Tema 3 Annex, Cicle del nitrogen (2013)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Rovira y Virgili (URV)
Grado Bioquímica y Biología Molecular - 3º curso
Asignatura Metabolisme de Microorganismes
Año del apunte 2013
Páginas 8
Fecha de subida 18/01/2015
Descargas 28
Subido por

Vista previa del texto

Tema 3: Annex – Cicle del nitrogen: Diazotròfia: Fixació de N2 atmosfèric És un metabolisme relacionat amb el nitrogen, el nitrogen atmosfèric, el nitrogen molecular gas. Cóm pot ser incorporat als microorganismes? Ara estem veient compostos inorgànics, acabem de veure els bacteris nitrificants, veurem en el següent capítol els desnitrificants. Com tot aquests conjunt són els microorganismes que expliquen el cicle del nitrogen on s’emmarcaria també la fixació del nitrogen atmosfèric, per això ens ho ha intercalat. No obstant hem de tenir clar, sobretot, que no estem parlant de quimiolitotrofs, és a dir, de microorganismes que poden viure i oxidar compostos inorgànics, sinó que estem parlant d’una via anabòlica.
És una via anabòlica, per tant, es tracta d’un metabolisme d’obtenció d’energia. és un metabolisme d’aprofitament de nitrogen atmosfèric i a la cèl·lula li costa molt, perquè realment implica un aport energètic molt important, però li aporta molt avantatges també. Hi ha uns casos de simbiosi, com són les plantes lleguminoses i Rhizobium. Hi ha microorganismes capaços d’utilitzar el nitrogen atmosfèric que està disponible en elevades quantitats, incorporar-lo, passar-lo a una forma assimilable com és l’amoni que desprès en el propi microorganismes com en la planta poden utilitzar.
Tot això té molta importància, a més de la simbiosi, perquè és una de les etapes claus en lo que seria el cicle del nitrogen. Aquí tenim una representació de lo que ens trobaríem en un ecosistema en el que conviuen els diferents grups microbians que tenim a la imatge, que serien els nitrificants (que ja hem vist), els desnitrifiants (que ja els veurem), els fixadors de nitrogen (dels que parlarem ara).
Es la capacitat que tenen alguns microorganismes de captar nitrogen, lo que anomenem DIAZOTRÒFIA. Aquest cicle es un punt clau que relaciona les interaccions que s’estableixen enter microorganismes i a la vegada utilitzar i reutilitzar les diferents formes de nitrogen. La Diazotròfia només la poden fer procariotes. La fixació del nitrogen atmosfèric té un avantatge evident que és tenir la capacitat d’incorporar una font de nitrogen que esta àmpliament disponible a la atmosfera. Per tant, aquest microorganismes que són capaços de fer diazotròfia troben molt fàcil la incorporació de nitrogen.
El nitrogen gas (atmosfèric) és una molècula molt estable. Té un triple enllaç, per tant, no és fàcil incorporar una molècula d’aquestes. És una molècula inert des de el punt de vista de ser oxidada o transformada en un altre compost, de fet la manera química, la reacció de la conversió de nitrogen molecular (nitrogen atmosfèric) a amoníac, només es podria de forma química en, per exemple, on hi ha una descarrega energètica important. Per tant, en les industries aquest procés és un procés car y difícil de mantenir, ja que es requereix energia i catalitzadors, no obstant, de manera biològica, representa el 85% de conversió de nitrogen molècula en amoníac i es dona principalment per aquesta classe de microorganismes.
Aquesta via és anabòlica, una via de reducció i li cal per fer aquesta transformació 24 ATPs, per tant a la cèl·lula li costa doncs una part important la seva despesa energètica en fixar nitrogen però globalment li compensa per la amplia disponibilitat que hi ha d’aquest nitrogen en l’atmosfera i perquè va lligat a relacions de simbiosi entre el microorganismes i la planta.
Aquesta tipus de fixació només la poden fer els microorganismes que tenen el complex nitrogenasa, és un complex enzimàtic clau. Són dos enzims amb activitat nitrogenasa que actuen de forma seqüencial. De fet el mecanisme no es coneix al 100%.
Les procariotes que tenen la capacitat de fixar el nitrogen són diferents representants dels diferents metabolismes que hem vist i dels que veurem. És un grup divers, no el podem associar a un habitat o entorn concret i específic. Evolutivament alguns procariotes amb mantingut i and desenvolupat aquesta capacitat. En la taula de dalt tenim alguns exemples de organismes fixadors de nitrogen.
- Grup d’organismes de vida lliure aerobis (que no estan en una relació de simbiosi): Tenim organotrofs que utilitzen compostos orgànics (Azotobacter, Klebsiella), fototrofs (Cianobacteris), quimiolitotrofs (Quimiobacilus).
- Grup d’organismes de vida lliure anaeròbis: tenim quimiorganotrofs (clastridium), fototrofs (bacteris del sofre, verds, porpra, Heliobacteris... ) quimiolitotrofs (arqueas).
- Simbiosi: Plantes lleguminoses (Rizobium) i a plantes no lleguminoses (Frankia).
Com vam dir abans, els microorganismes que poden fixar nitrogen són els que tenen aquest complex nitrogenasa o també es diu Di-nitrogenasa. El model que s’ha explicat és que és com una mena de cadena d’electrons, un sistema d’oxidació reducció on participen diferents elements i que al final hi haurien aquestes dues nitrogenases que passarien de reduïda a oxidada, la segona nitrogenasa es reduiria i s’oxidaria i finalment, d’alguna manera, el que actuaria com a acceptor seria el nitrogen molecular, agafaria els electrons i els hidrògens per ser reduït a amoníac. Aquesta reacció, el mecanismes detallat, intrínsec, de com es passa de nitrogen molecular a amoníac, es coneixen les seves característiques metabòliques, enzims, elements... però cóm aquest nitrogen molecular es transformat a amoni és el que no es coneix. A dalt tenim una hipòtesi de com seria. No és una reacció fàcil i la cèl·lula a d’aportar força energia, li implica un aport de 24 ATPs.
A nivell de mecanismes concret d’aquest metabolisme, els enzims que estan implicats a part de la nitrogenasa (element central), primer ha d’haver un donador d’electrons (un compost que s’oxidi), un exemple és el piruvat, però no és l’universal per tots els fixadors de nitrogen, si es d’un fotosintètic podria ser el Fotosistema I. El receptor intermediari és la flavodoxina (o ferredoxina), els dos tenen Fe i S. El piruvat quan s’oxidi a AcetilCoA cedirà als electrons a la flavodoxina i es reduirà. Després ja entra en lloc la Di-Nitrogenasa. 1r actua la primera que agafa els electrons de la flavodoxina i passa per aquests dos enzims fins arribar a l’acceptor que és el N2.
Aquestes di-nitrogenases no només poden utilitzar el nitrogen, també poden fer altres transformacions com pot ser el pas de C2H2 a C2H4 o de protons a hidrogen molecular. No és exclusiva aquesta activitat enzimàtica pel nitrogen, sinó que també serveix per altres substrats. Evidentment el interès principal és la del nitrogen.
Aquest complex di-nitrogenasa està codificat per l’operó nif (una sèrie de gens en tàndem). La regulació d’aquest operó és força complex perquè aquesta activitat respon quan hi ha tota una sèrie de senyals externes, diuen que poden haver una sèrie de relacions de simbiosi amb les plantes... per tant és complex. Si nosaltres poguéssim agafar aquest gens del bacteri i traslladar-ho al DNA de les plantes estaria molt bé perquè així elles directament podrien fixar nitrogen.
Possibles donadors d’electrons depenent de quin bacteri sigui. També tenim la complexitat de l’enzim, és l’estructura del centre de reacció de la nitrogenasa. Al centre actiu també hi ha Fe i S.
Una forma fàcil de detectar microorganismes fixadors de nitrogen és precisament al analitzar la capacitat de transformar l’acetilé en Etilé com s’ha comentat abans. Això és una eina que s’utilitza molt en la caracterització dels diferents microorganismes que són fixadors de nitrogen.
Això és tan fàcil com agafar la mostra de l’entorn i després d’un temps d’incubació on ha d’haver acetilé després s’estudia per cromatografia de gasos la desaparició de l’acetilé i l’aparició del etilé.
Hi ha microorganismes molt diversos, ens podem trobar aerobis i anaerobis. Tenim un problema, perquè resulta que la di-nitrogenasa està inhibida per l’oxigen, això passa en aerobis òbviament, en els anaerobis no hi ha cap problema però en els aerobis si que ho és.
S’ha vist que s’han anat desenvolupant diferents estratègies per fer possible el funcionament de la dinitrogenasa en presència d’oxigen en aquest bacteris que tenen la necessitat absoluta de fer metabolisme amb oxigen.
Quin sistema s’ha desenvolupat pels aerobis per fer front a aquesta inhibició per part de l’oxigen al complex nitrogenasa? - Per exemple, els Azobacters, el que ha desenvolupat és un consum molt ràpid de l’oxigen, té una cadena electrònica molt ràpida, per tant, això és lo que s’anomena un mecanisme de protecció pel fet que es consumeixi l’oxigen molt ràpidament, fa que l’oxigen no tingui temps a entrar en contacte amb el complex di-nitrogenasa.
- Una segona estratègia interessant és la dels Cianobacteris fixadors de nitrogen, i és que han desenvolupat un tipus de cèl·lula especialitzada. A banda de la cèl·lula vegetativa normal han desenvolupat unes cèl·lules que només es dediquen a fixar nitrogen i s’anomenen heterocists.
En la imatge de dalt tenim l’exemple d’això, es pot veure com hi ha aquestes cèl·lules diferenciades de les altres que només s’encarreguen de la fixació de nitrogen atmosfèric. Aquestes cèl·lules només tenen els elements dels complex nitrogenasa i hi ha una transferència bilateral entre la cèl·lula vegetativa (amb PS que generen intermediaris donadors d’electrons com pot ser l’aldehid) i l’heterocist on es transferirien aquests donadors d’electrons i cedirien els electrons al complex. Al final de la reacció de la nitrogenasa podem obtenir glutamina al heterocist que pot anar a les cèl·lules vegetatives per altres funcions.
Finalment els Rhizobium capten l’oxigen per leghemoglobina. És una simbiosi amb les plantes. És el model més estudiat i on trobem més informació. La captació de l’oxigen en aquest cas per a que no li sigui tòxic a la nitrogenasa es fa mitjançant la leghemoglobina (proteïna transportadora d’O2). Aquesta proteïna és sintetitzada en col·laboració de la planta i del bacteri.
Aquesta proteïna POST-sintetitzada entre planta i bacteri, que li permet al bacteri mantenir la seva nitrogenasa lliure d’oxigen, doncs es una part de la relació simbiòtica.
La leghemoglobina lo que fa és captar aquest oxigen i només l’allibera en quantitats petites al final de la cadena electrònica on ràpidament és transformat en aigua i per tant aquest no es dissipa en concentracions elevades a l’interior de la cèl·lula i no inhibeix la nitrogenasa.
El cas de Rhizobium seria aquest cas de simbiosi per la protecció de l’oxigen es fa mitjançant la síntesi de la leghemoglobina, el bacteri sintetitza la part leghemo (el grup hemo) i la planta la part globina.
La simbiosi consisteix en que el bacteri fixa el nitrogen i li transfereix part de l’amoni que produeix a partir d’aquest nitrogen atmosfèric que capta, per tant, la planta té un benefici, i el bacteri també incorpora nutrients que li venen de la planta. Aleshores això és el principal avantatge que tenen planta i bacteri, però també, relacionat amb la protecció contra l’oxigen pel sistema nitrogenasa hi havia una coproducció de la síntesi d’una proteïna que es diu leghemoglobina que una part es sintetitzada per la planta i l’altra pel bacteri.
En aquesta imatge tenim representada la leghemoglobina com Lb i també la O2-Lb que és la leghemoblobina oxigenada i estaria just a la membrana del bacteri, a la part periplasmàtica de tal manera que pugui actuar com a acceptor d’electrons, perque és un microorganismes aerobi, però evita que aquest oxigen que queda anclat a la Lb no es dissipi per les cèl·lules i que augmentin les concentracions d’oxigen que serien nocives pel complex di-nitrogenasa que està al citoplasma.
Agrupacions d’aquests bacteris s’incorporen en forma de nòduls que es formen en les arrels de les plantes lleguminoses. Aquests nòduls, si els tallem i fem un fotografia al microscopi electrònic tindríem una gran població de bacteris a dintre d’aquests nòduls. En aquestes estructures és on té lloc aquest intercanvi simbiòtic.
Aquests bacteris es diuen bacteroides, perquè no són bacteris de vida lliure. Entre aquest bacteroides es pot donar un intercanvi directe de nutrients, precisament perquè aquests bacteroides estan encertats dins del teixit de la planta. La planta fa fotosíntesi, obté nutrients que alguns poden passar al bacteroide. Aquest bacteri com que és aerobi farà cicle de krebs, utilitzarà la via de la cadena d’electrons per produir energia, on l’últim acceptor serà l’oxigen, que en aquest cas li proveirà la leghemoglobina. Lo que farà el bacteroide amb la nitrogenasa es incorporar el nitrogen atmosfèric i fixar-lo en forma d’amoni; a partir d’aquí es formaran diferents intermediaris com poden ser amides, ureides... o el propi amoni.
Cóm es duu a terme aquesta simbiosi entre la planta i el bacteri? (vídeo) Tenim el Rhizobium que està envoltant aquestes arrels de les plantes, i la planta lo que fa es secretar una sèrie de compostos químics (família dels flavonoides) que estimulen el creixement de Rhizobium, d’alguna manera la planta li facilita el creixement de Rhizobium al voltant de les seves arrels secretant els flavonoides. Per tant, els bacteris poden metabolitzar, poden créixer, i una altra densitat de població podem trobar tot al voltant de les arrels de la lleguminosa. A de més, aquest flavonoides indueixen l’expressió d’una sèrie de gens de Rhizobium que regularan òbviament tot el procés de formació dels nòduls. Concretament aquest gens estan tots al plàsmid 5 i aquests gens ens diuen gens nod (nod de nòdul).
Els flavonoides s’uniran al primer gen nod D i llavors es quan s’activa pròpiament i activa la transcripció de tots els altres gens de l’operó. Per tant, hi ha un primer gen que activa als altres i comença a funcionar quan s’uneix el flavonoide. Aquests gens nod transcriuran per enzims que permeten la síntesi de el que s’anomena el factor nod, que es la senyal que envia el bacteri a la planta per que comenci la formació d’aquests nòduls.
En les puntes de les arrels hi ha unes proteïnes glicosilades, proteïnes que tenen diversos carbohidrats, que són les lectines i són les que permeten la unió del factor nod amb l’arrel de la planta. La planta, quan s’adhereixen aquests bacteris el que fa és el que seria com un mecanisme de incorporar el que podria detectar com un risc d’infecció, els atraparia i per tant aquest bacteroides es quedarien inserits al interior de la planta i anirien formant aquests nòduls que parlàvem abans.
...