en un DNA (un tros de DNA), cal tallar un tros del DNA plasmidi, de manera que són necessaris enzims de restricció.
Els enzims de restricció, també anomenats endonucleases de restricció, reconeixen seqüències específiques de DNA de doble helicoide i tallen ambdós brins en llocs concrets.
Aquests, són indispensables per a analitzar l’estructura dels cromosomes, seqüenciar fragments molt llargs de DNA, aïllar gens i crear noves molècules que poden ser clonades.
S’han trobat enzims de restricció en una gran varietat de procariotes (formen part de les defenses dels bacteris). La seva funció biològica consisteix en destruir molècules de DNA estrany. El DNA propi de la cèl·lula no es degrada perquè els centres reconeguts pels seus propis enzims de restricció estan metilats. Molts enzims de restricció reconeixen seqüències específiques d’entre quatre i vuit parells de bases, i hidrolitzen un enllaç fosfodièster en cada bri d’aquesta regió. Una característica notable de la majoria d’aquests centres de tall és que posseeixen simetria rotacional de segon ordre, és a dir, la seqüència reconeguda és palindròmica i els punts de tall estan disposats simètricament.
En cada bri, l’enzim hidrolitza l’enllaç fosfodièster C-G en el cantó 3’ de l’eix de simetria (els talls poden ser en la mateixa alçada (romo) o amb un cert escalonament (extrems protuberants o cohesius). L’extrem romo pot enganxar-se a qualsevol fragment amb extrems romos, els cohesius no. En la taula s’observa diferents enzims i per on tallen (tipus de tall).
11 TEMA 9. DNA recombinant Bioquímica DNA ligases: unió de cadenes de polinucleòtid Per aplicacions de tècniques de DNA recombinant, es poden construir en el laboratori noves combinacions de gens no relacionats. Aquestes noves combinacions poden clonar-se (amplificar moltes vegades) mitjançant la seva inserció en cèl·lules adequades on seran replicades per la maquinaria de síntesis de DNA de l’hoste. Els gens inserits normalment es transcriuen i tradueixen en el seu nou entorn. El més sorprenent és que pot dissenyar-se una alteració permanent en el llegat genètic de l’hoste.
Com ho fem: un fragment d’interès de DNA s’uneix covalentment a un DNA vector. La característica essencial d’un vector és que es pot replicar de forma autònoma en un hoste apropiat. Un exemple de vector-hoste: clonació en E.coli (hoste), ús d’un plasmidi i el (vectors). En aquest cas, el vector és tallat en un punt concret per l’enzim de restricció EcoRI.
Si per exemple l’enzim fa talls escalonats, aquests talls generaran extrems complementaris d’un sol bri, que tenen una afinitat específica entre si, per això s’anomenen extrems cohesius.
Qualsevol fragment de DNA que tingui els mateixos extrems cohesius pot inserir-se en aquest plasmidi. Aquest fragment (inserto) pot preparar-se partint d’un gran tros de DNA i usant el mateix enzim de restricció que es va utilitzar per a obrir el DNA plasmídic. Els extrems monocatenaris d’aquest fragment serien complementaris als del plasmidi tallat. El fragment de DNA i el plasmidi tallat podrien adherir-se i després connectar-se per l’acció de la DNA ligasa, que catalitza la formació d’un enllaç fosfodièster entre dues cadenes de DNA. La DNA ligasa requereix un grup OH lliure en l’extrem 3’ i un grup fosfat en l’extrem 5’. A més a més, les cadenes unides per la ligasa han d’estar formant una doble helicoide. Per a la reacció de lligant, cal una font d’energia com ATP o NAD+.
Aquest mètode dels extrems cohesius pot generalitzar-se per a unir molècules de DNA utilitzant un adaptador (linker), una molècula curta de DNA obtinguda per síntesis química i susceptible al trencament per enzims de restricció. L’adaptador s’uneix covalentment als extrems d’un fragment de DNA, o a un vector i que aquests es lliguin mitjançant ligasa.
12 TEMA 9. DNA recombinant Bioquímica Gran cost energètic: cal un bon donador d’adenils (l’enzim catalitza l’adenilació perquè sigui favorable).
Transcriptasa inversa La transcriptasa inversa és una polimerasa capaç de fer la retrotranscripció (originaria del retrovirus). Aquesta, permet fer una còpia de RNA a DNA (important en el laboratori): agafa mRNA (no introns, informació codificant per al polipèptid) i el converteix al DNA equivalent (cDNA: DNA complementari obtingut per transcripció inversa de mRNA).
Normalment la transcriptasa inversa crea DNA de cadena simple mitjançant RNA, però hi ha retrotranscriptases capaces de sintetitzar el cDNA dúplex sense necessitat de separar el bri.
En la imatge observem els passos de síntesi de cDNA (el cDNA és sintetitzat sintèticament amb un cebador i transcriptasa inversa): a) El mRNA motlle és hibridat mitjançant un cebador oligonucleòtid sintètic (extracció en columnes d’afinitat amb cebador: oligonucleòtids de T).
b) La transcriptasa inversa i dNTPs formen una cadena de DNA complementari c) El mRNA és degradat amb un alcalí (hi ha retrotranscriptases capaces de sintetitzar el cDNA dúplex sense necessitat de separar el bri) d) Els dNTPs i la DNA polimerasa I formen un DNA dúplex, de doble cadena.
13 TEMA 9. DNA recombinant Bioquímica El cDNA pot formar-se gràcies a l’enzim transcriptasa inversa, un enzim utilitzat pels retrovirus per a formar un híbrid DNA-RNA durant la replicació del seu RNA genòmic. La transcriptasa inversa sintetitza un bri de DNA complementari a un motlle de RNA si se li proporciona un cebador aparellat amb el RNA i que posseeixi un grup OH lliure en la posició 3’. Aquest enzim pot utilitzar-se per a sintetitzar DNA a partir de mRNA proporcionant-li un cebador de oligo-dT, que s’aparelli amb la seqüència poliA que es troba en l’extrem 3’ de casi tots els mRNA eucariòtics.
A continuació, se sintetitza el resto de bri de cDNA en presència dels dNTPs. Després, el bri RNA d’aquest híbrid RNA-DNA s’hidrolitza augmentant el pH. A diferència del RNA, el DNA és resistent a la hidròlisis alcalina. L’extrem 3’ del bri de DNA recent sintetitzat forma aleshores un bucle en forquilla, i serveix de cebador per a la síntesis del bri de DNA complementari. El bucle en forquilla s’elimina per digestió amb nucleasa S1, que reconeix nucleòtids no aparellats. Al DNA de doble bri resultant se li poden afegir adaptadors per a lligar-lo a un vector adequat.
Les molècules de cDNA poden inserir-se en vectors que afavoreixin la seva expressió eficient en hostes. Els plasmidis o fags usats s’anomenen vectors d’expressió. Per aconseguir un màxim de transcripció, el cDNA s’insereix en el vector a prop d’un promotor bacterià molt actiu.
Clonatge de DNA En el clonatge de DNA és necessari escollir el lloc on tindrà lloc, és a dir, escollir un vector que bé pot ser circular (plasmídic) o lineal. El vector és una molècula de DNA (seqüència coneguda, normalment artificial) que permet que nosaltres puguem duplicar n cops el nostre DNA.
També cal escollir els dos enzims de restricció que serviran per clonar. Cal fer un anàlisi mapa de restricció: mirar que hi ha a les puntes de la seqüència que vols (comprovar dianes que estiguin en el vector i que quan ho obris no trenquis cap part vital). Aquest seria un clonatge direccional, ja que només pot entrar en una posició. És important dins de la bateria de tisores (enzims restrictius) mirar quines són combatibles, recorda que hi ha dos tipus de talls romo o cohesiu. El més efectiu és l’ús de dos cohesius i que el què hi ha en cada cantó sigui diferent (protuberància diferent: mirar que no siguin compatibles). Amb dos extrems diferents (com en l’exemple de la fotografia) ens assegurem la direccionalitat de la unió.
Un cop escollit, ho uneixes amb la DNA ligasa. En resum, doncs, tallaries, purificaries i ho incubaries al vector. Un cop clonat pots introduir-lo al bacteri o cultiu o el què t’interessi.
Inconvenient: es transforma millor el vector que no ha incorporat el plasmidi.
14 TEMA 9. DNA recombinant Bioquímica Elements d’un vector Un vector ha de tenir com a mínim els següents elements: 1) Un origen de replicació.
2) Un gen que ens permeti seleccionar quines cèl·lules del hoste han incorporat el vector (tetraciclina): gen marcador.
3) Cal obrir-lo amb enzims de restricció, de manera que ens interessa que hi hagi molts llocs de restricció. Normalment el què es fa és afegir una seqüència sintètica (polilinker) que conté molts llocs de restricció en tàndem (és important que no hi hagi el lloc de restricció en cap altre lloc del vector), així podem tallar per on ens interessi.
4) Un gen que estigui interromput pel polilinker, però funcional, que quan el polilinker es trenqui (per afegir l’inserto) deixi de ser funcional (n’és un exemple el gen de resistència a l’ampicil·lina).
15 TEMA 9. DNA recombinant Bioquímica Val afegir un cinquè punt. De vegades ens interessa que el vector expressi un gen, de manera que davant del polilinker hi hagi un promotor (i terminador) de l’espècie en curs (no un humà en una llevat!!!), convertint així el vector en un vector d’expressió.
Estratègia global de clonatge d’un DNA Exemple de clonatge: pBR322, té el gen de resistència a l’ampicil·lina (té un punt de restricció, el PstI), el gen de resistència a la tetraciclina i no té polilinker. Obrirem el pBR322 per PstI, i s’incuba amb el DNA oberta mb PstI, es lliga amb el vector (DNA ligasa) i transformem l’organisme (amb clorur de calci és el més típic). Un cop fet això, caldrà diferenciar quins bacteris han incorporat el vector i quins no (per això és important que hi hagi un marcador en el vector), ja que alguns l’incorporen, mentre que d’altres es tornen a tancar sobre sí mateix (fins i tot fent-ho amb dos enzims).
Per diferenciar-ho incubarem els bacteris en un medi selectiu, en aquest cas en un medi amb tetraciclina, ja que aquest era el marcador. Només les que tenen el vector seran resistents a la tetraciclina (el vector tenia aquest gen). En aquesta placa tindrem els vectors transformats i els vectors que no s’hauran transformat (només s’han tornat a tancar). Ara, doncs, caldrà fer una segona selecció. Els vectors que hagin incorporat l’incerto hauran perdut la proteïna que la codificava, que en aquest cas era el gen de resistència a l’ampicil·lina. Piquem colònies i cada pic el posem en un medi amb tetraciclina (control) i en un amb tetraciclina i ampicil·lina.
D’aquesta manera la colònia que no haurà crescut en aquest segon medi serà la que haurà incorporat l’incerto, la què m’interessa, i puc agafar-la del medi control.
En altres casos es fa amb el gen LacZ, que en el medi adequat, quan té incerto les colònies es veuran blanques (perquè no expressen el gen LacZ) i quan no blaves.
16 TEMA 9. DNA recombinant Bioquímica Altres vectors: virus modificats Un vector no ha de ser sempre un plasmidi. Un vector és un fragment de DNA (lineal o no) conegut que ens serveix per a transmetre informació genètica. Per a fragments de DNA molt grans (més de 20Kb) hi ha cromosomes artificials (els plasmidis són molt limitats): BACs (bacterians, que toleren grans insertos), YAC (cromosoma artificial de llevat, tenen més capacitat que els BACs, de manera que és útil per a seqüenciar el genoma humà), còsmics (importants per a les primeres seqüències de genoma humà), etc.
Un exemple d’un altre vector que no sigui un plasmidi, com ja hem mencionat amb anterioritat, és el bacteriòfag lambda (BAC), que infecta el bacteri, i s’ha usat per a refer llibreries de DNA (una llibreria és un conjunt de vectors que contenen fragments de DNA diferents al hoste).
En el bacteriòfag lambda se li pot eliminar un tros de DNA no essencial i substituir-lo per el què nosaltres vulguem clonar (com més gran sigui el inserto més difícil serà, concretament, el bacteriòfag lambda permet clonar fins a 20Kb!!!).
Procediment (imatge): a) Ús d’una endonucleasa de restricció per eliminar tros de DNA no essencial (no eliminarem els enzims lítics ni els necessaris per a l’empaquetament) b) Ús de la DNA ligasa c) Obtenció de DNA recombinant d) Empaquetament in vitro de diferents fragments Exemple: vull estudiar el fetge. Trec RNA, el converteixo a cDNA (conjunt de gens que s’expressen en aquell òrgan), que és empaquetat en càpsides que infecten bacteris. Després caldrà buscar la colònia que ho expressi per proteïnes (ho fem amb anticossos).
A partir de mRNA es pot preparar cDNA i expressar-lo en cèl·lules hoste: pàncrees – mRNA proinsulina de mamífers – proinsulina cDNA – plasmidi recombinant – bacteris transformats.
17 TEMA 9. DNA recombinant Bioquímica 4. CONSTRUCCIÓ DE BIBLIOTEQUES DE DNA Llibreries de DNA Les llibreries de DNA són el conjunt de vectors que contenen fragments de DNA diferents als del hoste (un d’aquests fragments és el d’interès per a nosaltres). S’utilitza per a fragments de genomes amb pocs introns (és poc aconsellable per a genomes amb introns, una alternativa és empaquetar el cDNA a partir del mRNA).
Pot haver-hi llibreries de DNA genòmic (ja no són de gaire interès) i de cDNA (sí que interessen actualment: es donen en bateria de gens).
Exemple de la creació d’una biblioteca gènica a partir de la digestió d’un genoma eucariòtic.
a) Fragmentació del DNA genòmic per tall o digestió enzimàtica Fragmentació mecànica o digestió parcial amb enzims de restricció.
b) Unió als fragments de DNA de lambda: empaquetament in vitro (obtenció de virions lambda portant fragments de DNA estrany) Els fragments s’inseriran en un DNA vector, com el bacteriòfag lambda, preparat amb els mateixos extrems, en aquest cas cohesius.
c) Amplificació mitjançant la infecció a E.coli (obtenció de la biblioteca gènica de bacteriòfags lambda) S’infecta E.coli amb aquests bacteriòfags recombinants. El lisat resultant conté fragments de DNA humans allotjats en un gran nombre de partícules víriques assegurant així la representació de casi tot el genoma. Aquests bacteriòfags constitueixen una biblioteca gènica. Els bacteriòfags poden propagar-se de manera indefinida, i així la biblioteca pot ser utilitzada repetidament durant llargs períodes de temps.
Un cop formada la biblioteca és important explorar-la per a trobar la petita fracció de bacteriòfags que conté el gen d’interès. Es calcula que per a poder tenir un 99% de probabilitat d’èxit és precís examinar uns 500.000 clons. D’aquesta manera, és essencial disposar d’una tècnica exploratòria molt ràpida i eficient. Aquesta tècnica és la hibridació del DNA.
18 TEMA 9. DNA recombinant Bioquímica Reacció en cadena de la polimerasa (PCR) La reacció en cadena de la polimerasa (PCR) és un mètode per a amplificar seqüències específiques de DNA. Gràcies a aquesta tècnica no cal buscar enzims de restricció.
Exemple: Volem amplificar una regió del gen. Agafo el cDNA i amplifico la zona: agafo un cebador (primer) complementari a una porció de la cadena superior (de 20 a 30 nucleòtids) i agafem un altre primer per a la cadena de baix cap a l’altre sentit (són trossos idèntics; van des de l’extrem 3’ del cebador en direcció al 5’). Posem polimerasa i comença a allargar-se. En el següent cicle tindrem el doble, un es trenca amb el cebador i serà el majoritari quan ho fem n cops pràcticament veurem només la regió que ha de ser amplificada (veure transcurs en les imatges).
Un cicle de PCR consta de tres etapes (cal repetir el cicle n cops; en cada etapa dupliques un cop el DNA): 1) Cicle on separem brins Els dos brins de la molècula de DNA original se separen mitjançant l’escalfament de la dissolució a 95º durant 15 minuts.
2) Cicle on els primers s’hibriden amb el motlle complementari La dissolució es refreda bruscament a 54º de manera que permetrà a cada cebador hibridar-se amb un bri de DNA.
3) Polimerització durant 30’’ (síntesis de DNA) S’escalfa la dissolució a 72º, temperatura òptima per a la DNA polimerasa de Taq.
19 TEMA 9. DNA recombinant Bioquímica Una característica de la PCR és que tots els brins nous de DNA serveixen com a motlles en cicles successius. Més concretament, el bri format en el primer cicle servirà com a motlle per a la síntesis d’un altre bri com ell en el segon cicle i en cicles successius.
El DNA constituït per la seqüència diana flanquejada pels primers augmenta exponencialment amb el nombre de cicles, mentre que la resta de les seqüències de DNA de la barreja augmenten només de manera lineal. D’aquesta manera, al cap d’uns pocs cicles, tal i com hem dit abans, gairebé tot serà la regió diana de DNA que volem amplificar. En teoria, al cap de n cicles la seqüència s’amplifica .
Característiques de la PCR: 1) No cal conèixer la seqüència de fragment diana del mig, només en conèixer els extrems és suficient.
2) La regió diana pot ser molt més gran que els primers.
3) No és necessari que els primers s’ajustin perfectament a les seqüències que flanquegen el fragment diana a amplificar.
4) La PCR és altament específica degut al rigor de la hibridació a alta temperatura. L’únic fragment de DNA que s’amplifica és el comprès entre els primers que s’han hibridat.
5) La PCR és molt sensible: pot detectar-se i amplificar-se una única molècula de DNA.
Tenim una corba control (DNA-M, nombre de cicles) que permet veure en quin moment comença a estabilitzar-se la formació de DNA, de manera que si ens interessa quantificar el DNA haurem de parar-ho als cicles del començament (per veure quant DNA tenim relatiu al DNA x), però si el què t’interessa és tenir bastant DNA per fer l’amplificació, faràs bastants més cicles (valor de cicle elevat, perquè t’és igual quant DNA tinguis, en vols molt).
Aplicacions de la PCR a) Identificació de la presència de seqüències/gens en mostres complexes b) Clonatge de seqüències de DNA Amplificació del DNA per clonar-lo: lloc de restricció a banda i banda. Si no ho tens: buscar quines dianes estan en el vector, que no tallin la seqüència que ens interessa i dissenyem primers amb seqüències d’enzim de restricció (clonatge més fàcil): el producte final tindrà incorporades les seqüències.
c) Modificació de seqüències de DNA: ex. mutagènesis dirigida Dissenyar primers que tinguin la mutació del nucleòtid d’interès.
20 TEMA 9. DNA recombinant Bioquímica d) Identificació de polimorfismes: primers que discriminin mutacions...
- Proves de paternitat - Medicina forense (amplificacions de PCR: codis) e) Quantificació relativa (de DNA, o RNA en la RT-PCR): PCR a temps real, veus com progressa.
Repeticions en tàndem curtes (STRs), utilitzades en la identificació d’individus S’aprofita el DNA altament repetitiu (part més variable entre els diferents individus) i es fan de 9 a n cicles de repetició: la mida del gen variarà (98, 90, 120...) en l’individu, tal i com es pot veure en la fotografia. En alguns casos l’elongació de repeticions té a veure amb malalties genètiques. Amb aquest mètode podem predir la mida per a cada una de les variants.
Un exemple d’aquest mètode és el CODIS 13 (13 locus que contenen seqüències de DNA satèl·lit): L’empremta digital s’utilitza per a diferenciar dos individus d’una mateixa espècie utilitzant mostres del seu DNA. La tècnica emprada es basa en què dos éssers humans tenen una gran part de la seva seqüència de DNA en comú i per a diferenciar a dos individus es pot explotar la repetició de seqüències altament variables anomenades mini-satèl·lits o satèl·lits. Dos éssers humans no relacionats serà poc probable que tinguin el mateix nombre de mini-satèl·lits en un determinat locus. En el SSR/STR de perfils la reacció en cadena de la polimerasa (PCR) s’usa per a obtenir suficient DNA que permeti detectar el nombre de repeticions en varis loci. És possible establir una selecció que és molt poc probable que hagi sorgit per casualitat, exceptuant el cas dels bessons idèntics, que tindran idèntics perfils genètics.
21 TEMA 9. DNA recombinant Bioquímica En definitiva, perquè una persona quadri igual amb una altra, és a dir, que tingui les mateixes repeticions, hi ha una probabilitat molt baixa. Si hi ha coincidència (d’un 50%) pot haver-hi parentesc.
Amplificació múltiple (múltiplex; patró de bandes únic) És un altre exemple de les aplicacions de PCR. En el mateix tub de PCR posem els 13 parells de primers (un parell per a cada parell de cromosomes). Els primers estaran marcats amb colorants per a poder-los diferenciar. Es fa una amplificació per PCR, i es fan córrer els fragments de PCR en una cromatografia/electroforesis per capil·laritat, s’excita per llum i en funció de la longitud d’ona sabrem quin primer és, quin locus li correspon (esperarem x pics).
22 TEMA 9. DNA recombinant Bioquímica 5. SELECCIÓ I RECERCA DE SEQÜÈNCIES ESPECÍFIQUES DE DNA Determinació de seqüències específiques de DNA mitjançant la hibridació Detecció d’una seqüència en el lisat de colònies de bacteri.
Hibridem amb una sonda de DNA específica per a l’inserto (com un Southern).
La tècnica consisteix en: amplificar DNA, marcar-lo i utilitzar-lo per hibridar per saber si en una mostra concreta hi és. Exemple: clons de bacteris de DNA. Utilitzem un vector per saber on és la colònia positiva: poses un filtre on les colònies s’enganxaran, ho passes per una solució alcalina, de manera que el DNA queda exposat. Poses una sonda complementaria al DNA clonat que trobarà a l’atzar la complementària, rentem i veurem en quines colònies hi ha nostre inserto.
És una manera de seqüenciar el DNA mitjançant la síntesi de col·leccions d’oligonucleòtids. La seqüenciació per hibridació utilitza una sèrie de sondes d’oligonucleòtids de seqüència coneguda per a buscar seqüències complementàries en una molècula diana de DNA més llarga. En la teoria, tu tindràs una seqüència de DNA diana que s’hi uniran les sondes de seqüència coneguda per complementarietat i podràs reconstruir la seqüència de DNA desconeguda alineant les seqüències solapades. A la pràctica, però, és més complicat perquè els oligonucleòtids que no són perfectament complementaris a la seqüència diana s’aparellen formant dúplex, encara que amb menor afinitat.
El DNA diana marcat amb fluorescència i hibridat a sondes complementàries en la superfície d’un xip de DNA pot visualitzar-se fàcilment per microscòpia de fluorescència.
Això, ja no s’usa tant des de la PCR (més fàcil agafar pics i fer PCR), però segueix utilitzant-se pel Southern i el Nouthern.
SOUTHERN: Transferència de DNA des d’un gel i detecció d’una seqüència mitjançant la hibridació amb una sonda de DNA marcada.
Exemple: DNA ratolí, no tots són transgènics (no tots han integrat el vector ni tindran el mateix nombre de còpies), per identificar si hi és o no (si féssim PCR seria quantitativa) agafem un DNA genòmic ratolí (de la cua normalment per no matar-lo) fragmentat en enzims de restricció, es passa per gel d’agarosa i hi haurà bandes de diferents mides. Es transferirà a una 23 TEMA 9. DNA recombinant Bioquímica membrana de filtre, afegim la sonda marcada (ex. fòsfor 32) i veiem que conté el complementari (com més bandes més còpies en diferents llocs del genoma), és transgènic (controls per assegurar que vagi bé).
NOUTHERN: és el mateix, però amb RNA (les sondes sí que són de DNA), però tenim fragments de mRNA, s’aïlla, es carrega en un gel, s’obté el bandejat, es transfereixen i el nombre de bandes serà equivalent al nombre de còpies del mRNA que tinguem. Aquest mètode serveix per quantificar (si tinc un mRNA control veig que tinc 10 vegades més del mRNA; repetició: 20 vegades més (s’ha induït dos cops)). Quantificació relativa (proteïnes o mRNA): PCR quantitativa: compara les dues corbes (gel referència i estudiat) diferent entre dos punts d’igual DNA veiem mRNA inicial: si tens 10 vegades més del teu gen, en unes altres condicions 20 vegades més (tot respecte el de control que en principi no varia) voldrà dir que s’ha induït dos cops (ha augmentat la seva expressió dues vegades).
Transferència Southern. Un fragment de DNA que conté una determinada seqüència pot ser identificat separant per electroforesis una barreja de fragments, transferint-los a nitrocel·lulosa i hibridant amb una sonda marcada amb fòsfor 32 i complementaria a la seqüència que es busca. El fragment que conté la seqüència es visualitza després per auto-radiografia.
Poden detectar-se fàcilment petites diferències entre molècules semblants de DNA separant i visualitzant els seus fragments de restricció per electroforesis en gel. Un fragment de restricció que conté una determinada seqüència de bases pot ser identificat hibridant-lo amb un bri de DNA complementari. La barreja del fragment de restricció se separa per electroforesis en gil d’agarosa, es desnaturalitza per a formar DNA d’un bri i es transfereix en un full de nitrocel·lulosa. Les posicions dels fragments de DNA en el gel es mantenen en el full de nitrocel·lulosa, on poden ser hibridats amb una sonda de DNA d’un bri marcat amb fòsfor 32. A continuació, s’observa per auto-radiografia la localització dels fragments de restricció que 24 TEMA 9. DNA recombinant Bioquímica posseeixen una seqüència complementaria a la de la sonda. D’aquesta manera pot identificarse amb facilitat un fragment concret entre un milió d’ells. Aquesta tècnica tan útil es coneix com a transferència de Southern. D’una manera semblant poden separar-se molècules de RNA per electroforesis en gel i identificar seqüències concretes per hibridació semblant de transferència a nitrocel·lulosa. Aquesta tècnica anàloga a la anterior s’anomena transferència Nouthern. Les tècniques Southern, Nouthern i Western es coneixen també com a transferències de DNA, RNA i proteïna respectivament.
Microarrays de DNA Són com portaobjectes on hi posem oligonucleòtids o fragments bastant sencers del gen (exemple: portaobjectes amb màxim número de gens humans, 23.000 potser no).
En cada goteta (no visible a ull humà) podem saber quina seqüència complementaria d’aquest gen hi ha (es compra fet).
Serveix per fer hibridació comparativa (també podria ser absoluta).
La imatge ens mostra un cas exemple. S’intenta comparar cèl·lules de fetge sanes i no sanes: extraiem mRNA, fem cDNA i ho marquem amb fluorescència en cada cas: si els dos s’uneixen per igual tindrem igual senyal dels dos, de manera que no hi haurà problema. Si només veiem un color hi haurà problema (gen sa verd, gen malalt vermell) perquè voldrà dir que aquest gen o bé no l’expressa el sa o bé no l’expressa el malalt.
25 TEMA 9. DNA recombinant Bioquímica Veiem que competeixen per unir-se amb la complementaria del gen (n’hi ha vàries), per això si veiem un color només s’uneix un, etc.
Podem veure l’expressió diferencial entre aquests dos a nivell global, no gen per gen.
Això no es veu a ull, es veu mitjançant un escàner d’alta definició (informàtica important) (marcat per fluorescència). Els microarrays poden ser de DNA genòmic, no només de cDNA.
Hi ha un programa que t’ajunta a quins grups pertanyen (rutes metabòliques, glucòlisi, etc) i analitzes en cada ruta si hi ha un nombre significatiu de gens afectats (que pugui afectar a la ruta).
26 TEMA 9. DNA recombinant Bioquímica 6. ALGUNES APLICACIONS DE LA ENGINYERIA GENÈTICA Ara parlarem d’aplicacions en la indústria (fins ara era aplicacions en la investigació): producció d’interès farmacològic/biomèdic o a nivell de teràpia gènica.
En la taula de les diapositives es mostren alguns DNA recombinants productes en medicina. Es marca la insulina perquè va ser la primera que va començar a produir-se de manera massiva.
Algunes aplicacions d’enginyeria genètica Teràpia gènica: consisteix en inserir gens, les fases inicials d’aquesta donen resultats molt bons, però a llarg termini s’ha vist que les persones que han seguit aquesta teràpia han desenvolupat càncer.
En aquest mètode s’aprofiten virus que infectin a l’hoste, però a aquests virus se’ls ha eliminat els gens que tenen a veure amb l’empaquetament de partícules víriques i s’hi ha posat el gen d’interès en el seu lloc. Com que no té la capacitat d’empaquetar, el què fas és ensamblar el virus defectuós en un cultiu cel·lular de virus que poden ensamblar (tenim proteïnes que sintetitzen amb el virus la càpside). Un cop tens el virus defectuós, infectes l’hoste i un % s’integrarà en el genoma, però cada cèl·lula s’integrarà en un lloc diferent!!! (es fa amb retrovirus, que no són específics). D’aquesta manera, la probabilitat que envaeixin un oncogen és molt elevada. Cal buscar un sistema d’entrega de DNA que no alteri res que no tingui a veure amb cap regulació.
Els ratolins gegants obtinguts en enginyeria genètica són un exemple de l’expressió de gens estranys en cèl·lules de mamífers. L’hormona de creixement (somatotropina) se sintetitza normalment en la hipòfisis. El dèficit d’aquesta hormona causa l’enanimse, mentre que l’excés el gigantisme. Es va col·locar en un plasmidi un gen de la hormona de creixement de la rata al costat del promotor de la metal·lotioneïna de ratolí. Aquest promotor està situat normalment en el cromosoma, per a controlar la transcripció de la metal·lotioneïna, una proteïna rica en cisteïna amb gran afinitat pels metalls pesats. La síntesi hepàtica d’aquesta proteïna protectora 27 TEMA 9. DNA recombinant Bioquímica s’indueix per alguns ions de metalls pesants. Van introduir-se varis centenars de còpies d’aquest plasmidi en el pronucli mascle d’un òvul fertilitzat de ratolí, mitjançant una microinjecció, i l’òvul va ser implantat en l’úter de la femella de ratolí que actuava com a mare adoptiva. D’aquests zigots micro-injectats van néixer ratolins, alguns dels quals contenien el gen de la hormona del creixement de rata, que es va demostrar pel mètode Southern. Aquests ratolins transgènics, que contenien múltiples còpies del gen de la hormona de creixement de la rata, creixien molt més ràpidament que els ratolins control. El nivell d’hormona de creixement d’aquests ratolins era 500 vegades superior al normal i, al arribar a la maduresa, el seu pes corporal era el doble del dels ratolins normals. El DNA estrany s’havia transcrit i els seus cinc introns s’havien tallat correctament per formar un mRNA funcional. Aquests experiment demostren que un gen estrany, sota el control d’un promotor diferent del seu propi, pot ser integrat i eficientment expressat en cèl·lules de mamífer.
7. GENÒMICA I PROTEÒMICA 28 ...