Tema 1. Causes de la variació fenotípica (2016)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Genética - 3º curso
Asignatura Diagnòstic Genètic Molecular
Año del apunte 2016
Páginas 39
Fecha de subida 31/03/2016
Descargas 5
Subido por

Vista previa del texto

TEMA 1. CAUSES DE LA VARIACIÓ FENOTÍPICA 1. COMPONENTS DEL VALOR FENOTÍPIC Els éssers vius presenten un elevat grau de variabilitat, tant intraespecífica com interespecífica. Tota aquesta variació es descompon en els següents components: Aquesta fórmula expressa que el valor fenotípic (VP) és la suma del valor genètic (VG) i del valor ambiental (VE). Aquests dos valors poden ser tant negatius com positius. Aleshores, la variabilitat fenotípica té un origen genètic i un origen ambiental. Qualsevol caràcter fenotípic (P), doncs, presentarà un valor genètic (G) i un valor ambiental (E), però poden ser molt variables. Al següent gràfic podem veure diverses malalties amb la importància que tenen tant el valor genètic com l’ambiental pel que fa a la manifestació de la malaltia en qüestió. Explicació del gràfic: • • • Malalties de l’extrem esquerra (distròfia muscular de Duchenne o hemofília). Aquestes malalties tenen un component genètic molt elevat, aleshores, l’efecte de l’ambient en quant a la manifestació de la malaltia serà irrellevant. Per tant, el marge d’efecte de l’ambient sobre el valor fenotípic és petit. Malalties del centre (estenosi pilòrica o dislocació de maluc). Aquestes malalties tenen un component genètic i ambiental amb una importància força igual, per tant, dependrà molt de l’ambient o del genotip de l’individu en qüestió. Per tant, en aquest cas, el grau de severitat serà força variable. Malalties de l’extrem dret (tuberculosi o escorbut). Aquestes malalties tenen un component ambiental molt elevat, aleshores, l’efecte del component genètic en quant a la manifestació de la malaltia serà irrellevant, dependrà pràcticament en TEMA 1. Causes de la variació fenotípica 1 la seva totalitat de l’ambient. Per tant, el marge d’efecte del component genètic és petit. La resposta que dóna un organisme no és la mateixa que la que dóna la resta de la població, perquè hi ha individus que responen d’una forma o d’una altra a una malaltia tot i estar molt influenciada per l’ambient. Aleshores, a l’hora de diagnosticar una malaltia a un individu, hem de tenir en compte el pes de cada component per tal de poder calcular correctament la possibilitat de manifestar la malaltia i el seu grau de severitat. Pel que fa al component genètic (G), es pot descompondre en: • Valor genètic additiu. Correspon a l’efecte dels al·lels. • Valor genètic no additiu. Correspon a l’efecte de la seva combinació. 1. 1. MALALTIES HUMANES. RELACIÓ COMPONENT AMBIENTAL – COMPONENT GENÈTIC Al gràfic que tenim a continuació es troba representada la posició de les diferents malalties humanes respecte el paper relatiu que hi juga l’ambient i els loci amb la manifestació patològica d’aquesta malaltia. Podem veure que hi ha malalties com la de Tay-Sachs o la distròfia muscular de Duchenne, casos en que la influencia de la resta de loci de l’individu és molt irrellevant, ja que el component genètic és molt important i bàsicament depèn del valor additiu (efecte dels al·lels). Per tant, el diagnòstic d’aquest tipus de malalties és molt fàcil, ja que no trobem un efecte de l’ambient considerable. També podem veure casos on l’efecte de l’ambient és molt important i el valor additiu és bàsic: manifestació del caràcter en funció de l’ambient tot i tenir l’al·lel que origina la malaltia. Per altra banda, trobem malalties com la fenilcetonúria, que és un cas intermedi que depèn d’altres loci i de l’ambient per igual. TEMA 1. Causes de la variació fenotípica 2 1.2. CAS DE LA FENILCETONÚRIA La fenilcetonúria és una malaltia que es causada per mutacions al gen de la fenilalanina hidroxilasa (PAH). Aquest gen codifica per l’enzim PAH, enzim encarregat de catalitzar la reacció que passa de fenilalanina a tirosina. Mutacions en aquest gen poden arribar a causar que aquest enzim se sintetitzi en petites quantitats, que sigui defectuós o directament la seva absència. Nosaltres no som capaços de sintetitzar la fenilalanina de manera endògena, per tant, l’hem d’incorporar mitjançant la dieta. Aleshores, si no incorporem fenilalanina amb la dieta, no importa tenir l’enzim funcional o no. En conseqüència, aquestes persones que tenen l’enzim defectuós, el que fan és acumular fenilalanina perquè no la poden degradar i a la vegada, aquesta acumulació també comporta efectes secundaris per l’impossibilitat de no generar tirosina. L’excés de fenilalanina pot ser contrarestat per mecanismes metabòlics alternatius d’eliminació, desfent aquest excés. Aquestes grans quantitats de fenilalanina passen al sistema nerviós, s’acumulen al cervell i deriva en grans problemes cognitius del malalt (manifestació de la malaltia) fins arribar al punt de poder conduir a la mort. En principi, és una malaltia monogènica autosòmica recessiva i en funció del genotip de l’individu per aquest gen, aquest patirà fenilcetonúria o no. Les alteracions que es poden produir es donen a diferents nivells. Per una banda, intervenen els al·lels implicats en la manifestació de la malaltia, la dieta i altres loci (gens que estiguin implicats en el metabolisme alternatiu que elimina l’excés de fenilalanina) i els gens codificants per proteïnes implicades en el transport de fenilalanina al cervell. La forma de detectar aquesta malaltia és punxant el taló del nounat i així mirar els diferents nivells metabòlics. Per altra banda, es pot detectar tant a nivell genètic, Diagnòstic genètic molecular enzimàtic, metabòlic i cognitiu. DIAGNOSIS L’efecte fenotípic d’aquesta malaltia dependrà del valor additiu i de la dominància, de l’ambient i de la resta de loci (gens implicats en el metabolisme alternatiu per l’eliminació de la fenilalanina). Si ens volem anticipar al diagnòstic de la malaltia, el que s’ha de fer és un estudi genètic, estudiant les variants al·lèliques del gen PAH i els gens implicats en el metabolisme alternatiu. Phenylalanine hydroxylase [A] [D] [E] [I] DISEASE Components del valor fenotípic TEMA 1. Causes de la variació fenotípica 3 No obstant això, el component ambiental té una gran importància. Si no tenim una font de fenilalanina externa, no s’acumularà. Per tant, una solució és subministrar una dieta en absència de fenilalanina per tal de reduir els efectes de la patologia. Tot i que es tracti d’una malaltia monogènica, no és tan senzilla com el fet de diagnosticar si un determinat al·lel d’un gen es troba en homozigosi o heterozigosi, ja que hi ha altres components que hem de tenir en compte a l’hora de fer prediccions sobre la patologia i el grau de manifestació d’aquesta. Per realitzar el diagnòstic, normalment s’estudia directament el gen principal, però a més, hem d’anar complementant amb informació d’altres gens per veure si ha més loci implicats en la severitat de la malaltia. 1.3. HETEROGENEÏTAT GÈNICA I COMPLEXITAT Si representem l’efecte dels diferents components que afecten al fenotip de l’individu, ens trobem en els següents casos: I.
II.
III.
Cas de les malalties monogèniques. Es tracta d’aquella situació en que un al·lel d’un gen determinat presenta un valor genotípic molt important pel que fa a la manifestació de la malaltia. Ara bé, podem trobar al·lels moduladors, que poden augmentar o disminuir aquest efecte, però la manifestació del tret fenotípic Diagnòstic genètic molecular bàsicament depèn d’un al·lel. Cas de malalties oligogèniques. Es tracta d’aquelles malalties que poden ser originades per diversos gens. Cas de malalties poligèniques. Es tracta d’aquelles malalties que són originades per una quantitat de gens molt elevada. A mesura que hi ha més gens implicats, l’efecte de cadascun és menor, però es va complicant la seva manifestació fenotípica, és a dir, la predicció sobre el desenvolupament de la malaltia és més complexa. DSV: DNA sequence variant Amb molta freqüència ens trobarem en situacions d’heterogeneïtat gènica. En aquests Components del valor fenotípic casos, si volem realitzar un diagnòstic eficaç, hem d’identificar les variants al·lèliques dels gens implicats per poder estudiar el seu efecte i arribar a una conclusió. TEMA 1. Causes de la variació fenotípica 4 Pel que fa a les malalties monogèniques, les variants al·lèliques que intervenen en la manifestació de la malaltia són estranyes, i per tant, la seva prevalença sol ser baixa. Per contra, a mesura que hi ha més gens implicats en la severitat de la malaltia, la prevalença va augmentant. Per tant, les malalties poligèniques són les més comuns i complexes de diagnosticar. 1.4. RESPOSTA DAVANT UNA MALALTIA I EFECTE LLINDAR Juntament amb les proteïnes implicades en la manifestació de la malaltia, hi ha molts factors ambientals que tenen una aportació important en quant al desenvolupament del fenotip patològic. És a dir, ens trobem en la situació que hi ha dos tipus de predisposicions Diagnòstic genètic molecular pel que respecta a la manifestació de la malaltia: Número d’individus Llindar Sa Malalt Susceptibilitat a la malaltia Predisposició genètica. Fa referència • a tots els gens implicats en el desenvolupament de l’estat patològic. Predisposició ambiental. Aquesta • predisposició comporta que en qualsevol ambient en el que es trobi la persona en qüestió, hi haurà un risc més alt de desenvolupar la malaltia. Components del valor fenotípic Per altra banda, la resposta de cada individu enfront la malaltia és diferent. Ens trobem amb l’efecte llindar, que és la predisposició a manifestar el caràcter que sol tenir una distribució normal. Podem veure en la imatge superior, que a partir d’un cert punt, els individus començaran a desenvolupar la malaltia. El fet d’estar en un punt o un d’altre, depèn d’una combinació dels factors genètics i dels ambientals. Ambdues predisposicions són presents i no es manifesten fins arribar al llindar. Quan s’estudien pedigrís és molt fàcil trobar persones amb el mateix genotip però prendre conclusions es fa difícil per l’efecte de l’ambient. És a dir, trobem persones amb el mateix genotip, però unes desenvolupen la patologia i altres no. Així doncs, a l’hora de diagnosticar s’ha de tenir en compte s’han de tenir en compte múltiples components i s’han d’estudiar diversos subjectes. Per altra banda, s’han d’estudiar diferents aspectes: modificacions a la cromatina, alteracions a l’RNA, diferents expressions gèniques, modificacions al DNA, variacions al·lèliques de diferents gens, micro RNA’s, etc. A mesura que una malaltia és més complexa, doncs, necessitarem més ítems per poder estudiar el risc a desenvolupar-la. TEMA 1. Causes de la variació fenotípica 5 1.5. INTERACCIÓ GENOTIP-AMBIENT Podem estudiar la interacció entre genotip i ambient a partir dels valors additius de cadascun d’ells. Ens podem trobar els següents casos: Cas I. E = 0; P = G. Com en aquest cas l’efecte de l’ambient és nul, el desenvolupament del caràcter depèn únicament del component genètic, per tant, tot i modificar les condicions ambientals (augment de la temperatura en el gràfic), el desenvolupament del caràcter no es veu afectat. • Cas II. G = 0; P = E. En aquest cas, el component genètic és equivalent a zero, per tant, el desenvolupament del caràcter (altura) dependrà únicament de l’ambient, independentment del genotip de l’individu. Per tant, podem veure que en diferents condicions ambientals Cas III. P = G + E • genètic Diagnòstic molecular. En aquest cas, l’ambient afecta de la mateixa forma als individus de diferents genotips, per tant, podem veure que el caràcter es desenvolupa seguint les mateixes premisses pels individus de cada genotip. • Cas IV. P = G + E + GxE. En aquest cas, P = G + E + GxE hi ha una interacció entre genotip i ambient, per tant, això ocasiona que un genotip interaccioni amb l’ambient P=G+E (G1) i un altre que no (G2) i d’aquí veure les diferències en quant al desenvolupament del caràcter. Per tant, l’ambient afecta més a un P=E G=0 genotip que a l’altre. • P=G E=0 Components del valor fenotípic 1.6. EXEMPLES D’INTERACCIÓ GENOTIP-AMBIENT A continuació podem veure el risc relatiu, en funció del genotip, de tres malalties diferents les quals estan influenciades per l’efecte de l’ambient: • • Xeroderma pigmentada (XP). En aquest cas, veiem que si els individus no estan exposats a l’efecte de l’ambient perjudicial, no patiran la malaltia (tot i que els que tenen el genotip implicat en la patologia, és molt difícil que es mantinguin fora de l’exposició solar tota la seva vida). Per altra banda, si els individus s’exposen a la llum solar però no tenen el genotip implicat en la malaltia, difícilment tindran problemes (a no ser que l’exposició sigui molt elevada). Per contra, els individus que són portadors del genotip en qüestió, al exposar-se a la llum solar, presentaran un risc de patir xeroderma pigmentada molt elevat. Fenilcetonúria (PKU). Pel que fa a aquesta malaltia, si l’individu porta el genotip que no està relacionat amb la malaltia, no manifestarà els efectes de la TEMA 1. Causes de la variació fenotípica 6 • fenilcetonúria, independentment de la dieta. Ara bé, ens podem trobar els dos casos següents: o Portadors del genotip afectat però tractats amb una dieta sense fenilalanina. En aquest cas, com els individus són tractats amb dietes que no presenten fenilalanina, no manifestaran els efectes de la fenilalanina ja que aquests sorgeixen davant l’impossibilitat de poder dur a terme la reacció enzimàtica per passar de fenilalanina a tirosina. Aleshores, el risc relatiu de patir els efectes, serà el mateix que el que tenen els individus portadors del genotip sa pel que fa a aquesta malaltia. o Portadors del genotip afectat però seguint una dieta que conté fenilalanina. Per contra, en aquest cas, com els individus ingereixen aliments amb fenilalanina, patiran les conseqüències de la fenilcetonúria. Enfisema. És una malaltia pulmonar que malmet els sacs aeris (alvèols), provocant que els pulmons siguin menys capaços d'expandir-se i de contraure's degut a una pèrdua d'elasticitat. Per tant, podem veure que el fet de fumar augmenta el risc relatiu de patir la malaltia tant si la persona presenta el genotip “sa” (risc moderat) com si presenta el genotip alterat (risc molt elevat). Per altra banda, ens trobem amb el cas de persones no fumadores però portadores del fenotip afectat, i per tant, tenen un risc relatiu moderat de patir la malaltia. Per acabar, les persones que presenten el genotip “sa” i que no són fumadores, no tenen un risc elevat de patir la malaltia (risc igual a 1). 1.7. CAS DE L’HIPERTROFIA CARDÍACA L’hipertrofia cardíaca és una malaltia que pot arribar a desenvolupar-se un cop ja s’ha fet l’estudi o simplement que no es desenvolupi tot i presentar una predisposició genètica. Es tracta d’una malaltia complexa. Per tant, s’ha d’intentar buscar tota la informació possible perquè hi ha molts factors que juguen un paper important en el seu desenvolupament, tal i com veiem a la imatge següent: TEMA 1. Causes de la variació fenotípica 7 2. CAUSES DE LA VARIACIÓ FENOTÍPICA Diagnòstic genètic molecular Les causes de la variació fenotípica poden ser degudes a canvis genètics i/o canvis epigenètics. Manca Abans de res, cal recordar que una malaltia és una variant que afecta a la població. Poca qu A continuació, podem veure les diferències d’altura entre tres germans. Aquesta diferència d’alçada (enanisme) és causada per la manca d’una proteïna (hormona del creixement, GH). Major q proteïn Les malalties es poden originar per les següents causes: • • • • Manca de proteïna. Poca quantitat de proteïna. Es tracta de malalties en les quals l’individu afectat no presenta el desenvolupament esperat, tot i que en presenta un cert grau. de laquals variació fenotípica Major quantitat de proteïna. Es tracta de malalties Causes en les els individus afectats presenten un desenvolupament molt més elevat del que s’esperaria. Proteïna alterada o diferent. Es tracta de malalties en les quals la proteïna es troba alterada o ha adquirit una nova funció. 2.1. CANVIS GENÈTICS Les proteïnes estan codificades al DNA, el qual es transcriu a RNA. A partir de l’RNA es dóna el procés de traducció i obtenim les proteïnes. En la gran majoria de casos, l’alteració de les proteïnes en quant a funció i la seva quantitat és deguda a mutacions que afecten a diferents punts de la seqüència gènica de la mateixa. És a dir, es produeixen canvis que afecten a les seqüències de nucleòtids. un canvi en la seqüència nucleotídica Aquests canvis s’anomenen mutacions, i per tant, Diagnòstic genètic molecular és un canvi genètic que pot produir un canvi fenotípic. A més, moltes vegades podem identificar mutacions estudiant la seqüència de l’RNA. DNA RNA Proteïna traducció transcripció canvi fenotípic mutació canvi genètic Causes de la variació fenotípica Canvis genètics TEMA 1. Causes de la variació fenotípica 8 Proteïn diferen 2.1.1. Nomenclatura dels al·lels S’ha establert una nomenclatura dels al·lels en funció de l’alteració que provoquen a la proteïna. D’aquesta manera: • • • • Al·lels nuls o amòrfics. Al·lels que donen lloc a una manca de proteïna. Al·lels hipermòrfics. Al·lels que donen lloc a una major producció de proteïna. Al·lels hipomòrfics. Al·lels que donen lloc a una menor producció de proteïna. Al·lels neomòrfics. Al·lels que donen lloc a proteïnes alterades o diferents. 2.1.2. El gen eucariota El gen eucariota es divideix en: • • • • • • Regió upstream. Conté els enhancers (elements de control distal). Elements de control proximal. Promotor. Introns i exons. Cua Poly-A. Regió downstream. Conté la part final del gen. La seqüència codificant de la proteïna es troba a les seqüències exòniques. La majoria de mutacions causants de malalties van associades a exons. El blanc principal de les mutacions se centra en els exons i el millor diagnòstic es pot obtenir a nivell de seqüència. A més, el fet d’estudiar l’exoma comporta un estalvi econòmic força important. El que es fa en la gran majoria de casos és seqüenciar els exons de diferents gens ja que Diagnòstic genètic molecular aquests representen un 1-2% del genoma, és a dir, una part molt petita d’aquest. El gen eucariota Ara bé, cada cop es posa de manifest que hi ha moltes mutacions alienes a les seqüències exòniques que originen malalties. Enhancer (distal control elements) Proximal control elements Exon Intron Exon Intron Poly-A signal Termination sequence region Exon DNA Upstream Primary RNA transcript 5 (pre-mRNA) Downstream Promoter Transcription Exon Intron Intron RNA Poly-A signal Exon Intron Exon Cleaved 3 end of primary transcript RNA processing: Cap and tail added; introns excised and exons spliced together Coding segment mRNA 3 5 Cap 5 UTR (untranslated region) Start codon Stop codon Poly-A 3 UTR (untranslated tail region) Causes de la variació fenotípica Canvis genètics TEMA 1. Causes de la variació fenotípica 9 2.1.3. Codons i canvis sinònims i substitucions que afecten als codons Per altra banda, que es produeixi una mutació en un exó no implica un canvi d’aminoàcid Diagnòstic genètic molecular el codi genètic és degenerat. Per tant, molts a l’estructura proteica. Això és degut a que canvis canvien el codó però no l’aminoàcid, i aquests s’anomenen canvis sinònims. Al no canviar el significat del codó, la seqüència d’aminoàcids serà la mateixa i no s’alterarà ni la funció ni la quantitat de proteïna en qüestió. És a dir, un canvi en la seqüència codificant del DNA no implica sempre un canvi en la seqüència d’aminoàcids de la proteïna codificada pel gen. Codons sinònims Els codons sinònims són els següents: substitucions que afecten als codons Les són les següents: Un canvi en la seqüència codificant del DNA no implica sempre un canvi en la seqüència d’aminoàcids de la • Mutació silenciosa. Aquestes mutacions són causades per canvis sinònims. Es proteïna codificada pelno gen tracta de mutacions que fan soroll i que només es poden detectar si se seqüencia el fragment de DNA. Si s’analitza la seqüència de DNA, es trobarà el Causes decanvi però com no tindrà cap efecte, el sentit del codó no es veurà afectat. la variació fenotípica Canvis genètics • • • Mutació neutra. Es basa en el canvi d’un aminoàcid per un altre de característiques similars. Si es produeix un canvi d’aminoàcids el més probable és que doni lloc a un aminoàcid de característiques semblants a l’original i per tant, no hi haurà un canvi fenotípic important en el qual la selecció natural hi pugui actuar ni en contra ni a favor. Per tant, són mutacions que passen desapercebudes. Mutació de canvi de sentit. Es basa en un canvi d’aminoàcid per un altre de característiques diferents. En aquest cas, segur que canviarà l’estructura i en funció del lloc, també la funció de la proteïna. Aquestes mutacions es produeixen quan es donen canvis als exons. Mutació sense sentit. Aparició d’un codó de finalització. Hi ha softwares que detecten els canvis en les seqüències de DNA i fan la predicció de les implicacions de les diferents mutacions. En principi esperaríem que les mutacions de canvi de sentit i sense sentit fossin les que provoquin un major efecte i que siguin les que donin lloc a les malalties que estiguem estudiant, canviant els exons i per tant, alterant la funció i estructura de la proteïna. És fàcil trobar mutacions en al·lels nuls o en al·lels neomòrfics, ara bé, es donen situacions més complexes on el que és aparent ho deixa de ser i per tant, l’estudi no és tan senzill. TEMA 1. Causes de la variació fenotípica 10 2.1.4. Punts d’splicing alternatiu – Alteració de l’splicing al gen LGMD2A En termes generals, esperem que l’efecte resultant d’una mutació que origina un canvi sinònim sigui innocu. Ara bé, hi ha casos en que la variant al·lèlica que origina la malaltia es tracta d’una mutació que dona lloc a un codó sinònim. Un exemple és la substitució d’una citosina per un timina al gen LGMD2A, situació en la que no canvia el sentit (mateix aminoàcid), però dona lloc a l’aparició d’un punt d’splicing alternatiu. Diagnòstic genètic molecular És aquí on sorgeix el terme de punts críptics d’splicing alternatiu, que són aquells punts silenciosa noacabar és tanesdevenint “silenciosa” en els quals Una si es mutació produeix una mutació que poden en un punt d’inici Alteració de l’splicing al gen LGMD2A d’splicing. Aquest exemple mostra una mutació que es va identificar en el gen LGMD2A d’un pacient de distròfia muscular. La mutació es va produir en la tercera posició de la base d'un codó i semblava ser una mutació silenciosa que donaria lloc a la substitució d'un codó de glicina (GGC) per un altre codó de glicina (GGT). No obstant això, va resultar una mutació que Causes de la variació fenotípica Canvis genètics originava una patologia. Els resultats de la substitució va derivar en l’activació d’un punt d’splicing amb la pèrdua de la seqüència de la proteïna que codificava aquest gen. A més, Diagnòstic genètic molecular es va produir un canvi de marc de lectura, convertint el final de l’exó 16 en un nou intró, Synonymous mutations tal i com veiem a la imatge. e la variació fenotípica 2.1.5. Exemples de malalties originades per mutacions sinònimes Aquest fet pot donar lloc a proteïnes no funcionals (tal i com veiem a la imatge següent), com si es tractés d’una mutació silenciosa. Cada cop s’identifiquen més casos d’aquestes mutacions en múltiples malalties. TEMA 1. Causes de la variació fenotípica 11 Canvis genètics En altres casos, aquestes mutacions silencioses no afecten als processos d’splicing però sí a l’estabilitat del precursor de l’mRNA o al propi mRNA, degut a que adquireixen una estructura secundària i/o terciària que impossibilita la seva estabilitat. Aleshores, al tenir tan poca estabilitat, molts mRNA’s es degradaran i la quantitat de missatger i producte, respecte l’estat “normal”, baixarà, donant lloc a un al·lel hipomòrfics (degut a que hi haurà menys mRNA’s i se’n traduirà una quantitat menor perquè la gran majoria es degradaran). Per altra banda, moltes vegades dificulta l’inici de traducció i per tant, disminueix la taxa de traducció, donant lloc també a al·lels hipomòrfics. Podem trobar la variació a nivell de seqüència, podem analitzar el nivell de transcripció del gen i veurem que es transcriu amb la mateixa eficàcia però al mirar els nivells de proteïna (pel que fa a la quantitat), veiem que aquests són menors. Aleshores, el diagnòstic genètic molecular, ha de tenir en compte els nivells alterats pel que fa a la quantitat de proteïna. També pot afectar la velocitat i/o eficàcia a la que es tradueix el missatger. Per acabar, com podem veure a la taula de la pàgina anterior, hi ha malalties de les quals no se sap el seu origen. 2.1.5. Mecanismes i mètodes emprats en diferents causes de variació A continuació tenim una llista de causes de variació en l’expressió proteica. Podem veure els mecanismes implicats en els següents processos: I) II) III) Gens reguladors del processat del mRNA. Les mutacions sinònimes poden afectar a regions cis-reguladores crítiques: ⇒ Llocs d’splicing, ESEs i ESSs, arribant a canviar l’estructura primària de la proteïna. ⇒ miRNA i llocs d’unió de factors de transcripció en els exons que poden alterar els nivells d’expressió de gens reguladors. Estructura de l’mRNA. Mutacions sinònimes poden alterar l’estructura de l’mRNA: ⇒ L’RNA inestable es degrada molt fàcilment i per tant, baixa l’expressió de les proteïnes. ⇒ La regió 5’ és molt estable, aleshores l’inici de traducció és més difícil i en conseqüència l’expressió de les proteïnes és baixa. Síntesis proteica. Les diferències pel que fa a la síntesis proteica són degudes als elements que influencien la velocitat de traducció: ⇒ Codons sinònims. ⇒ Aminoàcids carregats positivament que interactuen amb la càrrega negativa de la subunitat 50s del ribosoma. ⇒ Estructura del mRNA. TEMA 1. Causes de la variació fenotípica 12 Els mètodes emprats per detectar els processos anteriors són els següents: Aleshores, els passos que s’han de seguir per tal de detectar les diferents alteracions, són els següents: • • • Estudiar a nivell de seqüència per trobar mutacions. Estudiar a nivell de transcripció per veure si el problema es troba a l’inici de transcripció o afecta a l’estabilitat. Estudiar a nivell de producte, tot mirant la quantitat de proteïna resultant. 2.1.6. Canvis en l’splicing – Creació d’un nou punt d’splicing Diagnòstic genètic es pot originar per una mutació silenciosa, canviant molecular La creació d’un nou punt d’splicing una base per una d’altra, en un punt críptic. D’aquesta manera, es pot generar un punt Canvis en l’”splicing” d’splicing alternatiu, tot modificant l’estructura del mRNA (afectant a la seva estabilitat) Creació d’un nou punt d’”splicing” i en conseqüència, l’expressió proteica. TEMA 1. Causes de la variació fenotípica 13 Causes de la variació fenotípica Canvis genètics Per dur a terme tot el processat del mRNA hi ha una sèrie de punts potenciadors, com Diagnòstic genètic molecular, que són reconeguts pel complex de tall i unió (spliceosoma) i que enhancers i promotors produeixen l’escissió del mRNA. Splicing Aquestes mutacions i canvis de nucleòtids que porten a la creació de punts nous d’splicing solen ser als exons, però cada vegada més, s’ha vist que també es poden produir en regions alienes als exons. A més, aquestes últimes solen ser les que provoquen les malalties. Per altra banda, també es poden produir als introns, modificant el processat del precursor proteic i ocasionant que certes regions de l’intró Canvis passin a formar part de l’exó, alterant l’estructura i la funció de la Causes de la variació fenotípica genètics proteïna (canvi de marc de lectura, on segurament s’originarà un codó STOP prematur donant lloc a una proteïna no funcional). A l’splicing alternatiu hi ha tota una sèrie de seqüències reconegudes per factors i proteïnes de l’spliceosoma que permeten l’escissió del mRNA. Per tant, mutacions que afecten als punts d’inici i reconeixement dels factors també poden alterar l’eficàcia en que es transcriu aquest intró i així conduir a alteracions dels missatgers, els quals es traduiran a partir d’aquests al·lels. S’han identificat moltes mutacions en introns que condueixen a canvis a l’splicing alternatiu. En alguns casos, aquestes mutacions donen lloc a un fenotip més sever que Diagnòstic genètic molecular severitat en altres. Normalment aquesta ve donada pel fet que no sempre que es doni una mutació que afecti a l’splicing tots els precursors tindran un splicing incorrecte, depèn del percentatge de mRNA aberrant. Aquest fet el podem veure a la taula que hi ha continuació: BMD, Becker muscular dystrophy; CF, cystic fibrosis; FD, familial disautonomia; MD, Menke disease; OHS, El fet que tot l’RNA no sigui aberrant significa que la proteïna manté la funció tot i que es occipital horn syndrome; PHD, pyruvate dehydrogenase deficiency; SMA, spinal muscular atrophy.
traduirà en menor quantitat (pel fet de tenir menys quantitat de RNA “sa”). Causes de la variació fenotípica TEMA 1. Causes de la variació fenotípica 14 Canvis genètics 2.1.7. Conseqüències dels canvis en l’splicing Les conseqüències de les mutacions que afecten a l’splicing alternatiu són les següents: Diagnòstic genètic molecular • • • Alteració de la estabilitat dels mRNA. Aquest fet deriva en la degradació Conseqüències dels canvisuna en quantitat l’splicingmenor de proteïna prematura del mRNA i per tant, tindrem traduïda. Alteració de la estabilitat dels mRNA Pèrdua de funció del producte gènic . Degut a que la seqüència està alterada i pot afectar a certs dominis de la proteïna. Pèrdua de funció del producte gènic Funció modificada del producte gènic. Aquest fet ocasiona la variació de substrat Funció modificada del producte gènic en funció del canvi originat. Causes de la variació fenotípica Canvis genètics 2.1.8. Mutacions de canvi d’splicing en altres regions - Paper del ncRNA en el càncer A més, podem trobar mutacions en les següents regions: Regió promotora del gen, alterant l’eficiència dels factors de transcripció, i per tant, a l’expressió del gen. • Regions promotores de ncRNA (RNA no codificant) que intervenen en el control de l’expressió del gen • Potenciadors que actuen allunyats de la regió promotora i així dificultar la formació de les interacció dels factors de transcripció. Diagnòstic genètic molecular • Altres loci allunyats del gen en qüestió. Les mutacions les podem trobar fora de l’estructura pròpiament del gen, és a dir, les podem trobar en altres loci força allunyats del gen que causa la malaltia. • Si disposem d’eines de seqüenciació de grans quantitats del genoma tindrem a disposició aquesta informació. Cada cop més s’utilitzen les tècniques de seqüenciació de nova generació, ja que permet analitzar una gran quantitat de seqüències. Ara bé, com més allunyat es trobi el canvi, més complex serà el seu anàlisi. Causes de la variació fenotípica Canvis genètics TEMA 1. Causes de la variació fenotípica 15 Per altra banda, es pot utilitzar la seqüenciació de targets, és a dir, estudiar només unes seqüències determinades (grup important de seqüencies) que es pensi que siguin les que afecten a aquella patologia. Diagnòstic genètic molecular Diagnòstic molecular tot i que s’ha Finalment, la seqüència de DNA és la que donarà tota genètic la informació, d’interpretar quin efecte tindrà el canvi d’aquesta seqüència en la funció del gen. Diagnòstic genètic molecular Paper en el càncer Causes de la variació fenotípica Causes de la variació fenotípica Canvis genètics Canvis genètics Estudiant diferents tumors s’ha vist que mutacions puntuals que afecten les regions promotores poden activar l’expressió d’oncogens silenciats o produir la pèrdua d’expressió de gens supressors de tumors perquè alteren la seva afinitat pels factors de transcripció. Per altra banda, trobem mutacions que afecten a nivell de miRNA implicats en el control de l’expressió gènica, ja que s’uneixen al RNA missatger. Algunes mutacions sinònimes, que en principi no haurien de portar problemes, poden afectar al punt de reconeixement del mRNA i alterar el control del que s’encarrega el miRNA sobre Causes de la variació fenotípica Canvis genètics l’expressió d’aquest gen. En conclusió, hi ha múltiples punts en els quals ens podem trobar alterada la funció del gen. TEMA 1. Causes de la variació fenotípica 16 2.1.9. Resum Si mirem l’esquema que hi ha continuació, podem veure els diversos productes en els quals hi pot haver modificacions: • • • • • • DNA. RNA. Proteïnes. snoRNA’s. ncRNA’s. miRNA’s. A més a més, algunes modificacions es poden produir en el ncRNA. Cada vegada més es van trobant nous RNA’s amb noves funcions. En general, als ncRNA’s se’ls classifica Diagnòstic genètic molecular segons la seva llargada, tal i com veiem a la taula que hi ha a continuació. Per altra banda, Diagnòstic genètic molecular també se’ls pot classificar segons el seu mecanisme i tipus d’acció: RNA no codificant (ncRNA) Més del 50% del genoma es transcriu L’ncRNA representa el 9798% de l’RNA transcrit L’ncRNA pot ser: • Estructural • Catalític • Regulador Causes de la variació fenotípica Diagnòstic genètic molecular Canvis genètics Hi ha una gran variabilitat de ncRNA’s relacionats en diferents funcions perquè cada Causes de la variació fenotípica vegada més es van trobant exemples de ncRNA’s implicats en malalties humanes i en altres organismes. Es important disposar de els tècniques que permeten posar de manifest l'alteració en l'expressió d'aquests RNAs. Canvis genètics Més del 50% del genoma es transcriu. L’ncRNA representa el 97-98% de l’RNA transcrit. L’ncRNA pot ser: estructural, catalític i regulador. TEMA 1. Causes de la variació fenotípica 17 Causes de la variació fenotípica Canvis genètics 2.2. CANVIS EPIGENÈTICS Diagnòstic genètic molecular DNA Els ncRNA’s dels que havíem parlat anteriorment estan implicats en processos de control DNA modificat epigenètic. cromatina modificada Els gens no s’expressen tots ni al mateix moment ni en totes les cèl·lules ni en totes les etapes del desenvolupament. És a dir, tenim molts gens que ja des del principi no s’expressen: són necessaris en diferents moments del desenvolupament. Durant el canvi fenotípic epimutació canvi epigenètic desenvolupament embrionari hi ha un procés de diferenciació en el qual les cèl·lules s’aniran especialitzant i formaran els diferents Causes de la variació fenotípica Canvis epigenètics teixits. Tota la informació que hi ha al DNA és informació potencial i se n’ha de tenir un control. Per poder realitzar aquest control, el nostre organisme té mecanismes de control d’expressió gènica que controlen quan és necessària l’expressió de certs gens. Aquests mecanismes de control es basen modificacions del material genètic, tant d’histones com de la cromatina juntament amb ncRNA’s que actuen com a mecanismes de control de l’expressió. Per tant, a partir d’un sol genoma obtenim molts epigenomes. Aleshores, si un gen no s’expressa és degut a un mecanisme de silenciament o activació del control genètic. Una substitució, és a dir, una alteració en la seqüència de DNA, és una alteració del material genètic que pot implicar un canvi fenotípic (i en conseqüència, una malaltia). Per tant, un canvi o una modificació química del DNA i les histones és un canvi epigenètic (modificacions en les histones o en la cromatina, metilacions del DNA, atracció de remodeladors, ncRNA’s, etc) que al mateix temps pot donar lloc a un canvi fenotípic i per tant, a una malaltia. Les malalties solen estar causades per una proteïna anòmala, que no s’expressa o que està en una quantitat inadequada. Per altra banda, com hem dit, els canvis epigenètics també poden modificar l’estat de les proteïnes. TEMA 1. Causes de la variació fenotípica 18 2.2.1. Canvis del material hereditari que causen canvis en l’expressió gènica Diagnòstic genètic molecular Canvis del material hereditari que causen canvis en l’expressió gènica Totes les nostres cèl·lules tenen la mateixa informació i aquesta és molt important. Si aquesta informació no es gestiona correctament, els gens s’expressarien a la vegada i hi hauria un descontrol del sistema. Les modificacions epigenètiques estan programades i són les que podran suprimir, silenciar o activar un determinat conjunt de gens. A mesura que les cèl·lules es diferencien i es donen els processos de remodelació de la cromatina, se suprimeix l’acció de gens o de grans blocs d’aquests (metilacions, modificacions de les histones, acció de RNA’s, acetilacions, etc). Causes de la variació fenotípica Canvis epigenètics Els gens necessaris per les funcions cel·lulars es van activant a mesura que han d’actuar i aleshores, obtindrem diferents tipus cel·lulars amb diferents epigenomes: no expressen les mateixes proteïnes ni en el mateix nivell. Encara que siguin processos controlats, es podran produir de manera esporàdica, alteracions d’aquests mecanismes de control, ocasionant conseqüències patològiques. Els principals canvis epigenètics es basen en metilacions del DNA, modificacions químiques de les cues de les histones, remodelacions de la cromatina (en quant a la seva estructura, més oberta o més tancada) i l’acció dels ncRNA’s, entre d’altres. La remodelació de la cromatina dóna estructures de la cromatina tancada (empaquetament elevat), se silencien aquestes regions fins al punt de silenciar grans blocs de gens. Ara bé, també es pot silenciar sense remodelar la cromatina mitjançant metilacions i modificacions químiques. En general, diferents modificacions a les histones i les metilacions al DNA són diferents a les regions de cromatina activa i inactiva. En funció de les mutacions químiques de la cromatina o del DNA, el gen no s’expressarà: control de silenciament o d’activació d’expressió dels gens. TEMA 1. Causes de la variació fenotípica 19 Generalment el silenciament d’un gen va associat a la hipermetilació del DNA (acció supressora dels gens d’aquella regió) i trobarem hipometilació del DNA i acetilació de les histones a les regions més actives de la cromatina. Les histones tenen un efecte de silenciament més làbil, és reversible; mentre que les modificacions del DNA, com per exemple les metilacions, tenen un efecte més fort i menys reversible. Les metilacions del DNA són les modificacions epigenètiques més estudiades i treballades a nivell de patologies, tot i que també s’estudien modificacions a les histones i remodelacions de la cromatina. 2.2.2. Metilacions de les citosines La modificació química del DNA més important és la metilació de les citosines del carboni 5 (C5). No tots els organismes tenen els mateixos mecanismes de metilació. Per exemple, en mamífers i humans, les metilacions de la citosina del C5 es troben sobretot als dinucleòtids CG. Aquest dinucleòtid és poc freqüent al genoma, però se sol trobar agrupat en determinades regions com són les illes CpG. Per tant, aquestes illes estan implicades en el control de l’expressió gènica i es troben a la regió promotora dels gens. Si es modifiquen aquestes illes, ens podem trobar en els següents casos: • • Hipometilació. Facilita l’associació del complex proteic d’inici de transcripció, per tant, afavoreix l’activació gènica. Hipermetilació. Supressió de l’associació del complex proteic d’inici de transcripció ocasionant dificultats a les polimerases per poder accedir-hi. Per tant, afavoreix el silenciament gènic. Per altra banda, també podem trobar situacions intermèdies, en les quals no s’inactivi totalment l’expressió del gen. A continuació, veurem alguns exemples de com funciona aquest mecanisme. Diagnòstic genètic molecular • Cas A) Metilacions de laanteriorment, • Transferència grups metílics Com bé s’ha explicat les metilacions es de donen a la citosina del C5, als C5 de concretament a la citosina corresponent al dinucleòtid CG (formant agrupacions les citosines mitjançant metiltransferases citosina denominades illes CpG). Aleshores, si s’hipermetila el DNA hi haurà un silenciament gènic i si s’hipometila es produirà un procés d’activació gènica. TEMA 1. Causes de la variació fenotípica 20 Diagnòstic genètic molecular Metilacions de la • Cas B) citosina • Transferència de grups metílics als C5 de les citosines mitjançant metiltransferases En aquest cas, trobem agrupacions de dinucleòtids CG unes 2 kb més enllà de la regió promotora (no tenen una densitat tan elevada en contingut CG com les illes CpG). Diagnòstic genètic molecular Les regions hipometilades corresponen a gens actius transcripcionalment i les regions hipermetilades a gens silenciats. El control de la gran majoria de gens específics de teixits es dona per aquest mecanisme. Metilacions de la citosina • Transferència de grups metílics als C5 de les citosines mitjançant metiltransferases Diagnòstic genètic molecular Metilacions • Transferència de grups metílics als C5 de • Cas C) de la les citosines mitjançant metiltransferases En aquest cas, els gens que són actius estan hipometilats pel que respecta la seva regió citosina promotora. Ara bé, les regions interiors del gen es troben hipermetilades (tant regions intròniques com exòniques), per tal d’evitar que es produeixin fenòmens d’splicing alternatiu i alteracions a les zones d’inici de transcripció. Si no es produís aquest fet, s’obtindrien transcrits aberrants. • Cas D) Causes de la variació fenotípica Canvis epigenètics En aquest cas trobem metilacions de les regions repetides (com per exemple, elements transposables). La hipermetilació bloqueja l’activitat de regions del DNA i les protegeix contra la inestabilitat genòmica, evitant trencaments, reordenacions i alteracions cromosòmiques. Aquest bloqueig s’ha de donar en regions concretes. Causes de la variació fenotípica Canvis epigenètics Causes de la variació fenotípica Canvis epigenètics TEMA 1. Causes de la variació fenotípica 21 2.2.3. Càncer En moltes malalties trobem implicats canvis epigenètics, tant a nivell de DNA com de proteïnes (cada vegada més s’incorpora l’anàlisi de proteïnes per detectar canvis d’aquestes, com per exemple, la cromatina). Ara bé, el camp on s’ha avançat més és l’oncologia: el càncer és una patologia conseqüència de diferents tipus de patologies que tenen certs aspectes en comú. Un d’aquests és el creixement descontrolat de les cèl·lules degut a una taxa de multiplicació superior a la pròpia del teixit on es troben. Per que es produeixin aquests canvis, trobem alterada l’expressió de certs gens: oncogens i gens supressors de tumors. Alteracions en l’expressió d’aquests dos tipus de gens condueixen a modificacions en el control del cicle cel·lular i en edats avançades, en el control de l’apoptosi. Podem trobar tant càncers familiars (hereditaris) com esporàdics, tot i que la majoria són esporàdics. Per altra banda, els canvis que poden causar càncer poden ser tant epigenètics com genètics, però la gran majoria són epigenètics. S’ha avançat molt en l’estudi dels canvis epigenètics perquè estan implicats en molts processos cancerígens. Una cèl·lula “normal” sol tenir hipermetilades les regions promotores de molts gens, ja que no són específics d’aquell teixit/cèl·lula, i les seqüències repetides (elements transposables). Mentre que els gens propis de cada teixit o necessaris per aquell estadi de desenvolupament es troben hipometilats pel que fa la seva regió promotora i presenten hipermetilacions en les regions internes (per evitar processos d’splicing alternatiu, com s’ha explicat anteriorment). El que sí trobem al analitzar el DNA de cèl·lules en diferent estat de progressió o un determinat tipus de càncer és que a mesura que va progressant aquest tumor els nivells de metilació del DNA van disminuint. Per tant, en termes generals, el DNA s’hipometila. Ara bé, també trobem que les illes CpG incrementen el seu nivell de metilació. Per tant, Diagnòstic genètic molecular en global tenim un nivell de metilació més baix però en determinats punts del genoma aquest va incrementant (a les illes CpG). Canvis en els patrons de metilació associats al càncer Causes de la variació fenotípica Canvis epigenètics TEMA 1. Causes de la variació fenotípica 22 Aquesta desmetilació global del DNA implica que es puguin activar gens que estaven silenciats, que no s’hagin d’expressar en aquest teixit o que només s’expressin en certs estadis del desenvolupament embrional i per tant, aquesta activació comporta que puguin recuperar la seva expressió en etapes tumorals en regions que generen inestabilitat genòmica o seqüències repetitives. Aquest fet implica canvis en el patró d’expressió d’aquestes cèl·lules, expressió inadequada de determinades proteïnes i RNA’s acompanyada d’inestabilitat genòmica general degut a que es mobilitzen els elements transposables i es donen reorganitzacions cromosòmiques i recombinacions. A més a més, en alguns promotors trobem hipermetilació, afectant al procés patològic ja que aquestes hipermetilacions poden sobre-expressar o expressar oncogens silenciats o suprimir l’efecte de gens supressors de tumors. Al llarg del procés tumoral anem observant que canvis epigenètics van associats a l’expressió inadequada dels oncogens i/o gens supressors de tumors. Per altra banda, sempre s’han identificat uns determinats gens supressors que els quals es bloqueja la seva expressió en determinats tumors, però no en tots ells. Es pot caracteritzar un tumor pels nivells de sobre-expressió d’oncogens que presenta però sobretot pels nivells de bloqueig de gens supressors de tumors. TEMA 1. Causes de la variació fenotípica 23 S’han fet unes taules en les podem veure el patró d’expressió dels gens de cada tipus de tumor en diferents moments. Aquesta taula es fa servir per caracteritzar els tumors i poder estimar a quina etapa del progrés tumoral es troba aquella cèl·lula, ja que són patrons que es repeteixen per cada tipus de tumor, és a dir, cada tumor té el seu propi patró d’expressió característic1. La tumorigènesi està causada pels diferents mecanismes: • • • • • • • • • Pèrdua d’imprinting i creixement excessiu. Expressió d’un tipus cel·lular inadequat. Fragilitat i inestabilitat genòmica. Activació de seqüències endoparàsites (ex.: elements transposables). Canvi del cicle cel·lular. Avortament de l’apoptosi. Defectes en la reparació del DNA. Angiogènesi. Pèrdua de l’adhesió de les cèl·lules. Utilització de l’estudi de les metilacions pel diagnòstic – GSTP1 Així doncs, podem utilitzar l’anàlisi de la metilació del DNA com element de diagnòstic. Per exemple, de diagnòstic precoç per detectar càncer de pròstata. Un dels gens (GSTP1) codifica per la glutatió s-transferasa P1, que és un enzim que intervé en el metabolisme de detoxificació. La regió promotora d’aquest gen, en les cèl·lules canceroses, es troba hipermetilada (en les cèl·lules no afectades no es dóna aquesta hipermetilació). Podem detectar aquesta metilació mitjançant un anàlisi d’orina. Per tant, una persona que te hiperplàsia en la pròstata, mitjançant la detecció de la metilació podrem tenir un indici sobre si el creixement anormal està lligat a un tumor o a una hiperplàsia benigne. Utilització de l’estudi de les metilacions per la predicció de la resposta – MGMT Podem utilitzar pel pronòstic o predicció de la resposta que pot tenir en front a un tractament. Un dels casos més descrit es el del gen MGMT, que codifica per l’enzim metil guanina metil transferasa, transferasa de grups metils que reconeix de forma específica la O6-metil guanina, una guanina amb un grup metil en el carbonil del carboni 6 (C6). Aquest enzim està implicat en la eliminació dels grups metil del DNA. La hipermetilació afecta a la seva expressió, per tant, no tindrem proteïna i aleshores es dificulta l’eliminació dels radicals metílics del DNA. En conseqüència, si tractem al pacient amb 1 Les taules es poden trobar en les diapositives 8-9 del tema 1.3 del CV UAB TEMA 1. Causes de la variació fenotípica 24 agents alquilants, respondran més fàcilment perquè no podran reparar el DNA i per tant la dosis necessària per produir efecte serà més baixa. Diagnòstic genètic molecular La hipermetilació de MGMT en els glioblastomes es pot considerar un predictor de bona resposta al tractament amb agents alquilants del DNA La hipermetilació de GSTP1 en càncer de pròstata es un biomarcador de malignitat cel·lular. Es pot detectar en orina i sèrum sanguini Causes de la variació fenotípica Canvis epigenètics Utilització de l’estudi de les metilacions pel seguiment Per exemple, es pot realitzar en el càncer de tiroides. El que es fa és detectar les illes CpG metilades en sèrums i fluids biològics. En el cas de la leucèmia mieloide aguda, es troben hipermetilacions al p15 (als sans no s’hi troben). Es pot fer un seguiment després de vèncer un tumor i en reaparèixer es que es pot haver generat un tumor secundari. 2.2.4. Variabilitat epigenètica Les modificacions epigenètiques són mecanismes de control naturals que tenim i que poden originar variabilitat fenotípica. Un exemple molt comú és el del color del pèl dels Diagnòstic genètic molecular ratolins. Variabilitat epigenètica Podem veure ratolins de color groc, marró i casos intermedis. Aquests diferents pelatges són deguts a canvis epigenètics (metilacions de les regions promotores). Es tracta de ratolins isogènics portadors de l’al·lel yellow d’agouti. Els ratolins portadors d’aquest al·lel són de color groc. Ara bé, si Causes de la variació fenotípica Canvis epigenètics TEMA 1. Causes de la variació fenotípica 25 s’insereix una seqüència repetitiva (com a element transposable) en una regió propera al promotor d’auquest gen i es donen fenòmens de metilació, podrem veure els diferents colors de pèl dels ratolins: • • • Gen yellow d’agouti amb seqüència repetitiva pròxima a al regió promotora hipometilada. L’hipometilació derivava en l’activació de l’expressió del gen, per tant, els ratolins seran de color groc. Gen yellow d’agouti amb seqüència repetitiva pròxima a la regió promotora hipermetilada. L’hipermetilació derivava en la supressió de l’expressió del gen, per tant, els ratolins seran de color marró. Gen yellow d’agouti amb seqüència repetitiva pròxima a la regió promotora metilada de forma intermèdia. Aquests ratolins presentaran un color de pèl intermedi (comparant amb els dos casos anteriors). Qualsevol modificació epigenètica suposadament s'ha de mantenir al llarg de les generacions, però hi ha factors (intrínsecs i extrínsecs) que poden canviar aquest manteniment, com per exemple l'ambient. Per tant, mitjançant l’ambient es pot alterar el control epigenètic i aconseguir modificacions fenotípiques. Per exemple, es pot modificar la descendència si es modifica la dieta de la femella gestant. Si es tracta d’una femella que en condicions normals tindria ratolins amb cada tipus de color de pèl s’exposa a disruptors endocrins i a components tòxics, els Diagnòstic genètic molecular descendents seran majoritàriament yellow. D’altra banda, si se li subministra una dieta alta en suplements metilants (donadors i cofactors) la majoria dels descendents seran pseudo-agouti. En conclusió, podem variar aquest control genètic modificant els factors ambientals. S’han detectat diferents elements ambientals que generen variacions epigenètiques: fum del tabac, asbest, partícules de la pol·lució ambiental, etc. Causes de la variació fenotípica Canvis epigenètics TEMA 1. Causes de la variació fenotípica 26 3. POLIMORFISMES GENÈTICS El coneixement dels polimorfismes genètics ens pot ajudar a estimar la propensió a desenvolupar certes malalties o la resposta a determinats fàrmacs o ambients. L’efecte que tenen aquests al·lels alterats sobre el fenotip és força important. S’anomenen polimorfismes totes les formes al·lèliques que es troben en un percentatge superior al 1%. Aquests polimorfismes són normalment els responsables de les malalties poligèniques degut a que cada un d'ells té un petit pes relatiu associat a la malaltia. Cadascuna d’aquestes variants al·lèliques aporta una petita part del valor fenotípic d’aquesta malaltia. Ens interessen uns com a variants al·lèliques causants de les malalties i altres com a marcadors, perquè trobem associats alguns polimorfismes a malalties pel fet de trobarse en desequilibri de lligament. Per tant podem trobar X haplotips amb desequilibri de lligament. Trobem molts gens associats a la susceptibilitat i/o predisposició de patir la malaltia. Els efectes individuals no són molt importants però en conjunt poden determinar aquestes susceptibilitat i/o predisposició descrites. A més, l’estudi dels polimorfismes també es pot aplicar a moltes altres branques, com per exemple per determinar possibles respostes a diferents fàrmacs, ja que no deixen de ser elements ambientals. Aleshores es poden utilitzar per: • • • • Diagnòstic. Pronòstic. Determinar predisposicions de malalties complexes. Farmacogenòmica per determinar possibles respostes a diferents medicaments (per tal que aquest sigui més eficaç o no presenti efectes secundaris). Diagnòstic genètic molecular En definitiva, les eines que desenvolupem amb l’anàlisi genètica individual les podem utilitzar per diagnòstic i per pronòstic de malalties mendelianes o complexes. POLIMORFISMES GENÈTICS TEMA 1. Causes de la variació fenotípica Polimorfismes genètics 27 3.1. EFECTES DELS AGENTS AMBIENTALS – TABAC I ACTIVITATS LABORALS En farmacogenòmica s’utilitzen els polimorfismes per fer perfils genètics (SNPs) que en medicina ens poden ajudar a saber quins gens són els responsables del metabolisme i acció de les drogues juntament amb la seva eficiència. D’aquesta manera, el coneixement dels polimorfismes genètics ens pot ajudar a determinar la resposta d’un pacient als medicaments. Per exemple fumar és un agent ambiental que pot donar lloc a diferents malalties respiratòries i agreujar-ne altres. Els efectes del fum del tabac són bastant complexos. Cada individu dona una resposta diferent a les agressions ambientals (tabac, pol·lució ambiental, etc), de manera que unes persones són més susceptibles que d’altres a patir la malaltia en qüestió: simplement, la resposta respecte els agents ambientals dels diferents individus és diferent en cada cas. Ara bé, sempre hi estan implicades certes proteïnes, les quals depenen del genoma. Diagnòstic genètic molecular Un exemple d’agent ambiental que actua de forma negativa amb el nostre organisme són els PAH (hidrocarburs aromàtics policíclics) que es troben al tabac. Els PAH no interactuen directament amb el DNA, però els seu productes com són electrofílics sí que ho fan i acaben generant adductes. Aquests adductes són reconeguts per mecanismes de reparació i s’intenten eliminar. Quants més adductes, més probable és que quan es repliqui el DNA d’aquella cèl·lula, aquesta tingui problemes de fiabilitat pel que fa a la seva replicació i es puguin fixar Polimorfismes genètics mutacions que afectin a diversos gens. S’han fet estudis en quant a la relació entre aparició d’adductes i tabac. Hi ha individus que a la mateixa dosi de tabac diària presenta una quantitat major d’adductes que altres exposats a la mateixa dosi. Per altra banda, s’han fet altres estudis sobre la freqüència de mutacions pels diferents càncers. S’ha vist que certes persones tenen freqüències de mutació més elevades que d’altres (fet controlat per les proteïnes). Ens trobem que pot afectar a diferents gens, però si aquestes persones tenen variància al·lèlica en gens implicats en el cicle cel·lular que facilitin el control d’aquest mateix, l’efecte variarà. Des del tabac fins al desenvolupament del càncer de pulmó intervenen múltiples proteïnes, processos del metabolisme, sistemes de reparació, sistemes de replicació, control del cicle cel·lular, etc. Per tant, la resposta que donen a una agressió ambiental, en forma de patologia, depèn de múltiples gens, és a dir, depèn del nostre genoma. La resposta interindividual és variable i depèn de molts gens, polimorfismes (predisposen a TEMA 1. Causes de la variació fenotípica 28 patir càncer de pulmó), condicions, ètnia, sexe, dieta, edat, etc. Els individus més joves tenen més risc que la gent d’edat avançada. Aleshores, ens interessa disposar d’eines d’anàlisi de polimorfismes genètics per fer pronòstics i estimar la predisposició a patir una malaltia determinada. Hi ha moltes activitats laborals que impliquen un risc. Un cas és el fet de treballar a les mines, que segons el tipus de mina en el que es treballi, un anàlisi previ estudiant si aquella persona és adequada per treballar a la mina pel que fa al risc de patir càncer de pell o emfisema pulmonar podria ser una bona alternativa per evitar la malaltia. Per altra banda, també és important el fet que hi ha variants al·lèliques en alguns gens que tenen importància en el control del cicle cel·lular o gens supressors de tumors. En aquest cas solem trobar aquesta predisposició en càncer familiar, perquè porten variants que afecten a gens implicats en els dos processos anomenats anteriorment. 3.2. EFECTES DELS AGENTS AMBIENTALS – MEDICAMENTS Diagnòstic genètic molecular Un altre dels agents ambientals als que estem molt acostumats són els medicaments. S’han descrit medicaments que tenen efectes nocius sobre el El coneixement dels pacient. Alguns funcionen molt bé a la majoria de polimorfismes genètics persones però en altres no tant. També hi ha casos ens pot ajudar a determinar al resposta en que el subministrament d’aquest medicament d’un pacient als té efectes tòxics fins poder produir la mort del medicaments pacient tot i ser una malaltia innòcua. Per tant, hem de saber molt bé quin canvi metabòlic porta lloc a produir la toxina determinada en lloc de la forma Polimorfismes genètics activa del fàrmac que pot solucionar el problema que volem tractar. La farmacogenètica s’ha anat desenvolupat cada cop més. En el cas del càncer és interessant determinar quines són les dosi i l’eficàcia prevista del tractament, és a dir, s’ha de determinar la possible resposta del pacient a aquell tractament. Quan ingerim un medicament, aquest s’anirà transportant pel nostre organisme i tots els metabòlits resultants establiran associacions determinades amb proteïnes ocasionant que la dosi que arriba a l’òrgan i/o teixit tractat sigui major o menor. Per tant, en funció del genoma de l’individu, la dosi real d’exposició del teixit o tumor que rebrà del medicament variarà de l’un a l’altra. Per tant s’ha de determinar la dosi adequada que s’ha de subministrar al pacient per aconseguir una bona resposta. Els medicaments un cop ingerits, van cap al fetge, on seran metabolitzats. Seguidament es transporten cap als diferents òrgans/teixits i s’acumulen en aquests. Un cop s’hagin acumulat, s’encarregaran d’actuar i finalment s’excretaran. En aquest procés de metabolisme dels medicaments hi intervenen moltes proteïnes, que en funció del genotip que tingui cada individu, comportarà que aquest necessiti una dosi major o menor. TEMA 1. Causes de la variació fenotípica 29 Diagnòstic genètic molecular Diagnòstic genètic molecular Polimorfismes genètics Polimorfismes genètics Un cop el medicament ha arribat a la seva diana (tumor) haurà d’actuar, però al ser un teixit tumoral, presentarà alteracions genètiques, les quals comporten que no respongui exactament igual al teixit sa: alteracions del metabolisme, sistema de reparació anormal, etc. És necessari que la dosi de medicament arribi al blanc i per determinar-ne la dosi exacte haurem de saber quines característiques té el teixit sa i el teixit tumoral, per tal de poder comparar i establir unes quantitats de dosi exactes i eficaces. 3.3. QUIMIOTERÀPIA Diagnòstic genètic molecular Hi ha tumors primaris i tumors secundaris (que sorgeixen quan es produeix metàstasi). El càncer és una malaltia que es troba en constant canvi, per tant, pot sorgir com a càncer L’evolució de les cèl·lules metastàtiques fa que, en molts cops, primari i esdevenir un càncer secundari amb el temps. Les característiques dels càncers el tractament d’aquestes tingui uns requisits diferents de les del secundaris són diferents a les dels càncers primaris, aspecte que s’ha de tenir en compte tumor primari a l’hora d’establir la dosi que s’ha de subministrar. És a dir, l’evolució de les cèl·lules metastàtiques fa que, en molts cops, el tractament d’aquestes tingui uns requisits diferents de les del tumor primari. Polimorfismes genètics TEMA 1. Causes de la variació fenotípica 30 Aleshores, pot ser que el tractament d’un tumor secundari no sigui eficaç si s’està utilitzant la dosi necessària per tractar un tumor primari (degut a les diferents característiques que presenten ambdós tumors). 3.4. 5’ FLUOROURACIL (5FU) Un dels quimioteràpics que se subministra als pacients amb més freqüència és el 5’ fluorouracil (5FU) en la seva forma monofosfat i és el medicament que s’utilitza per tractar les cèl·lules tumorals. Aquest medicament és metabolitzat de manera que pot ser excretat després de la inactivació amb DPD (dihidropirimidina deshidrogenasa) mitjançant un procés de detoxificació. Hi ha diferents variants polimòrfiques del gen de la DPD. En l’al·lel mutant, el qual no és funcional, la ruta d’eliminació o detoxificació queda bloquejada de manera que la dosi que se subministra és superior a la que es prediu (ja que no s’elimina el percentatge que normalment s’ha d’eliminar) i s’acumula tenint una sobredosi, originant toxicitat neuronal, gastrointestinal i hematològica. En quimioteràpia sobretot és molt important ajustar la dosi ja que si ens passem, aquest fet pot tenir efectes molt tòxics, atacant als teixits tumorals però també als no tumorals. Hi ha també una via d’activació controlada per la TP (timidina fosforilada) que passa de forma inactiva (monofosfat) a forma activa (trifosfat), fent que hi hagi una resposta en el càncer de pit. També hi ha alguns al·lels, MTHFR (metilentetrahidrofolat reductasa), que produeixen una sobre-expressió d'aquest gent fent que hi hagi una major quantitat de medicament actiu. Aquest al·lel, MTHFR, alhora es un inhibidor de l'al·lel TS (timidilat sintetasa) que sintetitza els nucleòtids que formaran part del DNA i alhora redueix l'eficiència del 5-FU. També hi ha formes més o menys sensibles a la activitat inhibidora de la timidina Diagnòstic genètic molecular fosforilasa (major o menor resposta). En funció de quin al·lel tingui l’individu, la resposta 5´fluorouracil (5FU) serà diferent. En funció de l'eficàcia de les rutes alternatives de formació de nucleòtids les conseqüències inhibitòries seran majors o menors. Dihidropirimidina deshidrogenasa Timidina fosforilasa Metilentetrahidrofolat reductasa Timidilat sintetasa Polimorfismes genètics TEMA 1. Causes de la variació fenotípica 31 Es tracta de quatre gens que ens proporcionen informació per saber quina dosi de medicament és necessària pel tractament. És per això mateix que s’han de tenir en Diagnòstic genètic molecular compte tant els gens principals com els secundaris. Com les poblacions són força heterogènies, això ens permet detectar quines poblacions respondrien correctament i quines no, a aquest medicament. En el cas que no sigui eficaç, s’hauran de buscar tractaments alternatius. Per altra banda, també es pot donar el cas que els medicaments produeixin efectes nocius sobre els individus (efectes adversos). Diagnòstic genètic molecular Les eines d’anàlisi genòmic ens permeten ajustar alguns tractaments per casos més o menys greus, com el tractament del càncer. limorfismes genètics Moltes d’aquestes malalties que tenen a veure amb els processos metabòlics són malalties complexes: • Moltes malalties són complexes • Algunes són d’origen mitocondrial • Hem de tenir en compte els casos de mosaics 4. MALALTIES MITOCONDRIALS Diagnòstic genètic molecular Les malalties mitocondrials solen ser alteracions del sistema de fosforilació oxidativa, ubicat als mitocondris. Aquest procés intervé en la respiració, i les proteïnes que el fan possible es poden • Moltes malalties són complexes trobar codificades tant al DNA mitocondrial • Algunes són d’origen mitocondrial • Hem de tenir en compte els casos de com al DNA nuclear, de manera que Canvis genètics • osaics aquestes últimes són transportades al Genoma nuclear interior del mitocondri. El DNA Genoma mitocondrial mitocondrial porta gens codificants per ALGUNES MALALTIES PRESENTEN TEMA 1. Causes de la variació fenotípica ALTERACIONS MITOCONDRIALS 32 Malalties mitocondrials subunitats ribosòmiques, proteïnes, RNAs, etc. Per tant, té molta informació però no tota la que necessita per ser un orgànul totalment autònom. Aleshores, molts cops hi ha pacients que tenen problemes pel que fa la fosforilació oxidativa i quan analitzem el pedigrí familiar veiem que hi ha algunes malalties que presenten un patró mitocondrial, altres un patró recessiu, lligat al sexe, etc. Una malaltia mitocondrial pot tenir diferents orígens (DNA mitocondrial o nuclear), generant una situació de gran heterogeneïtat. En aquests estudis, el primer que hem d’identificar és quina és la causa i quin és el seu origen. Els complexos proteics que intervenen en la fosforilació oxidativa presenten proteïnes de diferent origen, tant mitocondrial com nuclear. Per tant, la disfunció d’aquest complex proteic pot tenir tant origen nuclear com mitocondrial. No és que siguin tots del mateix origen, sinó que es pot combinar. Per exemple, pel que respecta el complex 1, hi ha set subunitats mitocondrials i trentaDiagnòstic genètic molecular nou d’origen nuclear. A continuació podem veure una taula amb tots els complexos proteics mitocondrials i l’origen de les subunitats que els formen: Un altre aspecte que podem tenir en compte és que si es donen mutacions al mtDNA pot donar lloc a altres mitocondris mutats, però també n’hi haurà de sans. Malalties mitocondrials Quan es divideix la cèl·lula hi haurà un repartiment heterogeni dels mitocondris, de manera que hi haurà cèl·lules amb molts mitocondris mutats i altres cèl·lules amb pocs. Aquest fenomen s’anomena heteroplàsmia: dues línies mitocondrials diferents en el mateix individu. Per tant, la severitat d’aquestes malalties és molt variable i d’origen matern. TEMA 1. Causes de la variació fenotípica 33 4.1. ORGANISMES AMB LÍNIES CEL·LULARS DIFERENTS Diagnòstic genètic molecular Inevitablement ens trobarem amb casos en els que hi ha línies cel·lulars genèticament Mosaics i quimeres diferents en el mateix organisme. En funció de l’origen, parlarem de mosaics o de quimeres. Mosaics Quimeres Mosaics. Presència, •Presencia un organisme, més d’una línia cel·lular en unen organisme dede més genèticament diferent que provenen del mateix zigot. És a dir, provenen de d’una línia cel·lular genèticament la mateixa cèl·lula inicial. Per tant, es poden haver originat per mutacions diferent que provenen del mateix cromosòmiques o puntuals. Quimeres. Presència, en un organisme, de dues o més línies cel·lulars •zigot genèticament diferent que provenen de zigots diferents. Per exemple, hi ha casos de transferència de cèl·lules maternes al fetus donant situacions de Presencia en un organisme de dues microquimeres. Algunes tècniques d’obtenció d’organismes transgènics o més línies cel·lulars que provenen s’obtenien a partir de quimeres: cèl·lules embrionàries que es modifiquen, decomprova zigots que diferents es s’hagi inserit l’element interessat i un cop fet això, es transfereix a un nou embrió. Podem trobar els següents mosaics: Mosaicisme • • • Mosaics somàtics. Es produeix una alteració en una cèl·lula determinada i a partir d’aquesta, totes les cèl·lules que en derivin també estaran alterades. Mosaic germinal. Si es muta una cèl·lula germinal, obtindrem una línia germinal mutada. Diagnòstic. Es tracta de mosaics tant somàtics com germinals. Tot depèn genètic molecular Mosaic monosomal del moment en el que s’hagi donat la mutació. nòstic genètic molecular Detecció d’un mosaic germinal Mosaicisme Com no hi ha antecedents familiars afectats però alguns fills sí ho estan, hem d’estudiar la relació genotip-fenotip tant dels fills com dels pares. En el cas que trobem que alguns fills són portadors de la mutació i que els pares no, arribem a la conclusió que es tracta d’un mosaïcisme germinal. TEMA 1. Causes de la variació fenotípica 34 En el cas de la imatge anterior, com hi ha varis fills afectats, això implica que la mutació de novo s’ha produït en una cèl·lula precursora germinal . En el cas que només es tractés Diagnòstic genètic molecular d’un fill, la mutació s’hauria generat en una cèl·lula germinal en concret. Detecció d’un mosaic somàtic En aquest cas tampoc hi ha antecedents familiars però només tenen un fill afectat. La diferència principal és que els fills de l’individu afectat no ho estan. Això és degut a una mutació de novo originada a la línia somàtica de l’individu en qüestió, per tant, al no afectar a la línia germinal, els descendents d’aquest individu afectat no patiran la malaltia. La fotografia mostra de la zona amb hiperpigmentació i la normal, veiem que la zona amb Mosaicisme hiperpigmentació conté la mutació. Diagnòstic genètic molecular Els mosaics influeixen també en el grau de severitat de les malalties. Un exemple serien els nòduls del fetge d'un pacient amb tirosinèmia hereditària de tipus I. Com major sigui la part del mosaic afectat major serà la severitat de la malaltia. Nòduls del fetge d’un pacient amb tirosinèmia hereditària del tipus I que han revertit la mutació en el gen de la hidrolasa fumarilacetoacetat Displàsia fibrosa asimètrica amb hiperpigmentació Els mosaics es poden produir per mutació directe i divisions mitòtiques o per reversió al Diagnòstic genètic molecular llarg del desenvolupament i per tant, així es recupera part de la funció. En la imatge veiem Mosaicisme una reversió de la mutació en el gen de la hidrolasa fumarilacetoacetat. mutació Displàsia fibrosa asimètrica amb hiperpigmentació Mosaicisme reversió Nòduls del fetge d’un pacient amb tirosinèmia hereditària del tipus I que han revertit la mutació en el gen de la hidrolasa fumarilacetoacetat Un exemple és l’anèmia de Fanconi, els quals tenen un nivell d'afectació relativament baix degut a una reversió espontània generada per part del teixit. En funció del percentatge de teixit afectat variarà la severitat. TEMA 1. Causes de la variació fenotípica 35 6. DIAGNÒSTIC GENÈTIC MOLECULAR Diagnòstic genètic molecular Hi ha diferents ítems que ens poden servir pel Eina fonamental en la prevenció • naixements d’individus afectat diagnòstic genètic molecular. El diagnòstic genètic • teràpia d’individus que manifestaran la malaltia molecular és una eina bàsica en la prevenció de malalties i ens permet evitar que neixin individus que EL DIAGNÒSTIC GENÈTIC poden estar afectats per malalties greus i pot avançar la simptomatologia de la malaltia. Per altra banda, també ens permet preveure l’aparició de malalties mitjançant teràpia mèdica minimitzant el possible aquesta metodologia. És una eina que utilitzarem en múltiples casos. Diagnòstic genètic molecular Diagnòstic genètic A les malalties hi podem trobar les següents alteracions: Cromosomes DNA Cromatina RNA Proteïna DNA silenciat • • • Seqüència Modificació química … • • • Modificacions químiques Organització … ncRNA • • • • • Seqüència Grandària Abundància Estabilitat … • • • • • • Seqüència Grandària Abundància Estabilitat Funció … Diagnòstic genètic Aleshores, utilitzant el diagnòstic genètic molecular s’intentarà posar de manifest aquesta variació proteica i d’RNAs. Qualsevol tècnica que permeti posar de manifest aquestes variacions es podrà utilitzar com a eina de diagnòstic genètic. Tenim la possibilitat d’accedir al diagnòstic genètic mitjançant l’anàlisi de diferents molècules i hi Diagnòstic genètic molecular ha les eines que ens permeten analitzar aquesta variació. Cardiac hypertrophy Hi ha diferents factors que poden afectar al fenotip de l’hipertrofia cardíaca 2, per exemple. En aquest cas hi trobem implicats diferents nivells d’alteració en la manifestació de la malaltia. Aquests factors poden afectar al genotip i trobem diferents nivells d’alteració en aquesta manifestació. Diagnòstic genètic 2 Explicat a principis de tema.
TEMA 1. Causes de la variació fenotípica 36 Per tant, farien falta tècniques d’anàlisi del DNA que permetin analitzar variacions dels SNPs, variacions de seqüències de DNA o del nombre de còpies. La cerca de mutacions que comporten aquesta malaltia, en alguns casos, també es realitza analitzant el DNA mitocondrial, ja que podem analitzar les variacions que afecten les seqüències de DNA mitjançant la variació dels RNA’s, splicing alternatiu, etc. Per altra banda, també es fan anàlisis del RNA per veure tots els ncRNA i miRNA, entre d’altres. Aleshores, haurem de jugar amb diferents tècniques per poder fer un bon diagnòstic. Aquest diagnòstic dependrà del tipus de patologia amb la que treballem, fins arribar al punt que en alguns casos haurem de combinar estudis per obtenir unes conclusions fiables: no s’ha de limitar l’estudi únicament a analitzar el DNA, sinó que hem d’estudiar tots els àcids nucleics i les proteïnes. Per tant, necessitarem detectar la presència d’aquells RNA’s per poder veure si hi ha variacions d’splicing en quant a grandària, abundància de missatger, etc. Per altra banda, també es pot detectar la presència de proteïnes, que poden afectar als teixits o estar ubicades al torrent sanguini. Per poder realitzar tot això necessitarem tècniques d’anàlisi i detecció de variacions proteiques. Les malalties genètiques es poden manifestar en diferents moments del desenvolupament i algunes en estadis avançats d’aquest, però si la principal causa d’aquesta malaltia d’origen genètic afecta la seqüència de DNA gràcies a canvis genètics, el nostre anàlisi tindrà una major anticipació si està basat en l’anàlisi d’aquesta seqüència de DNA. Per tant, en qualsevol moment del desenvolupament es pot posar de manifest Diagnòstic genètic molecular aquesta malaltia. Cromosomes DNA Major anticipació Les malalties genètiques poden manifestar-se en diferents moments del desenvolupament • • • Seqüència Modificació química … Així doncs, ens podem anticipar a la manifestació simptomàtica d’aquesta patologia. El diagnòstic genètic en molts casos només té com a funció avançar-se als símptomes. Pel que fa a les alteracions proteiques, aquestes igual no s’alteren fins que l’individu té uns 30-40 anys. Diagnòstic genètic El diagnòstic genètic té certes limitacions, ja que no sempre podem aconseguir una precisió perfecte. És a dir, podem fer unes prediccions determinades però com hi ha tants factors que intervenen, si no els tenim en compte tots, podrem cometre errors. Diagnòstic genètic molecular Pel que fa a la manifestació del caràcter fenotípic, a més d’alteracions genètiques també podem trobar soroll ambiental: factors aleatoris que intervenen en aquest procés de desenvolupament. TEMA 1. Causes de la variació fenotípica 37 Diagnòstic genètic Un exemple seria el fenotip de les gates calicó, fenotip que sorgeix de la inactivació del cromosoma X. En aquest cromosoma es troba el gen encarregat de la síntesi de melanina. Aquesta inactivació és un procés aleatori i per tant, el patró de taques que poden tenir aquestes gates dependrà d’aquesta inactivació aleatòria. En conseqüència, no podem aconseguir reproduir el mateix patró de taques en una gata clònica, ja que aquesta tindrà un patró de taques diferent degut a la inactivació produïda per atzar. No podem assegurar exactament el fenotip de l’individu per molta informació que tinguem, sempre hi haurà algun factor genètic que interfereixi, juntament amb factors ambientals (aleatoris). Hi ha certs aspectes que es poden predir amb facilitat, com per exemple el sexe. Ara bé, hi ha tota una altra sèrie d’aspectes que no es poden predir amb tanta facilitat, s’han de predir en funció de la informació de la que disposem ja que depèn d’altres factors (dins de les limitacions de les que disposem). Aleshores, es tracta d’un aspecte probabilístic. Ens trobarem amb limitacions perquè el fenotip és resultat d’un procés complex del que intervenen diferents factors. 6.1. TESTS DE DIAGNÒSTIC GENÈTIC Diagnòstic genètic molecular Diagnòstic genètic Diagnòstic genètic molecular Diagnòstic genètic TEMA 1. Causes de la variació fenotípica 38 Diagnòstic genètic 6.2. OBTENCIÓ DE MOSTRES Diagnòstic genètic molecular Obtenció de mostres El diagnòstic genètic molecular es pot utilitzar en diferents situacions i per diverses finalitats. Pel que fa a l’obtenció de mostres, en alguns casos treballarem amb individus adults, nadons, fetus, embrions o oòcits. Es poden fer diagnòstics previs a la fecundació in vitro per detectar diferents problemes, per exemple. 6.3. FONTS D’ERROR: MOSAÏCISME Sempre hi ha una font d’error: el mosaïcisme. Per exemple, podem extreure una de les cèl·lules de l’embrió per determinar Diagnòstic genètic molecular si porta un determinat al·lel o no i aleshores, determinar si el nou individu estarà afectat o no. Diagnòstic preimplantacional Per exemple, en un anàlisi a un embrió (diagnòstic genètic preimplantacional) agafem només una cèl·lula per fer una biòpsia, de manera que si just analitzem la cèl·lula que no es representativa de tot l'embrió (hi ha hagut una reversió, una mutació, etc) tindrem un diagnòstic erroni. ? En el cas dels adults, veiem que es pot perdre la funció en una part del teixit afectat per Diagnòstic genètic mosaïcisme i que això pot portar a una pèrdua total o parcial de la funció, derivant en una patologia o en un equilibri (de producció de proteïnes, per exemple). 6.4. TIPUS DE DIAGNÒSTIC Hi ha dos tipus principals de diagnòstic: • • Directe. Quan es coneix la mutació causant de la malaltia que es vol diagnosticar. Indirecte. Càlcul probabilístic basat en el lligament amb marcadors polimòrfics de DNA. En són exemples els diferents polimorfismes, haplotips associats a la malaltia i marcadors associats a certes variants. En el cas del DNA, la informació més directa és la seqüenciació, però comptem amb moltes altres tècniques indirectes com hibridacions in situ fluorescents (FISH), PCRs , arrays o anàlisi de microsatèl·lits. En funció de les limitacions que tinguem realitzarem uns anàlisis o uns d’altres. TEMA 1. Causes de la variació fenotípica 39 ...