Tema 13 Chips de proteína (2015)

Apunte Español
Universidad Universidad de Lleida (UdL)
Grado Ciencias Biomédicas - 2º curso
Asignatura Proteómica
Año del apunte 2015
Páginas 11
Fecha de subida 08/04/2016
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2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV INGENIERÍA DE PROTEÍNAS Y PROTEÓMICA TEMA 13 Chips de proteína (Protein arrrays) Principios generales A medida que avanzan las posibilidades técnicas, cada vez se hacen herramientas y procedimientos más miniaturizados y robotizados. Esto ocurre por ejemplo, con los arrays de proteína que son similares a un ELISA, pero mucho más pequeños.
Los chips de proteína son sistema para detectar características relevantes de la proteína, como función, cantidad, etc. en los que tenemos la proteína o el compuesto inmovilizado sobre un soporte físico. Una vez hemos inmovilizado el compuesto de interés, se añade una mezcla de proteínas o de otros compuestos para evaluar cómo interaccionan con el compuesto fijado en el chip.
Soportes Existen diversos tipos de soporte, que van desde superficies de vidrio, silicio, micropocillos (que ya se encuentran en la frontera de la miniaturización) hasta las membranas con cierta afinidad con las proteínas como las que se emplean para llevar a cabo el Western Blot.
Sistemas de detección Para visualizar las proteínas usa bastante la fluorescencia. También podemos ver quimioluminiscencia, radioactividad, espectrometría de masas o SPR (Surface Plasmon Resonance).
Protein microarrays Lo que habitualmente se llama chip de proteína es bastante similar a los arrays d DNA. Consisten en una superficie pequeña con pocillos o zonas en las que se fijan directamente las proteínas (en cada punto o pocillo se fija una proteína diferente).
1 Chips de proteína Inmovilización: estrategias generales Podemos diferenciar dos grandes tipos de inmovilización: - Covalente: relacionada con el uso de moléculas con grupos que son reactivos frente a los grupos de las proteínas (yodoacetamida, NHS, …). La superficie del array se recubre con estos compuestos.
Slides de aldehído: se pueden comprar ya preparados. Se trata de un soporte de vidrio que tiene grupos aldehído. Estos chips son relativamente reactivos frente a las proteínas (se pueden formar entrecruzamientos).
- No covalente - encontramos dos formas:  Específica: la superficie del chip está recubierta con algún compuesto que, por cuestión de afinidad, se une específicamente a un tipo de proteína.
Por ejemplo, la superficie del chip puede estar recubierta de anticuerpos. Esto se puede conseguir si, previamente, recubrimos el chip con proteína G, afín a las regiones Fc de los anticuerpos. Al añadir los anticuerpos, se unirán a la superficie del chip gracias a estas proteínas quedando las partes variables expuestas. Todos los anticuerpos quedan orientados de la misma manera (si los anticuerpos se unen al chip de manera inespecífica, no tendrían todos la misma orientación - cada uno se uniría de una manera).
A continuación podemos ver un ejemplo de unión específica comercializado por la casa comercial Sigma: producen las proteínas de interés fusionadas a la etiqueta BCCP (biotin-carboxy carrier protein tag), que indica a la maquinaria celular que, al expresar esta proteína, debe engancharse una molécula de biotina. Así, la proteína de interés tendrá una biotina. La superficie del chip que se incluye en el kit viene recubierta con estreptavidina, que tienen afinidad por la biotina.
 Inespecífica: la proteína se une directamente a una superficie que tiene afinidad por aminoácidos.
Así, cualquier proteína se puede enganchar. Por ejemplo, podemos encontrar chips recubiertos de nitrocelulosa (que compone las membranas que se usan en el Western Blot).
2 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Aplicaciones del chip de proteína De entrada, los chips de proteína sirven para hacer proteómica cuantitativa, ya que nos permiten comparar la cantidad de proteína que hay en dos muestras.
También pueden usarse en estudios de Interactómica.
Tienen aplicación en el campo de la proteómica funcional, por ejemplo para encontrar a qué proteína se une un fármaco concreto.
Podemos detectar proteínas concretas en presencia de anticuerpos, lo que nos puede permitir conocer contra qué proteínas expresa anticuerpos un determinado individuo. Así podríamos saber a qué anticuerpos ha estado expuesto el individuo (útil por ejemplo desde el punto de vista de las alergias) Profile de la respuesta inmunológica.
En función de los tipos de proteínas que tengamos ancladas en el microarray (y de la función del propio chip) podemos encontrar diversas nomenclaturas: - De fase directa (forward phase): se aplica cuando son protein arrays con una proteína diferente en cada pocillo.
- De fase reversa (reversa phase): en cada pocillo hay una mezcla de proteínas. Si esta mezcla es prácticamente todo un extracto celular o de tejido hay gente que las llama arrays de tejido (tissue arrays).
FORWARD ARRAYS o de FASE DIRECTA Dentro de los arrays de fase directa también podemos diferenciar varios tipos: - Antibody arrays - tienen un anticuerpo diferente en cada pocillo. También llamados capture arrays o target arrays.
- Una proteína diferente en cada pocillo. Dentro de estos también tenemos diferentes terminologías, más relacionadas con la aplicación del array que en el array en sí: Functional Protein Array - se usan para búsqueda de interacciones y funciones de proteínas.
También se llaman arrays in situ.
Antigen arrays: se usan para encontrar anticuerpos que reaccionen contra las proteínas.
3 Chips de proteína Arrays de anticuerpos Como ya se ha comentado, tienen diferentes anticuerpos enganchados en los pocillos.
Se usan para hacer proteómica cuantitativa. En cada pocillo tenemos un anticuerpo que reacciona contra una proteína diferente. Si tenemos dos condiciones biológicas diferentes, como por ejemplo una línea celular tratada y otra sin tratar, marcamos las proteínas de cada muestra con un fluoróforo diferente (con características espectrales diferentes). Una vez marcadas, se mezclan las proteínas de ambas muestras y se incuban en el chip. A los anticuerpos de los pocillos se van uniendo las proteínas que correspondan de una y otra muestra.
Así, cada pocillo tendrá una fluorescencia diferente  al obtener la fluorescencia de cada pocillo obtenemos información cuantitativa de cuánta proteína hay en cada condición.
Estos arrays permiten medir los niveles de expresión de muchas proteínas de una sola vez.
A continuación podemos los arrays de proteína comercializados por la empresa SIGMA. Ellos venden directamente los arrays con los anticuerpos que reaccionan contra proteínas que se encuentran relacionadas. Por ejemplo, podemos encontrar proteínas implicadas en señalización celular.
Podemos ver un ejemplo de un estudio en el que aplicaba esta tecnología para encontrar proteínas expresadas de forma diferencial en muestras de cáncer colorrectal frente a una muestra control.
4 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Arrays funcionales Se usan en ensayos que permiten conocer la función de la proteína: interacciones, sustratos que se unen, proteínas diana, … A continuación vamos a ver ejemplos de los primeros estudios en los que se consiguió hacer un array de un proteoma completo.
En el primer estudio cogieron los 6000 ORF de una levadura y los fusionaron con la etiqueta GST (Glutation S-transferasa). Produjeron y purificaron las 6000 proteínas a través de esta tag .En primer lugar identificaron a que proteínas de esta mezcla se unían diversos compuestos, como la calmodulina.
Cada compuesto estaba marcado con un fluoróforo, de forma que podían ser detectados. De esta manera, iban echando los compuestos y comprobaban en qué pocillos se unían (los compuestos tenían afinidad por las proteínas que se encuentran en los pocillos a los que se unen). También pueden emplearse estos arrays para estudiar la unión a fosfolípidos por ejemplo.
Esta aproximación se ha continuado empleando para ver a qué proteínas se puede unir un determinado compuesto, por lo que tiene cierto interés en el descubrimiento de las dianas de un fármaco (de mecanismo de acción desconocido).
En el segundo estudio purificaron una serie de kinasas de levaduras y las incubaron en los arrays en presencia de ATP radioactivo. Las proteínas fosforilaban a sus respectivas proteínas diana, que se encontraban ancladas en los pocillos, con el fósforo radioactivo. Gracias a la radioactividad del fósforo se podía detectar las proteínas que han sido fosforiladas.
*Dificultades en arrays funcionales Para llevarlos a cabo es necesario purificar miles de proteínas y además, debe encontrarse la forma de que estas queden enganchadas al soporte. Como ya sabemos, las proteínas tienen cierta heterogeneidad (químicamente diversas), por lo que, para enganchar las diferentes proteínas al chip se suelen emplear etiquetas. También podemos encontrar problemas de plegamiento de proteínas durante la producción. La existencia de modificaciones post-traduccionales diversas y desconocidas también entorpece la producción.
La producción de chips de proteínas se ha ido haciendo cada vez más industrial y se han ido desarrollando diversos sistemas de producción.
5 Chips de proteína Sistema PISA - protein in situ arrays La idea es hacer en un sistema in vitro el proceso de síntesis de la proteína. Un sistema in vitro consiste en tener en un tubo de ensayo un cDNA que codifica para la proteína de interés, los sustratos necesarios para la síntesis de la proteína (aa, ATP, …) y toda la maquinaria biosintética, aportada normalmente por un lisado celular.
En uno de los primeros estudios que se llevó a cabo empleando este sistema, los pocillos estaban recubiertas por un agente de captura, es decir, por alguna cosa con afinidad por una etiqueta.
La proteína, con la etiqueta correspondiente, se produce in vitro. Gracias a la etiqueta, las proteínas tienen afinidad por un agente de captura, que se encuentra en el fondo de los pocillos.
NAPPA - nucleic acids programmable protein arrays La idea de este sistema es tener en cada pocillo del array algún tipo de componente que permita fijar la proteína, como un anticuerpo contra la etiqueta. En cada pocillo también se pone un cDNA que codifique para una proteína  una proteína por cada pocillo.
El array se incuba en presencia de los elementos necesarios para producir la proteína in vitro. Así, en cada pocillo se produce la síntesis de una proteína que inmediatamente se inmoviliza en el pocillo.
DAPA - DNA Array to Protein Array Se trata de una técnica más sofisticada. Primero se construye un array que contiene los DNA que codifican para la proteína de interés (cDNA). Se produce una proteína diferente en cada pocillo. Por otro lado, hay un array que tiene el compuesto que permite fijar la proteína de interés.
Las dos superficies se ponen en contacto en presencia de toda la maquinaria y de los reactivos necesarios para la síntesis de proteínas. La proteína se inmovilizará en el protein array.
La ventaja es que el array resultante no contendrá DNA y que, además, el molde del array que contiene DNA se puede usar para producir más de un chip (esto representa una ventaja desde el punto de vista industrial).
6 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV No podemos obviar que la totalidad de este proceso se desarrolla in vitro y que, es probable que la producción in vitro no funcione bien con todas las proteínas . Es posible que haya problemas con las modificaciones post-traduccionales entre otras cosas.
Antigen arrays Los arrays de proteína se pueden pensar para conocer aspectos funcionales de la proteína o para encontrar qué anticuerpos están presentes en una muestra de origen biológico (sérum).
Por ejemplo podemos comparar el sérum de diferentes individuos para conocer los antígenos (o tipos de Ag) a los que ha estado sometida una persona. Cuando trabajamos de esta manera hablamos de Antigen Arrays.
Posibles usos de los arrays de antígeno: - Identificar proteínas antigénicas - Identificar alérgenos en personas alérgicas.
- Diagnosticar la exposición a antígenos (patógenos) en pacientes.
- Inmune response Biomarker Profiling Ejemplo 1. Identificación de proteínas antigénicas En el siguiente estudio se intentó buscar proteínas antigénicas en un organismo que causa una enfermedad con la intención de desarrollar vacunas y protocolos de inmunización pasiva.
Las proteínas fueron producidas in vitro y fueron inmovilizadas. Por otro lado, se infectaron unos animales con el microorganismo. Después, se cogió el sérum de estos ratones, que se incubó en los arrays para ver con qué proteínas habían desarrollado anticuerpos los animales (el array tenía las proteínas del microorganismo enganchadas). Así se identificaron las proteínas antigénicas del organismo.
7 Chips de proteína Ejemplo 2. Identificación de anti-cuerpos específicos de cáncer Podemos ver otro ejemplo en el que se llevó a cabo la identificación de la respuesta inmunológica del individuo con la intención de hallar un biomarcador. Si dicho individuo tiene por ejemplo un tumor, puede estar generando anticuerpos contra él. Esta respuesta inmunológica no es suficiente para combatir el tumor pero la presencia de anticuerpos nos puede indicar el estado de la patología. Tenemos todas las proteínas humanas enganchadas en un array y las incubamos con el sérum del paciente para comprobar contra qué proteínas ha desarrollado una respuesta inmunológica. El patrón de respuesta inmunológica puede ser un biomarcador de la enfermedad o del estadio.
Los arrays también resultan útiles para patologías autoinmunes.
Ejemplo 3. Detección de alergias En el tercer ejemplo se ha realizado una detección de alérgenos. Tenemos un array que contiene 48 proteínas que se encuentran entre los alérgenos más comunes. Los arrays podrían convertirse en una nueva manera de realizar las pruebas de la alergia (de forma menos molesta para el paciente).
ARRAYS DE FASE REVERSA o DE TEJIDO Como ya se ha comentado, en cada pocillo tenemos una mezcla de proteínas que, en el caso de los arrays de tejido es prácticamente un extracto celular o de tejido.
Ejemplo 1: tenemos un array de proteínas en el que los diferentes pocillos tienen extractos de diferentes tejidos de ratón. Se quiere determinar en qué tejidos se encuentra una proteína determinada y en qué niveles, lo que se puede hacer comprobando con el anticuerpo contra dicha proteína dónde hay más expresión.
Ejemplo2: Existen otras formas de hacer arrays de tejido. En este caso han cogido muestran de tejidos obtenidas de pacientes (biopsias) que han lisado y fijado en un array de proteínas.
Con laser capture microdissection se obtiene un pequeño lisado de la porción del tejido de interés.
Como se necesita muy poca proteína para hacer un array, a partir de este lisado se pueden inmovilizar las proteínas. El array se incuba con un anticuerpo, por ejemplo un anticuerpo contra una proteína tumoral (si es un tumor lo que estamos intentando encontrar).
8 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV El término array de tejidos puede inducir confusión ya que existe otra técnica con el mismo nombre. En inmunohistoquímica se usan otro tipo de arrays de tejidos que consisten en la obtención trozos de tejidos de diferentes muestras inmovilizadas en pequeños bloques de parafina - acaban siendo portaobjetos con muchos tejidos diferentes representados. Estos sirven para ver a la vez distintas reacciones con un mismo anticuerpo (en distintos tejidos o muestras). La diferencia es que en los arrays que se emplean en inmunohistoquímica se mantiene la estructura del tejido; en cambio, los arrays de proteína son lisados en los que se pierde toda información sobre distribución espacial.
Arrays de partículas en suspensión Tenemos todas las proteínas inmovilizadas en esferas (en lugar de tenerlas inmovilizadas sobre una superficie). Podemos tener por ejemplo las esferas o beads recubiertas de un anticuerpo particular contra una proteína concreta.
En el primer sistema que se desarrolló, los creadores fueron capaces de rellenar las beads con colorantes de los que se podían llegar a obtener hasta 100 tonalidades diferentes (combinando distintos colorantes). Estas tonalidades podían ser diferenciadas con un aparato similar a un citómetro de flujo. Un citómetro de flujo es un aparato pensado para contar células en el que las células van pasando una a una y son irradiadas con varios láseres - se mide la fluorescencia de cada célula. Estos investigadores adaptaron la idea del citómetro de flujo: en lugar de hacer pasar las células hacen pasar las bolas. El láser tiene la capacidad de conocer qué tonalidad está pasando en cada momento (es capaz de discriminar las 100 tonalidades diferentes).
En cada bola tenemos un anticuerpo diferente, es decir, tenemos un anticuerpo por cada tonalidad. Así, en función de qué tonalidad está pasando por los láseres, podremos conocer qué anticuerpo está pasando y, por tanto, qué proteína.
Esta técnica se puede llevar a cabo de varias maneras. La muestra se incuba con las bolas recubiertas de anticuerpos: las proteínas de la muestra se enganchan al anticuerpo correspondiente. Después, se incuban todos los beads con otros anticuerpos marcados con fluorescencia que reaccionen contra una proteína.
9 Chips de proteína Una vez llevado a cabo este proceso se hacen pasar las beads por el citómetro: uno de los láseres diferenciará la tonalidad de la bolita mientras que el otro mide la cantidad de fluorescencia del segundo anticuerpo. Así se puede cuantificar la cantidad de proteína que se ha unido a cada bolita.
Este sistema permite identificar hasta 100 proteínas (tantas como tonalidades permite discriminar el citómetro) a partir de una muestra pequeña.
A continuación podemos ver los kits comercializados por BioRad. Por ejemplo podemos comprar un kit para hacer un ensayo con fosfoproteínas: tendremos toda una serie de beads con anticuerpos contra distintas proteínas fosforiladas.
10 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV La última novedad es la versión magnética, los MagBeads. Las beads empleadas son magnéticas y también tienen diferentes tonalidades. Se requiere muy poca cantidad de muestra.
Este sistema se basa en microscopía.
En la superficie de las bolas también hay anticuerpos a los que se unen las proteínas. Una vez se han unido las proteínas con los anticuerpos se incuban las beads con los anticuerpos conjugados con fluoróforo (que se unirán a las proteínas de la muestra).
Toda la mezcla es aspirada por un aparato en el que, en una cámara, por acción de un imán se engancha una capa de bolitas. Se van captando por microscopía diferentes imágenes hasta obtener una imagen de todas las regiones en la que se puede ver qué colorante/tonalidad hay en cada región.
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