Tema 6 (2015)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Bioquímica - 2º curso
Asignatura Biologia Molecular
Año del apunte 2015
Páginas 37
Fecha de subida 11/02/2015
Descargas 71
Subido por

Vista previa del texto

María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T6 Tema 6. SEQÜENCIACIÓ DEL DNA Al 1977 es van establir dos mètodes per seqüenciar el DNA que podem diferenciar en: 1.
Mètode enzimàtic que és conegut com a mètode de Sanger que és molt utilitzat i és molt enginyós.
2.
Mètode químic proposat per Maxam & Gilbert.
MÈTODE QUÍMIC DE SEQÜENCIACIÓ: MAXAM AND GILBERT El mètode químic es basa en el domini de la química dels àcids nucleics. Per fer servir aquest mètode cal tenir la tenir marcat radioactivament la seqüència de DNA en un sol extrem, en aquest cas el 5’, tal com veiem a la imatge. El procediment per obtenir això ho detallem a continuació: Hi ha nucleases que tallen i quan ho fan deixen un hidroxil lliuren en l’extrem 5’. Per una altra banda, les nucleases de restricció quan tallen deixen un grup fosfat en l’extrem 5’ però aquest no ens interessa perquè no és radioactiu. Per tant, la primera passa serà treure els fosfats mitjançant una fosfatasa alcalina, fent que obtinguem hidroxils en 5’.
Seguidament, amb l’ajuda d’un altre enzim que rep el nom de polinucleòtid quinasa, el que farem serà introduir fosfats radioactius en 5’ i per això cal que fem servir com a transferidor de fosfat l’adenosina (ATP) on convé que la radioactivitat se situï en el γ ja que és aquest el que es transfereix al fosfat.
Quan elaborem aquest procediment tenim un problema ja que estem marcant les dues cadenes i únicament volem seqüenciar una, no totes dues alhora. Així doncs, si volem que hi hagi una única marca hem de fer servir un altre enzim de restricció que ens talli l’extrem; quan elaborem una electroforesi o una autoradiografia tindrem una part amb una única marca i l’altre part amb una altra marca. Per tant, obtindrem una seqüència que sí que podem seqüenciar.
Aquest mètode consisteix en fragmentar la seqüència trencant els enllaços fosfodiéster i per tant, hem de tenir una química adequada per trencar quan hi ha una A, una G, una C o una T. Els mètodes que s’apliquen són de química orgànica i molt complexos.
1 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T6 Van trobar una reacció que talla per G on a partir de dimetil sulfat i medi alcalí es trenca un enllaç covalent de G i en presència d’un segon reactiu, piperidina, es continua trencant per on s’havia començat a trencar la base nitrogenada ja que la piperidina s’enganxa. Encara en presència de medi alcalí observem com una part continua trencant-se. Així doncs, allà on hi ha una G a la seqüència, la cadena queda covalentment discontinuada i després continua.
Per una altra banda van trobar una reacció que talla per T i en aquest cas s’utilitzen com a reactius la hidrazina i la piperidina. El primer substrat altera la base nitrogenada que es perd i a més, provoca l’obertura de la ribosa. Finalment observem que la cadena de DNA queda discontinuada i després continua. Cal tenir present que si posem molt reactiu, la cadena es trencarà per tot arreu però amb una concentració adequada podrem aconseguir una col·lecció de fragments de longitud diversa.
Cal tenir present que aquestes reaccions químiques són bones però no són perfectes. Trobem que hi ha reactius que tallen tant T com C i uns altres reactius que tallen G i A. Malgrat això es pot seqüenciar mitjançant aquesta tècnica.
La següent figura ens mostra un gel de seqüenciació real que és coherent amb l’explicació química anterior. A l’examen ens poden demanar que dibuixem el gel que obtindríem amb unes determinades substàncies i una seqüència.
2 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T6 Per tal de fer seqüenciació amb aquest mètode hem de tenir 4 tubs on trobarem diferents reactius:  Tub 1: reactiu que talla G.
 Tub 2: reactius que tallen A i G.
 Tub 3: reactiu que tallen T i C.
 Tub 4: reactiu que talla C.
A cada tub s’han de seguir les condicions que marquen els autors per tal que els talls es puguin elaborar correctament.
Després de fer les reaccions carregarem els tubs a diferents carrils per tal d’elaborar una electroforesi i una posterior radiografia. Recordem que la seqüència que volem estudia l’havíem marcat amb P32.
Si la freqüència de tall és adequada, i la seqüència que tenim és la que trobem a la part superior de la imatge, el tall més petit es produirà per davant de la primera C. Això no és realista ja que en realitat, quan seqüenciem es té una seqüència molt llarga i es llegeix “allò que pots”, és a dir, el tros de gel on tens les bandes separades. El P32, que correspon a aquesta petita seqüència, s’escapa pel gel i per tant, normalment no s’observa. Com que estem estudiant un model pedagògic sí que es veu representat.
Com que el reactiu que talla T també talla la C, el fragment més petit que trobem haurà d’estar en el tub 3 i el 4, és a dir, obtindrem bandes als dos carrils. Aquest fet ens permet determinar que tocant al 5’ hi ha una C. Si haguéssim tingut una T no hauríem vist banda al carril 3 però sí al 4.
Observem a la seqüència que la següent base és una T, de manera en el tub 3 sí que obtenim una banda que augmenta en longitud respecte l’anterior però no la trobem en el 4 ja que no hi ha reactiu que talla en T.
Això ho podem anar fent i llegir la seqüència que ens interessa. Es poden arribar a llegir uns 200 nucleòtids però això depèn de la longitud dels gels, de la radioactivitat... Cal tenir present que el gel que s’utilitza és desnaturalitzant.
MÈTODE ENZIMÀTIC: SANGER El mètode enzimàtic també rep el nom de mètode de Sanger o dels didesoxinucleòtids. Aquest mètode fa servir una mena d’aturador de la DNA polimerasa que és el 2’,3’ – didesoxinucleòsid trifosfat i que té la particularitat de no tenir un hidroxil, quan la DNA polimerasa incorpora un didesoxinucleòtid trifosfat en la cadena creixent la reacció s’atura ja que com que no trobem un hidroxil en 3’, la següent passa de polimerització no es pot produir.
Es tracta d’un mètode enzimàtic perquè fa servir la DNA polimerasa com a eina. Concretament, Sanger feia servir el fragment de Klenow que és un fragment de la DNA polimerasa i per tant, no té tota l’activitat catalítica editora però sí la polimeritzadora.
Per poder aplicar aquest mètode hem de tenir el fragment de DNA del qual volem conèixer la seqüència i a més, hem de tenir un iniciador (primer) ja que les polimerases només saben allargar les cadenes. Després de molts esforços, els dissenyadors d’aquests mètodes van elaborar uns kits que permeten a l’investigador col·locar la seqüència en un vector de clonació i just on està la seqüència que vols conèixer, el vector té la seqüència complementària. Per tant, només has d’estendre el DNA amb la seqüència que vols conèixer.
3 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T6 En aquest mètode cal que la seqüència que produirem estigui marcada radioactivament. Els precursors no són didesoxinucleòtids, són desoxinucleòtids ja que sinó la polimerasa no funcionaria però alguns d’aquests o tots han de tenir radioactivitat ja que sinó no podríem conèixer els fragments que es van produint. A la pràctica, només es marca un d’ells ja que normalment no se sol intentar determinar tota la seqüència d’entrada. Per tant, s’aplica el mètode de Sanger, es fa un gel i es llegeix el tros que es pot i no sol ser des de l’origen.
Així doncs, s’han de posar precursors que permeten allargar la cadena en presència de polimerasa i els didesoxinucleòtids trifosfat que actuen com a aturadors. Cal tenir present que la concentració d’aturadors han de ser adequades ja que si és molt elevada, s’aturaran massa d’hora i no obtindrem una bona col·lecció de fragments.
Podem dir que la seqüència que obtindrem de la lectura del gel serà la seqüència complementaria a la seqüència problema. La reacció s’atura perquè hi posem una quantitat adequada de 2’3’-didesoxitrifosat. El primer està en l’extrem 3’ i imaginem que entra el primer nucleòtid complementari a la seqüència problema (C), si aquesta C una vegada incorporada o quan s’incorpora tenim la casualitat que és una forma didesoxi això vol dir que es produirà una cadena bastant curta perquè només tindrem el primer nucleòtid i aquesta C de manera que, la reacció s’aturarà, sent, de tots els fragments de Sanger, el més curt. Aquest aspecte vol dir que en el tub que hi posem la didesoxi CTP com en el cas de Maxam i Gilbert tenim 4 tubs, en cadascun l’aturador és diferent i en el segon tub en particular és del ddCTP.
La següent cadena que es pot produir és la que té una (A) addicional, complementaria a (T). El tub que te les ddATP contindrà un fragment que serà un nucleòtid més llarg al anterior pel que acabem de comentar (la ddATP no pot aturar la reacció en incorporar una C). Aquest aspecte ens permet anar llegint la seqüència complementaria mirant en el gel les bandes des de més avall a més a dalt.
Perquè el gel pugui diferenciar els fragments que difereixen de cadenes amb un nucleòtid de més o de menys cal que les estructures que circulen siguin estructures que no pugin elaborar dobles cadenes o unions intermoleculars de manera que la mostra quan es prepara, després de fer les reaccions de Sanger els 4 tubs seran posats a 100 graus perquè es dissociïn les cadenes ja que el que volem veure són els fragments de Sanger per separat i perquè aquesta desunió es mantingui afegirem formamida (actua com a formador i donador de ponts d’hidrogen) de manera que, si dues cadenes s’han associat i hi ha una alta concentració d’aquest producte els fragments de Sanger formaran unió amb la formamida i no tindran tendència a associar-se de nou entre ells.
Amb els tubs que obtenim anteriorment carreguem l’electroforesi i cal que tinguem la seguretat que no es formaran estructures de doble cadena o de W&C de manera que elaborarem un gel desnaturalitzant amb 7M d’urea que és capaç de elaborar els ponts d’hidrogen. A més, l’electroforesi s’elabora a 70ºC el que no permet de cap manera la formació de DNA dúplex i a més es substitueixen les Guanines per Guanines modificades (són més estables), el que permet una resolució ferma i podem llegir la cadena complementària a la cadena problema.
4 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T6 Variant més fàcil de la seqüenciació En el propi laboratori de Sanger van inventar-se una variant que feia més fàcil la seqüenciació i això està també relacionat amb la enginyeria genètica del bacteriòfag M13. Recordem que aquest bacteriòfag facilita molt l’obtenció de DNA monocadena.
5 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T6 Tenim el DNA com a vector i els enzims de restricció són específics de doble cadena de manera que, cal iniciar amb la doble cadena per fer una restricció del DNA a seqüenciar, que el tallem amb els mateixos enzims de restricció de manera que, tindrem extrems cohesius. Els fragments es podran unir amb el vector de manera que, després de fer la lligació tindrem inserit i covalentment unit el fragment que volem i això és el que fem c`créixer en bacteris per tal d’obtenir una amplificació, moltes còpies.
En lloc d’isolar el DNA de doble cadena aprofitem que és un M12 de manera que isolarem el de cadena simple, el que té l’avantatge que tindrem la seqüència a conèixer i la que volem seqüenciar en forma de monocadena de manera que, no ens haurem de preocupar de fer una fusió prèvia perquè si no la fem podem agafar el primer i hibridar en el lloc que volem per fer l’extensió del primer amb la reacció de Sanger i anar fent fragments de Sanger. El primer el col·locaríem abans de la part gris curteta per poder fer l’extensió.
Detecció de bandes: radioactivitat Vem dir que almenys un dels nucleòtids que posem en la barreja ha de tenir una marca radioactiva i en aquest cas tenim P32 tot que també pot ser S35. La principal diferència entre P32 i S35 és que el P32 és un emissor d’alta energia i provoca radiòlisi, trencament d’enllaços de les pròpies cadenes de DNA que estan en les bades. Aquesta radiòlisi és tant forta que un o dos dies després de fer l’electroforesi el DNA de les bandes està molt trossejat químicament i per tant, ja no es tracta de macromolècules sinó que són petits fragments amb varis àtoms que difonen tant, que les bandes queden desdibuixades, engruixides, es confondrien de manera que, no es pot llegir correctament.
El S35 en canvi, la seva energia d’emissió és més petita i per tant, els autors tècnics diuen que si guardes el gel a -20ºC aquests són estables almenys durant una setmana. Hem de tenir present que la radiòlisi és cara, perillosa i necessita d’una bioseguretat.
6 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T6 MÈTODES QUIMIOLUMINISCENTS La luminescència com interès analític era pràcticament nul·la, hi havia alguns químics analítics que treballaven en el tema però a nivell pràctic no s’havia obtingut res d’interès. A partir l’any 1990 hi ha químics orgànics que donen eines per l’analítica i un laboratori important és el de Irena Bronstein, que a partir dels coneixements bàsics que s’havien anat acumulant en els anys anteriors, gracies a petits èxits aconsegueix dissenyar molècules intel·ligents que eren quimioluminiscents i que, es poden aplicar a l’analítica.
Estructures emprades Les estructures són de disseny: tenen una zona estable, un pont que dóna energia a l’estructura, una part que donarà emissió de llum i una part activable que dispara el procés d’emissió de llum. Hi ha dos grans blocs de molècules: Dioxietans quimioluminiscents Aquests són descoberts en el laboratori de Bronstenc i tenen les parts esmentades anteriorment: part estable, pont i part emissiva. En funció de si en l’oxigen hi ha un fosfat o una galactosa es pot disparar o no la dissipació de la reacció.
Dins d’aquest grup diferenciem dos tipus AMPPD i AMPGD. La única diferència és que en la primera hi ah un fosfat i en l’altre una galactosa. En aquestes molècules de disseny el procés es dispara fent us d’enzims: si es fa servir la fosfatasa alcalina has d’aparellarla amb AMPPD que iniciarà el procés de luminescència mentre que si vols utilitzar AMPG cal fer servir l’enzim 1-β-galactosidasa.
Una vegada hem tret el tap, l’element d’activació gràcies als enzims, aleshores tenim una estructura inestable perquè tenim un pont que dóna inestabilitat. Aquest pont s’acaba trencant i la molècula queda escindida en dos parts: la part important és la de la dreta, i en aquesta hi ha electrons que després del trencament s’han quedat amb energia (en altres capes) de manera que, és una molècula amb els electrons excitats.
Aquesta molècula, quan els electrons baixin a les capes d’energia basals transformaran l’energia en llum i per tant, emetran llum que anomenarem quimioluminiscent ja que el procés d’emissió de llum la disparat una reacció química.
Si és una membrana de nilon, tenim unitats de llum (en hores) en que trobem una emissió de llum important i això vol dir que les bandes quimioluminiscents que detectarem les podrem detectar amb comoditat perquè durant hores. Si fem servir la reacció de forma adequada podrem detectar llum que podrà ser captada o detectada per una càmera fotogràfica o film fotogràfic.
7 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T6 Luminol chemilumiescence Aquestes son molècules derivades del luminon o lumonol. En presència d’aigua oxigenada i peroxidasa tenim la sort que queden electrònicament excitades de manera que, en relaxar-se emeten llum, que és la que podrem detectar.
El luminol durant molts anys va estar malt vist i poc emprat perquè tenia poca emissió i aquesta la feia de forma molt ràpida de manera que, no era útil. Va existir una millora tècnica que està comercialitzada anomenada ECL (enchanced chemiluminiscence), és a dir, quimioluminescència enaltida, millorada. Aquesta millora es va aconseguir afegint en el còctel de reacció uns fenols el que provocava un augment de la luminescència, l’emissió de llum i amés quan passa una hora encara tenim una bona emissió de llum, el que ens permet treballar en bones condicions.
Observem en aquesta gràfica els resultats en presència de fenols: Hem observat que sempre la reacció és disparada per enzims.
Hem d’aconseguir que les bandes de Sanger tinguin el que han de tenir perquè just on hi ha cadascuna de les bandes es generi una reacció quimioluminiscent que emeti llum, és a dir, que les bandes en lloc de ser radioactives siguin quimioluminiscents.
Perquè el fragment de Sanger tingui incorporada aquesta estructura B (biotina) sabem que la biotina té una afinitat molt gran per una proteïna que és la estreptavidina, amb una 15 constant d’afinitat molt gran (10 aproximadament) i per tant, tot i no ser una reacció covalent es comportarà com a tal, energèticament estarà molt afavorida. La estreptavidina s’uneix a la biotina amb la fosfatasa alcalina i per tant, si tenim el substrat de Irene Bronstein podem disparar la reacció.
El que ens han dit per la biotina també comercialment s’ha aconseguit per mitjà d’anticossos (A i C) que van dirigits contra aquestes molècules, una és la digoxigenia que tindrà luminescència en presència d’etanols. La fluoresceïna també pot disparar la fluorescència.
8 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T6 La estreptavidina té un avantatge addicional respecte els altres i és que és una proteïna que té la possibilitat d’unir 4 biotines de manera que pot formar 4 complexos diferents el que ens permet utilitzar-la de forma intel·ligent. Observem en la següent imatge la seva estructura tridimensional.
Exemple de seqüenciació Primerament elaborem una clonació de la seqüència que volem seqüenciar i la incloem en un vector, fent la separació de les dues cadenes després de l’amplificació. A continuació, fem la hibridació del primer de Sanger que ha de tenir la biotina de manera que, primerament l’hem de modificar químicament. Quan ja tenim modificats els 4 tubs de Sanger tots els fragments tindran una biotina de manera que, podrem carregar el gel amb aquestes mostres.
Seguidament elaborarem una transferència a membrana on tindrem la estreptavidina que reaccionarà amb els fragments de Sanger i els unirà ja que aquesta contindrà la fosfatasa alcalina si volem fer la reacció amb dioxietans. A més a més, la membrana tindrà en el seu entorn mentre fem la incubació dioxietats de manera que, en tots els llocs on hi hagi un banda s’emetrà llum. Aquesta llum podrà ser enregistrada gràcies a un fil fotogràfic el que ens permetrà tenir una imatge al corresponent gel de Sanger.
El resultat d’aquesta experimentació és molt bo i al tractar-se de estreptavidina hem de tenir present que si és una membrana de nilon la estreptavidina té 4 unions possibles: una està gastada amb la unió a la membrana però té 3 més lliures que poden fer servir perquè l’enzim (fosfatasa alcalina) s’hi posi allà i perquè el substrat de bronstein produeixi llum que ens permetrà veure les bandes en el gel.
9 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T6 Seqüenciació múltiplex El que hem vist fins ara era seqüenciació uniplex però hem de tenir en compte que es pot millorar una mica en quant a eficiència i velocitat en l’obtenció de resultats si passem a un sistema múltiplex.
La paraula múltiplex s’inspira en la tecnologia de la comunicació. Quan la telefonia anava per cable, els electrònics van aconseguir fer passar diverses converses alhora i això era una tecnologia múltiplex. Per tant, el mateix element físic permet transferir varis missatges. En el cas de la biologia molecular també s’utilitza, és a dir, fent servir el mateix sistema físic (suport) es poden determinar seqüències.
Per poder entendre millor aquests conceptes detallarem la imatge. En Uniplex tenim un DNA unit a la membrana i malgrat això podem accedir al DNA. Com que hi ha una biotina unida al suport, es pot unir la estreptavidina que té 4 llocs d’unió per la biotina. Podem afegir 3 molècules de fosfatasa alcalina que sintetitzin un substrat adequat quimioluminiscent i que ens produeixi llum que podrem detectar (explicat anteriorment).
Per convertir els sistema uniplex a múltiplex, en comptes de tenir els primers biotimidats el que es fa és tenir com a primer una seqüència que pugui hibridar. Aleshores, la seqüència que tenim amb el primer té una biotina i podem fer la reacció de reconeixement amb la estreptavidina; podrem detectar si el primer hibrida o no perquè obtindrem llum d’un determinat color.
El fet de passar d’una situació a l’altre esdevé en seqüenciació múltiplex ja que podem fer a la mateixa membrana hibridacions amb diferents seqüències i depenent quina fem servir per hibridar, trobarem hibridació amb uns primers o uns altres. Per tant, aquesta discriminació ens permetrà hibridar diverses seqüències havent fet servir un sol gel.
10 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T6 A la imatge següent veiem un dibuix pedagògic extret d’un catàleg comercial que utilitzava les eines de múltiplex. Reconeixerem els plasmidis (1, 2, 3, 4 i 5) perquè quan fem el sistema de Sanger, farem servir primers amb seqüències diferents. Així doncs, agafarem DNA genòmic, inserirem fragments de DNA en tots els plasmidis, farem la corresponent preparació de colònies, les seleccionarem i les farem créixer totes juntes.
A continuació, fem seqüenciació de Sanger, correrem membrana.
4 carrils i transferim Seguidament a una elaborem una primera hibridació amb la sonda que correspon al plasmidi número 1 i obtindrem una sèrie de bandes quimioluminiscents que ens permetran conèixer la primera seqüència.
Com que la sonda s’uneix de manera no covalent, podem fer un rentat que ens permeti eliminar tota la sonda i tindrem de nou la membrana per fer la segona hibridació que correspon al plasmidi número 2; tornem a fer autoradiografia quimioluminiscent i rentat que ens permetrà fer-ho amb el següent i així successivament. Finalment obtindrem 5 seqüències havent fet un sol gel i això ens fa estalviar temps i material.
SEQÜENCIACIÓ FLUORESCENT AUTOMATITZADA La seqüenciació quimioluminiscent ha estat important però ho ha estat més la seqüenciació fluorescent. El motiu és que aquesta va ser la primera tècnica de seqüenciació que es va poder automatitzar i va ser l’aproximació que va permetre seqüenciar el genoma humà. La tècnica es va començar a plantejar al 1986 al laboratori de Lorey Hood, un persona molt important en aquest camp.
Van buscar una col·lecció de colorants fluorescents (fluoresceïna, rodamina, roigs de Texas i NBD) que donessin espectres de fluorescència diferents, tal com veiem a la imatge. Com el que volien era conèixer la seqüència de 4 bases diferents, utilitzaven 4 colorants diferents.
11 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T6 L’aproximació tècnica que pretenien era que la reacció de Sanger aturada en A tingués un color, l’aturada en C un altre, en U un altre i en T un altre. Van demostrar que això era possible fer-ho i per tant, podíem carregar un gel electroforètic, que es podia fer en un tub d’acrilamida, una barreja de fragments de Sanger amb aquestes propietats de fluorescència. Si teníem un detector adequat, quan apareix una banda el detector ho notarà i podrà determinar a quina base correspon la banda.
Aquest és el primer mètode comercialitzat per seqüenciar de manera automatitzada i va ser creat per Leroy Hood. Tenim un tub on anem fent les reaccions de Sanger, que recordem que sempre ha de tenir un primer que es va allargant en funció de la seqüència problema. La diferència que hi ha entre aquest mètode i el convencional és que la reacció que s’atura amb desoxiT fa servir un primer que té un colorant unit covalentment i és de color vermell i en conseqüència, tots els fragments que es produeixen per un aturament en T seran de color vermell. En funció de quina desoxi trobem, tindrem un color o un altre: desoxiC de color blau, desoxiG de color groc i desoxiA de color verd.
En la versió més primitiva el que feien era després de fer la reacció en 4 tubs, els ajuntaven en un sol tub i el carregaven al gel electroforètic de tal manera que en cada carril hi corren 4 reaccions de Sanger. Per tant, a cada carril llegirem una seqüència completa i veurem les quatre reaccions de cada problema ja que s’han combinat.
Si en aquest sistema comercial primitiu hi havia 16 carrils, això vol dir que es podien fer 16 seqüències. Imaginem que hem carregat i van avançat les bandes; les més curtes són les que més corren i les que primer arribaran allà on hi ha els detectors.
12 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T6 El detector és un sistema complex que té un làser que irradia les bandes i que té un detector. Entre el detector i la banda hi ha una col·lecció de 4 filtres que tenen 4 colors diferents i que permeten distingir el color de la banda que veiem.
Aquests filtres es mouen amb motor i el làser es mou d’esquerra a dreta i de dreta esquerra de manera que es va irradiant tota l’amplada del gel i en conseqüència, qualsevol bandeta que passi pels carrils. Hi ha variants comercials que en lloc de tenir un làser que es mou, aquest està fix i era molt potent ja que travessava tot el gel en una zona, coneguda com zona de lectura.
El resultat es llegeix tenint en compte els colors i la mida de les bandes i la seqüència problema és la complementària a la que obtenim. A la pràctica, el resultat en aquests gels es llegeix amb pics ja que d’alguna manera, la sortida s’està llegint com una mena de cromatografia. El que tens a l’ordinador és una representació amb colors de la base que tens.
Millores del mètode de seqüenciació fluorescent automatitzada En el moment en el que es va fer aquest tipus de seqüenciació es podien determinar seqüències de manera més ràpida.
Com que l’objectiu era seqüenciar el genoma humà no hi havia prou ja que es tractava d’una gran quantitat de pb i per tant, el mètode s’havia de millorar.
La primera cosa que van fer és millorar les electroforesis fent que aquestes anessin més de pressa i així llegir més parelles de bases per unitat de temps. Per aconseguir una velocitat més gran el que van fer és augmentar la diferència de voltatge.
Per tant, pel gel circulava més corrent, és a dir, ions i les cadenetes de Sanger que d’acord amb la llei d’Ohm hi ha més dissipació del calor fent que la temperatura del gel augmentés i es tornés inviable. Van intentar afegir plaques fredes davant i darrera però no va funcionar.
La solució va venir gràcies a un sistema que uns japonesos van posar a punt i que substituïen els gels electroforètics per tubs capil·lars. En aquest sistema, en lloc de tenir carrils dins d’una placa de poliacrilamida, tenim capil·lars que fan la funció de gel i on cada capil·lar és un carril. Aquests capil·lars sí que es poden refrigerar bé i anar a un voltatge de manera que el problema de la temperatura ja quedava solucionat.
13 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T6 A la imatge veiem un esquema de com funcionava aquest sistema: al final dels capil·lars hi ha una mena de tub transparent i gràcies a això, el color de la banda es podia llegir. El que feien era irradiar amb un làser que travessava tots els tubs capil·lars en aquesta zona i el detector llegeix el color que està sortint en aquell moment en cadascun dels capil·lars.
D’aquesta manera van guanyar temps i això els hi permetrà fer seqüenciacions de grans dimensions. Per una altra banda, va donar peu a crear un sistema automatitzat de capil·lars.
Una empresa anomenada Celera va proposar un repte: s’esperava que la seqüenciació del genoma humà finalitzés al 2005 i aquesta empresa va voler fer-ho al 2001 o 2002. Això és degut que van posar en marxa molts aparells automàtics de seqüenciació basats en capil·lars i d’aquesta manera s’accelera el procés varis anys. Aquesta empresa estava composada per 300 seqüenciadors automàtics en el ben entès que cada aparell fa 8 microplaques de 96 pous cada dia.
Així doncs, tenim 768 mostres per cada aparell i per dia. L’aparell farà aquesta seqüenciació de manera automatitzada i si sabem que es fa l’anàlisi de 400 bases per mostra, obtenim que cada aparell analitza unes 300.000 bases/dia.
Celera va fer això per un motiu d’interès comercial ja que tots els laboratoris del món que estaven fent seqüenciació van comprar aquest tipus de seqüenciadors capil·lars.
Cada dia el grau de seqüenciació és més potent. A part del seqüenciador automàtic, avui dia, si es tracta de fer processos repetitius hi ha robots programables que permeten simplificar molt la feina rutinària al laboratori. Amb tot això es va donar la possibilitat de fer estudis a gran escala que en aquest cas seria la genòmica. Recordem que quan els estudis de gran escala es passen a proteïnes reben el nom de proteòmica.
Estudis per determinar el genoma d’alguns microorganismes Al laboratori de Sanger l’any 1977, van seqüenciar el DNA del bacteriòfag φ X174 que té 5375 parelles de bases. Era una època en la qual encara no hi havia papers en format electrònic i no hi havia Internet, per tant, comunicar aquests resultats no era fàcil.
6 No va ser fins el 1997 que es va seqüenciar el genoma d’E. coli que té 4·10 pb. Aquest mateix any també va sortir el genoma dels llevats.
14 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T6 SEQÜENCIACIÓ DEL GENOMA HUMÀ Quan es va voler anar cap al genoma dels humans no es tenia la capacitat informàtica per poder incorporar totes les seqüències que anaven sortint. El desafiament no només va ser a nivell experimental (elaboració d’electroforesi....) sinó que també va ser informàtic. Els científics que es van encarregar d’iniciar el procés de seqüenciació constituïen el International Human Sequencing Consortion (Consorci per la seqüenciació internacional del genoma humà) i estava distribuït per tot el món, sobretot americans i anglesos, i volien aconseguir finalitzar la seqüenciació en 2005. Cal recordar que ho van aconseguir en 2001.
Cada setmana posaven les dades en una base pública però quan això ja estava més avançat va aparèixer l’empresa Celera que hem nombrat anteriorment i que tenia una iniciativa privada i per tant, no compartia les seves dades però sí que disposava de les seqüències que s’anaven penjant.
Totes dues iniciatives van arribar a obtenir la seqüenciació del genoma humà en el mateix any, el 2001. La iniciativa pública estava dirigida d’una manera privada per Collins i la privada per Venter. Va costar molt treball aconseguir aquesta seqüenciació i la seva publicació va tenir una gran repercussió.
Al 2001, el total del genoma seqüenciat no era pas del 100% sinó que era de l’ordre del 80%. Hi ha seqüències que costa molt de reconèixer ja que tenen elements repetits. Anys després d’aquesta publicació va sortir una segona versió però encara no era completa. Avui dia no coneixem tot el genoma ja que existeixen dificultats per poder-ho fer.
El grup privat va fer servir un mètode que s’anomena shot gun i que vol dir disparar sense molta precisió. Van aprofitar l’èxit que havien tingut en la seqüenciació de genomes molt més curts i el que feien era agafar el genoma complet d’organismes senzills, trencar-lo aleatòriament i seqüenciar-lo de forma aleatòria també. Després, per solapament aconsegueixen la seqüència completa de genomes senzills. Quan Celera es va iniciar en la seqüenciació del genoma humà va utilitzar aquest mètode. Cal tenir present, que en una estructura de tanta envergadura com la del genoma humà es necessita d’alguna entitat que construeixi millor la infraestructura del genoma i això era el que feia la iniciativa pública.
El grup públic a partir de trossos grossos de DNA, d’uns 100 a 200 kb, eren clonats en bacteris que després s’ordenaven i quan ja estaven ordenats, s’agafava cadascun d’aquests trossos i es trossejaven aleatòriament i es seqüenciaven. Aquesta tasca metòdica d’ordenació no la va fer Celera.
15 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T6 Aleshores, amb l’ajut del bastidor que estaven muntant els de la iniciativa pública, Celera va aconseguir tenir la seqüència simultàniament. Avui dia no hem cobert tot el genoma ja que arriba un moment en el qual has de fer el solapament dels trossos que has seqüenciat. El problema resideix en el fet que hi ha moltes seqüències repetides i per tant és difícil esbrinar quin és el solapament correcte ja que depenent quin solapament facis, obtens una seqüència o l’altre. Cal tenir present que sí que arribarem a tenir la seqüència completa del genoma ja que avui dia tenim sistemes de seqüenciació que són molt més acurats i que veurem més endavant.
Open reading frames Si ens anem al codi genètic, tenim uns triplets que corresponen a l’aturada de la transcripció. Aleshores, tot això s’ha de fer en genèric ja que tenint la mateixa seqüència, segons com es llegeix de 3 en 3, la traducció ens portarà a seqüències proteiques diferents. Quan tenim la seqüència no sabem realment com es fa la transcripció i la posterior traducció. El que sí que hi ha és que si et trobes amb aturades, allà el procés de transcripció s’atura.
El que es fa es agafar la seqüència que té dues cadenes i representar les 3 possibles lectures per cadascuna d’elles.
Quan els punts d’aturada (ratlles) estan molt propers, vol dir que no es pot codificar una proteïna allà. Però quan es troba una zona on es pot aconseguir una tirada suficientment llarga per fer una proteïna obtenim un open reading frame, és a dir, una seqüència de lectura oberta.
Això els hi va permetre determinar quants gens hi ha aproximadament en el genoma humà. En el cas de Celera aproximen que hi ha uns 39.114 gens, mentre que la part pública va estimar uns 31.780 gens. Cal tenir present que també es pot donar splicing, modificacions post traduccionals... i per tant, d’una gen poden sortir varies proteïnes.
16 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T6 Representació de la seqüència que trobem en el genoma humà En el cas dels bacteris, com més gran és el genoma vol dir que tenim més gen, és a dir, hi ha una linealitat. En canvi, quan ens anem a organismes amb nucli la cosa és diferent; per exemple, el ratolí i l’arròs tenen més gens que els humans.
Relativament, hi ha pocs gens de manera que si en el genoma complet remenem i busquem quina part del genoma conté regions codificadores de proteïnes (exons) veiem que únicament correspon a un 1,5%, és a dir, una fracció molt petita que ens està indicant que hi ha molt DNA que no està relacionat amb la síntesi de proteïnes. Si comptem els introns també, la proporció és més raonable i puja fins a un 30% del DNA genòmic. De tota manera, aquesta estructura primària no ens hauria de sorprendre ja que havíem vist que en les corbes Cot hi havia una gran quantitat de DNA repetitiu i de seqüència única.
Dins d’aquests elements repetitius trobem els transposons que són els elements genètics mòbils que corresponen a un 45% del genoma. En diferenciem:  LINES: "Lines Interspersed Repeated Sequences"  SINES: "Short Interspersed Repeat Sequences" El 35% fa del DNA fa referència a gens orfes que són gens dels quals es desconeix la funció. Així dons, trobem seqüències que probablement són un gen però no sabem quina és la seva finalitat funcional. Quan un laboratori troba una possible funció per a un gen orfe el que fa és una anotació que s’introdueix a la base de dades que es tenia.
17 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T6 Les patents i la biologia Va haver un investigador que va voler patentar un bacteri pseudomones que és capaç de digerir el petroli que aboquen els vaixells a les costes. El jutge encarregat del cas va afirmar que els organismes vius no es podien patentar.
Aquesta negativa es ca canviar quan va arribar la enginyeria genètica fent que sí que es poguessin patentar seqüències de DNA. Els laboratoris púbics i privats, avui dia, poden patentar seqüències.
El fet de poder patentar seqüències sempre ha estat molt criticat perquè en la filosofia de les patents hi ha aquella màxima que tan sols les invencions humanes poden ser patentades i els productes de la natura els fa la natura i per tant no poden ser-ho. Així doncs, el DNA d’un organisme el fa la natura i d’entrada no es podria patentar.
A l’esquema veiem com el cromosoma 1 té una gran quantitat de patents. El dia 13 de juny de 2013, la cort suprema dels EEUU va prohibir que es patentessin seqüències de DNA natural.
UTILITZACIÓ DE LES POLIMERASES Les DNA polimerases s’han convertit en un gran negoci de la indústria bioquímica, totes les tècniques de seqüenciació fan servir polimerases y aleshores les empreses que les produeixen han procurat anar oferint un nou producte tècnic perquè hi hagi més eleccions a favor de les empreses.
Observem en la següent taula un recull de les propietats de les polimerases que s’han de tenir en compte quan un far la tria o vol un mètode nou de seqüenciació. Principalment ens fixem en dos aspectes:  Processivitat: les polimerases tenen tendència a unir-se amb el DNA, iniciar el procés de replicació però sovint es desuneixen i tornen més tard a unir-se per continuar la síntesi. La processivitat és la quantitat de parelles de bases que pot arribar a llegir una polimerasa sense desunir-se de manera que a major processivitat poden fer tires més llargues d’una vegada.
 Velocitat de polimerització: la processivitat a més afavoreix a la velocitat de polimerització, que la augmenta.
A més es consideren altres propietats, tenim vàries característiques i polimerases que són comercials. La polimerasa I de E.Coli té una activitat 3’-5’ exonucleasa i una activitat 5’-3’ exonucleasa. Aquestes dues activitats són importants per la síntesi natural del DNA perquè són activitats que fan un addició del DNA que s’està produint i aquest és un aspecte positiu (sobretot en enginyeria genètica) 18 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T6 En canvi, quan un fa la seqüenciació aquestes activitats són negatives perquè el que provoquen, al ser exonucleases és que els fragments de Sanger corren perill de ser tallats i crear una heterogenicitat en els fragments, un aspecte negatiu.
D’aquesta manera hem de tenir present que no convé que es facin talls posteriors en els fragments.
En la següent taula observem per exemple que la polimerasa de T7 no té aquestes activitats, Klenow només presenta l’activitat en 3’-5’ i hi ha mutants d’aquesta polimerasa que no tenen cap activitat (i són comercials).
Nick translation Les nick translation és una aplicació que es fa servir per introduir marques a les sondes utilitzades en experiments d’hibridació. En aquestes s’utilitza una marca radioactiva o fluorescent que es pugui utilitzar per mitjà de tècniques de luminescència.
Tenim un DNA dúplex i volem aconseguir una sonda marcada i per tant, apliquem primer un enzim que elabora talls en monocadena de manera que tenim un tall de monocadena i aleshores, fem servir les propietats 5’-3’ exonucleasa de la DNA polimerasa I de E.Coli (la nativa té aquesta activitat que ara ens convé) de manera que, si actua sobre el tall aleshores pot anar tallant aquesta cadena superior. Com que alhora és una polimerasa també té l’activitat 3’-5’ polimerasa el que permetrà que vagi incorporant nucleòtids que si tenim la precaució d’incorporar precursors marcats radioactivament la nova cadena sintetitzada serà radioactiva i aquesta cada cop és fa més llarga.
Rarament, molt rarament, la natura simplifica la tasca dels científics però a vegades sí, les DNA polimerases són molt bones en la seva funció de síntesi de DNA de manera que quan s’està fent una nick translation si en lloc de posar els nucleòtids naturals incorporen els nucleòtids químicament modificats amb la biotina les polimerases els introdueixen dins la cadena creixement de manera que, aquesta incorporarà el que haguem posat (fluoresceïna...).
La fluorescència és detectable perquè és fluorescent i per tant, la podem detectar per quimioluminescència o per un glotis de fluorescència.
19 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T6 Ús d’una particular polimerasa: transcriptasa inversa La transcriptasa inversa apareix en la natura i té la capacitat de sinteritzar DNA a partir de RNA i és molt important des del punt de vista científic i mèdic perquè aquesta particular transcriptasa inversa és la del virus del VIH.
La majoria de les polimerases tenen una estructura semblant ja que es tracta d’estructures que s’han preservat molt en el temps.
La transcriptasa inversa serveix per tenir sondes a partir de missatgers, a més també en aquest cas la natura ajuda molt; imaginem que tenim un missatger del qual volem tenir una sonda ja que la necessitem per un missatger. Els missatgers tenen una polia (A) en l’extrem 3’ que permet d’entrada tenir un primer adequat per fer el que volem, hem de tenir l’oligo T per tenir un lloc on hibridar i poder iniciar la síntesi del DNA.
En aquest moment apliquem la transcriptasa inversa, aleshores tenim el DNA complementari que es sintetitzarà a partir d’aquesta seqüència. Quan acaba aquesta particular polimerasa (de fer la còpia complementaria) elabora de 10-20 parelles de bases de més, són bases que sintetitza de forma addicional i curiosament fa servir la part final que ha sintetitzat com a motlle per continuar fent més síntesi de manera que, es produeix una petita anella perquè aquesta polimerasa fa servir de motlle la última part sintetitzada.
L’aspecte anterior ens permetrà avançar en la feina experimental; per tal que tot el que produïm sigui DNA (encara tenim RNA) ens volem treure el RNA original i això ho podrem fer amb un tractament amb medi alcalí, on s’eliminarà el RNA i si apliquem una concentració adequada d’hidròxid de sodi el RNA desapareix, queda hidrolitzat, mentre que el DNA queda intacte. El motiu per el qual la presència de concentracions de medi alcalí són tant hidrolitzants és perquè el RNA té un grup hidroxil que el DNA no té i en presència de medi bàsic l’hidroxil pot elaborar una reacció amb el fosfat el que provoca que la cadena de RNA es trenqui i s’elimini el dúplex.
El loop anterior que ha elaborat la polimerasa (els DNA naturals no el tenen) es pot tallar per mitjà d’un enzim comercial, la nucleasa SI que elabora un tall en l’extrem de manera que, tenim un DNA complementari (cDNA).
20 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T6 PCR: polimerase chain reaction Vem comentar que l’any 1985 Kary Mullis elabora una patent d’aquesta reacció que li acabarà donant el premi Nobel de química. Aquesta reacció la podríem considerar com una màxima aplicació de la química amb una simplificació dels problemes que la biologia molecular hagués tingut en compte.
La PCR es bassa en una cadena de DNA amb els primers adequats hibridats i sobre la qual s’aplica una polimerasa; es tornen a separar les cadenes, introduir primers i la polimerasa. Aquest cicle es repeteix 22 vegades el que ens permet 6 obtenir 10 copies del DNA original i per tant, tenim una possibilitat d’amplificar ràpidament i de forma molt gran una molècula de DNA.
El cicle que s’ha d’elaborar és el que queda representat en la següent imatge: desnaturalització del DNA a alta temperatura – unió dels primers – síntesi – desnaturalització... com les temperatures de desnaturalització són molt altes sabem que la majoria de polimerases dels organismes no les suportarien. En la natura però, tenim organismes extremòfils de manera que, s’utilitzen les seves polimerases. El termus aquaticus té una polimerasa anomenada atack polimerasa que presenta una temperatura òptima de funcionament a 75 graus i que a 94 graus encara és estable i funcional.
21 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T6 UTILITZACIÓ D’ESPECTROMETRIA DE MASSES És un mètode que encara es fa servir i el que ens interessa és que, mitjançant l’espectrometria de masses es pot conèixer molt bé la massa que tenen les molècules que s’estan estudiant.
L’espectrometria es pot fer servir per seqüenciar perquè si tenim fragments de Sanger gràcies a l’espectrometria podem conèixer la massa molecular i en un gel electroforètic de Sanger separem els fragments en base a la seva massa molecular, en aquesta tècnica però, en comptes d’elaborar una separació electroforètica determinarem les masses per mitjà d’espectrometria.
En la versió més primitiva de la tècnica, el que es fa és elaborar les 4 reaccions de Sanger i cada tub es porta a l’espectròmetre de masses i obtenim una sèrie de pics, dels quals sabem exactament la massa. Això simplifica el procés d’electroforesi i pots determinar la seqüència. Les reaccions del A,C,G i T donarien fragments de massa molecular creixent, que per mitjà d’un programa informàtic podríem determinar la seqüència.
També podem portar aquesta tècnica al límit, agafar la seqüència i fragmentar-la, trencar els nucleòtids i agafar el producte i posar-lo directament en l’espectròmetre de masses. En aquest cas obtenim una gràfica amb els pics més units (imatge dreta) que en el cas anterior però com la tècnica té tant precisió, en funció de la distància entre els pics podem conèixer la diferència de pes molecular i per tant, podem saber si es A/C/T/G.
22 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T6 Els autors destaquen que la tècnica és tant bona que és millor que l’electroforesi ja que ens diuen que si elaborem una seqüenciació de la mateixa seqüència en el gel electroforètic i en el masses observem en la imatge anterior que per mitjà del masses veiem que hi ha 4G seguides mentre que en l’electroforesi en canvi, en aquest punt només trobem 3 bandes de G. Això és conegut com que quan hi ha 4G seguides es produeix un problema anomenat compressió, que provoca que en la lectura del gel es perdin bandes i per tant, perdem informació.
Charles Cantor mitjançant espectrometria de masses va trobar el primer test per detectar si hi ha trisomes en el cromosoma 21 (síndrome de Down) a partir de la sang d’una mare sense elaborar un procediment perillós. Aquesta tècnica està aplicada en molts hospitals.
PICOLITRE REACTORS Aquest és un mètode de seqüenciació comercial que actualment presenta el nom de equip 455 Life Sciences. Aquest és un sistema (explicat al problema 6) molt diferent i més potent als explicats anteriorment però té l’atractiu que la recerca en aquest punt és interdisciplinària de manera que, els aparells s’han tornat més sofisticat.
La seqüència que es vol conèixer es fragmenta en molts trossos i cada tros s’uneix a una petita microesfera, que se’ls hi farà la reacció d’amplificació i per tant, podrem tenir moltes còpies per tal de veure les reaccions. Les amplificacions es fan en volums tant petits com en unes emulsions d’oli on en cada goteta d’oli tenim esferes amb una seqüència en la que s’elaborarà la seqüenciació.
Els productes es fan passa per una cèl·lula formada per forats i el sistema està connectat amb un dispositiu òptic de manera que, el que passa pel que fa a les reaccions quimioluminiscents que es produeixen a cada pou (estan relacionades amb les reaccions de Sanger). A cada pou, que és molt petit, hi ha doncs un sistema òptic que permet mesurar si surt o no llum i es mesura alhora tota la llum que surt o no de cada pou el que ens permet determinar la seqüència de cada molècula.
Aquesta manera de seqüenciar també s’anomena pyrosequencing perquè la reacció de detecció s’elabora amb un sistema sofisticat quimioluminiscent de varis enzims que permeten reconèixer si s’incorpora en un pou un determinat nucleòtid.
23 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T6 REVERSIBLE TERMINATOR Aquest també és un mètode comercial basat en la illumina. La polimerasa allargarà la cadena però en aquest cas tenim un nucleòtid (A) que s’incorporarà a la cadena perquè té 3 fosfats de manera que, perdrà un pirofosfat i l’altre elaborarà una unió amb el nucleòtid anterior. Aquest nucleòtid del que parlem és un nucleòtid alterat i modificat on al final observem un fluoroform.
Recordem que les polimerases incorporen nucleòtids modificats de manera que, la modificació no és important en el procés. El que té d’interessant aquesta tècnica és que quan es canvia el medi la part marcada s’escindeix i es perd el fluoroform de manera que, quan l’aparell li convingui el podrà tallar (lloc de tall marcat en vermell). A més aquesta estructura (A) encara que hagi perdut el fluoroform presenta encara una modificació importat i és que en 3’ té un –OH modificat químicament de manera que, la cadena ja no pot créixer perquè hi ha un hidroxil però quan a l’aparell li convé canvia el medi el que provocarà la pèrdua d’aquest hidroxil i l’aparició de l’estructura (B).
La idea és incorporar un nucleòtid que reconeixerem que està perquè té un fluoroform i quan aquest ja s’hagi llegit activarem la molècula perquè després pugui incorporar-se el següent nucleòtid del fragment de Sanger.
Observem en la següent imatge un suport de vidre; suposem que els investigadors volen conèixer la seqüència de diversos trossos de DNA (milers) i aquests fragments per tècniques bioquímiques se’ls incorporen unes seqüències en els extrems que permeten la unió a la superfície del vidre de manera que aquest contindrà la seqüència llarga.
24 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T6 No podríem treballar amb aquesta tècnica si de cada seqüència només tenim una còpia perquè no és una tècnica prou sensible, aleshores, convé que cada cadena que volem seqüenciar presenti moltes còpies de manera que, s’elabora una PCR in situ per obtenir aquestes copies. Hi ha molts punts que contenen diverses seqüències i moltes copies de manera que, ja podem elaborar la seqüenciació: sabem que el nucleòtid A serà vermell, T verd, C blau i G groc així doncs afegim la polimerasa i els primers el que permetran la seqüenciació a l’estil de Sanger.
Iniciem el procés i com que la reacció s’atura perquè hi ha un aturador (agent de bloqueig que tapa el –OH de l’extrem 3’) en el pou on entri una A tindrem fluorescència vermella i així successivament amb cada nucleòtid. La màquina té el temps suficient per fer una foto i veure en la superfície de vidre els colors que hi ha en cada punt. Hem de tenir present que a cada pou pot entrar qualsevol dels nucleòtids però el color dependrà del que es quedi, del que elabori la unió i això segueix la cadena complementaria.
Així doncs, per mitjà d’aquesta tècnica estem identificant el primer nucleòtid complementari a la seqüència problema.
Ara volem conèixer el següent nucleòtid de manera que, canviem el medi, eliminem la fluorescència i l’agent de bloqueig i tornem a injectar els fluoroforms de manera que, ara es produirà una unió diferent. Si elaborem aquest pas al llarg del temps aconseguim tenir la cadena complementaria.
SEQÜENCIACIÓ PER HIBRIDACIÓ Aquesta tècnica també està comercialitzada amb el nom de solid applied biosystems. De totes les seqüenciacions de les que hem parlat és la que ha tingut més patents industrials.
És possible plantejar-se la seqüenciació com una hibridació. Tenim la nostra seqüència problema (enquadrada a dalt) i aleshores hem d’imaginar que tenim una col·lecció d’oligonucleòtids que tenen 8 nucleòtids i per tant, tenim una col·lecció molt amplia que ens permet elaborar hibridacions i trobar la seqüència problema que s’ha hibridat amb un tros de la seqüència problema d’uns determinant oligonucleòtids. Així doncs, sabent les seqüències que han hibridat poden anar col·locant les coincidències unes sobre les altres de manera que, el conjunt formen la seqüència complementaria a la nostra seqüència problema.
8 El que és interessant i suposa un problema és que tenim 4 = 65536 octonucleòtids per poder fer hibridacions amb qualsevol seqüència (a mesura que els oligonucleòtids són més llargs també augmenten les possibilitats). L’altre problema que se’ns presenta és que no podem conèixer el nucleòtid que ha hibridat en la mostra.
El primer problema (gran quantitat de seqüències) va ser resolt per químics mentre que el segon (quina seqüència hibrida) va ser resolt per moltes disciplines.
25 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T6 Aconseguir la combinació d’oligos Les tècniques que fan servir la irradiació de la llum són anomenades tècniques fotoquímiques i estan basades en tècniques de microelectrònica actual de manera que, abans d’explicar la versió de la biologia molecular farem una petita introducció a la mioelectrònica.
El que es fa servir en aquesta ciència és la producció de circuits impresos molt petits i això ho fan dissenyant el circuit imprès amb mides macroscòpiques (grans) que permetran fer relleus en una superfície anomenada oblea, en la qual es traduiran els circuits. Aquesta estructura dissenyada s’irradia amb llum de longitud d’ona adequada i es projecta per mitjà de lents en la oblea una imatge reduïda del patró que teníem.
Així doncs, en una oblea tindrem molts circuits impresos perquè copiarem molts cops aquesta imatge. Irradiem amb llum d’energia suficient per provocar alteracions de la superfície i aquestes permeten que es pugin fer reaccions químiques que permeten fer al final, allà on els dissenyadors volen, zones conductores i no conductores. Aquest procés d’irradiació i tractament químic s’elabora molts cops.
En la síntesi d’oligos es va fer una cosa semblant: teníem una superfície en la qual hi ha hidroxils que estan bloquejats amb un grup químic anomenat (X) i llavors en el cas de les oblees per aconseguir que la llum vagi on ha d’anar es posa una espècie de màscara, una superfície foradada en algun lloc (aquí també s’aplica aquesta màscara) de manera que, la llum pot entrar en determinats forats però en altres no.
Aquest grup de bloqueig marxa quan rep els fotons de la llum de manera que, ens queda un hidroxil. A continuació s’uneix el nucleòtid que es desitja, en aquest cas es vol introduir una T de manera que, es canvien les condicions, s’afegeix el nucleòtid però aquest només s’introduirà en aquells llocs on el grup (X) hagi estat eliminat. A continuació es posa una altra màscara de manera que, la llum entrarà en unes altres posicions i conseqüentment podem introduir nucleòtids allà on vulguem.
26 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T6 Podem veure en la següent imatge que el nombre d’oligos creix exponencialment i es pot arribar fins a un milió d’oligos.
Per fer-ho hem d’anar elaborant cicles, rondes d’irradiacions amb màscares diferents i al final obtindrem una tira de llocs sobre una superfície on en cadascuna de les posicions tenim molts nucleòtids anomenats xips de DNA.
Elaborar la seqüenciació Per poder fer la seqüència primer s’ha de saber quin oligo es vol i amés posar el DNA que es vol seqüenciar i on aquest hibridi ens dirà la seqüència complementària. Hem de tenir present que aquesta tècnica va ser matematitzada per una empresa (affimetrio).
El líquid que conté el DNA que volem estudiar es posa en el forat, s’incuba a la temperatura adient per elaborar la hibridació i es fan els rentats que es vulguin fer i a tot arreu on hi hagi complementarietat molt restringent (aquelles seqüències que són idèntiques) ens permetran conèixer la seqüència complementaria a la donada. Hem de tenir present que tenim aproximadament 1 milió d’oligos de manera que, l’estructura sobre la que s’elabora és molt petita on en cada punt hi ha un oligo diferent.
27 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T6 Lectura de la seqüència: fabricació de microrrays En la primera versió per poder veure si un punt tenia o no fluorescència (hem de tenir present que la mostra ha estat marcada amb un fluorescent) per llegir els punts respecte els altres es va fer servir un microscopi de fluorescència, que llegeix tots els llocs i mira on hi ha hibridació i a partir d’aquesta es podia fer la seqüència.
Actualment però aquest mètode no és fa servir sinó que s’han generat mètodes de seqüenciació per hibridació més fàcils i còmodes. Aquest mètode es la base de moltes tècniques com la producció de microrrays de DNA o chips de DNA que avui en dia s’utilitzen en diverses disciplines.
La idea és fabricar microrrays amb tècniques diverses. Observem en la següent taula les diferents maneres d’obtenir microrrays i fins ara hem parlat de les tècniques de fabricació que depenen de màscares i fan servir la llum. Hi ha més tècniques, una de les que es fa servir més és el contract printing i el printing sense contacte, que seria equivalent a la impressió que elaboren les impressores de tinta.
Fruit d’això s’han generat tecnologies que han donat lloc a la transcriptòmica, que està basada en la biologia dels microrrays. La idea és veure si en un determinat teixit s’expressen uns gens o uns altres i si s’expressen molt o poc.
Aquest estudi també es vol portar a nivell de molts gens alhora.
Tindrem com a base un chip de DNA on hi haurà moltes seqüències posades a llocs concrets i coneguts de manera que, agafarem el teixit d’interès, extraurem els missatgers i elaborarem una hibridació amb microrrays per veure quins són els llocs on el missatger queda hibridat el que ens donarà la seqüència complementaria de manera que, sabrem els possibles mRNA que existeixen en el teixit i quins no, i per tant, sabrem l’abundància d’aquests per la intensitat del senyal.
28 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T6 Això es pot fer amb molts gens alhora; observem un exemple en la següent imatge. El que volien fer era estudiar si hi havia expressió dels 1800 gens diferents que estarien posicionats ordenadament. En aquest estudi van veure diferents tumors de diferents pacients i quins missatgers tenien i en quina abundància. Els clínics poden comprovar si tot un mateix càncer, per exemple de pròstata, té el mateix tipus de tumor i això permet fer un diagnòstic de quin tumor té cada pacient i si hi ha sort, orienta al clínic per iniciar un tractament de quimioteràpia o no, de manera que estem parlant de medicina personalitzada en base a l’anàlisi de biologia molecular.
MÈTODES DE SEQÜENCIACIÓ DE FUTUR Aquests mètodes es poden anomenar com mètodes de nova generació i en iniciar-se tot el procés per obtenir aquests mètodes es pretenien dos coses bàsicament:  Simplificar i fer més petits els aparells  Automatització (això ja ho havíem vist en els de segona generació, en els últims estudiats) Tot plegat es resumeix en un concepte anomenat labs on a chip, és a dir, tenir el laboratori dins d’un petit espai que podria ser un chip. Un exemple és un aparell que elaborés una seqüenciació i a més, si li donem una mostra de sang i la introduïm el que faria seria extreure el DNA, amplificar-lo, preparar-lo i enviar-lo cap al DNA array per fer la seqüenciació o bé per fer la hibridació del DNA. Això es podria fer amb volums molt petits que es poden dispersar fàcilment de manera que parlem de mètodes microfluïts. Hem de tenir present que si volem treballar amb volums petits les tècniques de pipetejar antigues no funcionen i han de ser electròniques.
Aquests aspectes inicialment van ser un plantejament però en l’actualitat ja hem arribat, tenim aquest tipus d’instrumentació en els laboratoris.
29 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T6 Tècniques plantejades fa uns anys Seqüenciació d’una sola molècula La seqüència sempre té una fase d’amplificació per tal de tenir prou mostra on la vulguis tenir i així poder-la seqüenciar. En la imatge veiem com agafem una molècula, la fixem en un lloc concret i posaríem una exonucleasa que aniria tallant aquesta seqüència i el nostra sistema hauria de ser amb un flux ideal perquè una vegada s’anessin tallant les mostres no es barregessin de manera que aniran arribant al detector de forma ordenada i podrem llegir un color el que permetrà a un ordinador adjacent anar llegint la seqüència.
Hem de tenir present que elaborar un espectre d’un sol fluoroform es plantejava des del punt de vista tècnic com un desafiament important.
DNA chips Els autors plantegen que sempre detectem amb fluorescència i és el més habitual de manera que, van pensar en inventar altres maneres de detecció. Una proposta és tenir oligos que pertanyen a un determinat gen, sondes d’un determinat gen (sonda per un tros del gen) que estan en dues esferes conductores. Tal com es mostra en la figura a l’esquerra no passa corrent però si la seqüència del gen que busques o de la mutació que busques hibrida amb les seqüències anteriors això provoca que les esferes s’acostin de manera que, el corrent pot passar.
Aquest és doncs un estudi que sense utilitzar la fluorescència tindrem un positiu d’una hibridació d’una seqüència com podria ser la detecció d’una mutació per mètodes no òptics ni fotogràfics.
30 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T6 Tècniques ja aplicades en l’actualitat De la ma de bioquímics, enginyers i informàtics ha anat movent-se amb moltes idees i al final s’han aconseguit 2 mètodes comercials que fan us de diferents tecnologies per tal d’aconseguir la single – molecule és a dir, la seqüenciació de molècules úniques de DNA.
Ion torrent Aquesta és una tècnica comercial i viable. Està basada en posar dins d’un chip el DNA que volem seqüenciar (aquest està torcejat) i aleshores en cada petit espai d’aquesta cel·la ens hem d’imaginar que hi ha una molècula de DNA que està allà agafada per una polimerasa i aleshores l’aparell té un sensor de pH (de protons) per tota la superfície.
La mida on es dóna la seqüenciació de moltes molècules alhora és molt petit (com una ungla). Imaginem que en l’espai tenim moltes polimerases i cadascuna d’elles té una molècula de DNA unida en aquesta polimerasa i aquesta superfície on es desprenen un protó ho nota i l’ordinador ho enregistra. S’està produint per cada cop que s’incorpora un nucleòtid s’allibera un protó de manera que, aquest protó ens serveix per enregistrar la polimerització.
L’aparell funciona així: entren les T i a tos els punts on aquesta es pot unir s’allibera un protó i l’ordinador ho enregistra.
Seguidament s’elabora un rentat, entren les G de manera que allà on s’uneixen es tornaran a alliberar protons i això es repeteix amb les 4 bases nitrogenades. Aquest cicle de les 4 bases nitrogenades s’elabora molts cops.
Nanopore sequencing Es tracta de tenir una membrana i una proteïna que tingui un porus per el qual entri un DNA monocadena (semblant al cas anterior). Imaginem un lloc d’una superfície on està aquesta membrana, aleshores, el DNA es posa al porus i es mou dins d’aquest perquè existeix un camp elèctric per la membrana de manera que, es com si el DNA passés per un porus i vol anar cap a l’interior d’aquest perquè hi ha més càrrega positiva.
A mes d’introduir una diferència de voltatge s’introdueix una diferència de potencial elèctric de manera que, segons quin sigui el nucleòtid que passa per l’entrada a l’interior de la membrana el corrent elèctric que hi ha entre cada punt canvia de manera que, la lectura de la seqüència depèn dels canvis que detecta l’aparell dels punts; si el corrent té un valor intermedi sabem que és una T, un valor alt una G, ....
L’estructura es pot substituir per grafè (carboni pur elaborant una capa monoatòmica) de manera que, fent servir aquestes superfícies amb forats per els quals passa el DNA sabem que el grafè és conductor de manera que l’aparell pot mirar la seqüència. Es tracta d’una fusió de la nanotecnolgia i la seqüenciació del DNA.
31 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T6 Avantatges de les dues tècniques anteriors En aquestes tècniques hi ha un estalvi respecte les anteriors en el temps ja que en cap d’elles és necessari l’adquisició d’imatges, és a dir, no tenim imatges o colors, en aquest cas obtenim uns resultats directes. A més, un seqüenciador basat en imatges necessita d’una gran memòria i ena quest cas en cada punt es gasta poca memòria de manera que, podem emmagatzemar molta informació en un tamany informàtic petit, de forma que, la despesa de memòria que elaboren aquests seqüenciadors és menor.
VALORACIÓ DE L’ESTAT ACTUAL Actualment per 1000$ pots tenir un genoma complet seqüenciat gràcies a aquestes tecnologies de manera que, actualment podem elaborar moltes seqüències.
Observem el següent article que ens indica la quantitat de genomes que tenim quasi complets (gràfic esquerra) on es pot veure que hi ha un creixement progressiu molt notable. El creixement és d’aquesta manera perquè cada vegada el nombre de Kb/dia i màquina al llarg dels anys també va creixent exponencialment (gràfic dreta).
Hi ha casos molt potents com un anunci al 2010 on laboratoris de seqüenciació de Xina varen comprar 128 seqüenciadors ilumina i en conjunt permetien la seqüenciació de 1000 genomes humans/dia.
Durant molts anys van existir projectes genètics en marxa, que actualment són més normals perquè ja s’ha arribat a ells.
Cal destacar principalment dos:  Detectar les 50 variables que influeixen en els diferents tipus de càncer. La voluntat no era fer una seqüència de tots els càncers sinó fer la seqüència de totes les variants de càncer que hi ha (actualment tenim una gran quantitat)  En 2010 era important el projecte dels 1000 genomes humans seqüenciats (Watson té el seu genoma seqüenciat) 32 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T6 Cal remarcar altres notícies interessants en el món de la seqüenciació.
 Kraig Venter ha fundat una empresa (fa relativament poc temps) que permet seqüenciar 40.000 genomes humans de gent que pagarà per tenir la seva seqüència. Amb els diners que recapti permet lluitar contra l’envelliment de la població i altes malalties.
 Barcelona tindrà un dipòsit de dades internacionals (dades genòmiques i fenotípiques) de 100.000 persones de manera que serà un gran estoc de dades perquè els investigadors les puguin consultar.
Actualment el que passa és que la seqüenciació ha arribat a l’abast de tothom com per exemple la paleontologia o la antropologia física/biològica ho utilitzen perquè es pot seqüenciar un genoma fragmentat. També és molt utilitzada en el cap de la bioquímica, biologia molecular i medicina.
Actualment ens trobem en un moment tecnològicament molt potent i és un moment de progrés empíric del coneixement científic. Tot i que siguin temps de progrés hem de tenir present que és coneixement empíric mentre que la teoria es manté constant amb petites modificacions.
Avui en dia també es pot aplicar un anàlisi prenatal (anteriorment hem explicar la determinació de trisionomies a partir de sang de mare) que podria arribar a ser complet de manera que, si no trobem camins ètics moltes famílies viuran angoixades pensant que hi ha mutacions puntuals en el genoma dels seus fills que podrien causar determinades malalties.
SÍNTESI D’OLIGONUCLEÒTIDS AUTOMATITZADA Fase sòlida Aquest tema té un annex que tècnicament és important i és la qüestió de la fase sòlida. Això ho veurem perquè els sintetitzadors d’oligonucleòtids fan servir aquesta tecnologia química. Per tal de saber què és això de la fase sòlida veurem uns temes que no són de síntesi d’oligos però estan bé per saber de què tracten.
Es tracta d’aplicar el concepte de fase sòlida a través de mecanismes magnètics. La idea en aquesta situació és agafar i unir el DNA a boletes magnètiques a través d’ estreptavidina fent que les cadenes o sondes de DNA estiguin unides per un extrem a les boles. Això permet simplificar molt ja que imaginem que en el tub tenim molècules de DNA dissoltes i que volem separar-les del líquid; si són molècules de DNA petitones que són molt solubles, hauríem d’aplicar una gran força centrifuga durant molta estona la qual cosa consumeix temps i electricitat. Si aquest DNA està enganxat a les boletes magnètiques i posem el tub a un magnet (iman) fora del tub, les boletes aniran a enganxar-se i podrem extreure el líquid i introduir un altre que ens interessi. Aquest és el concepte de fase sòlida que en aquest cas està mediatitzat per un camp magnètic. Es pot aplicar a la seqüenciació del DNA i simplificar el procés però no ho veurem en detall.
33 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T6 Mitjançant la fase sòlida amb boletes magnètiques aconsegueixen purificar una proteïna que s’uneix a una seqüència determinada de DNA. Tenim proteïnes barrejades, algunes de les quals s’uniran a la seqüència, de manera que si afegim boletes amb el DNA únicament s’enganxaran aquelles proteïnes que s’hi poden unir. Si apliquem un magnet, totes les molècules aniran a parar allà on tenim el imant i podrem xuclar el líquid que ens permetrà emportar-nos aquelles proteïnes que no s’han enganxat.
Per assegurar-nos que no s’han enganxat proteïnes amb baixa afinitat, s’afegeix un DNA de seqüència aleatòria en una gran quantitat fent que les proteïnes que no estaven unides per una gran afinitat s’uneixin a aquest DNA; això és per un equilibri químic ja que recordem que hem afegit una gran quantitat de DNA aleatori. A continuació, tornem a posar el magnet, xuclem per emportar-nos les proteïnes que havien quedat dissoltes i apliquem un líquid net que contingui les condicions perquè se separin les proteïnes que s’havien unit específicament. Amb aquest mètode aconseguim fer un procediment sense fer centrifugacions i sense grans complicacions.
Síntesi d’oligonucleòtids Tots aquests mètodes estan basats en el fet d’anar de pressa. En aquest cas farem créixer la cadena de DNA unida a SI (diòxid de silici), és a dir, a boletes de vidre. Sempre que nosaltres filtrem si el nostre oligo està creixent en la bola no podrà passar pel filtre i això ens permetrà fer una gran quantitat de rentats sense témer la seva pèrdua, és a dir, podrem automatitzar el procés.
Van haver de dissenyar oligonucleòtids modificats que fossin molt reactius. Els millors reactius que van trobar són els que tenen el fosfat modificat i aquesta modificació s’anomena fosfaramidita i d’una manera esquemàtica es parla de la síntesi d’oligos a través de fosforamidites.
S’ha de fer que reaccioni el que nosaltres volem que reaccioni sense que vagi a parar la reacció al lloc equivocat. Això vol dir que com que l’hidroxil de la ribosa pot reaccionar, l’hem de blocar amb un reactiu químic que puguem treure quan vulguem. A més, les amines també han d’estar blocades i tenir l’oportunitat de desbloquejar-les quan ens convingui. Els grups de bloqueig són els que observem a la imatge. Cal tenir present que canviar el bloqueig dels grups cal canviar les condicions de treball.
34 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T6 A la imatge veiem unit a la boleta el primer nucleòtid en 3’. Si volem posar el segon nucleòtid ha d’interaccionar en el 5’ de manera que el que es fa és eliminar l’agent de bloqueig canviant les condicions i a continuació, es fa la reacció amb la fosforamidita que conté la base que nosaltres volem que sigui la número 2. Cal saber que la base que està unida a la fosforamidita té un fosfat especial ja que està metilat i aquest fosfat anòmal l’haurem de treure.
Si repetim els estadis 1, 2 i 3 tindrem un altre nucleòtid enganxat. Això ho podem repetir fins arribar al punt que nosaltres vulguem amb la longitud desitjada. Quan haguem acabat s’ha d’eliminar tot, és a dir, el metil extra de la fosforamidita i els agents bloquejants de les amines de les bases. Al final també s’ha de desenganxar l’oligo de bola i d’aquesta manera aconseguirem moltes còpies de l’oligonucleòtid d’interès.
Cal tenir present que s’han d’elaborar diversos rentats durant el procediment ja que a cada passa sobren reactius; això és fàcil de fer ja que recordem que estan units a una fase sòlida.
En el ben entès aquesta síntesi química és una síntesi quasi perfecta, ja que a cada passa el rendiment que es té toca el 100%. Els químics normalment el que feien era produir oligos amb rendiments més baixos i després purificaven el producte però d’aquesta manera no era tan factible. Per tal d’entendre-ho millor posarem un exemple: imaginem que volem fer un oligo de 11 bases i suposem que cada passa té un 90% de rendiment; al final trobem que l’oligonucleòtid d’interès només es troba en el producte final en un 30%. En canvi, si tens un rendiment d’aproximadament el 100% pots permetre fer oligos molt més llargs, d’unes 100 b, amb un rendiment en el producte final molt gran.
Així doncs aquest mètode és molt bo químicament gràcies als treballs que els químics orgànics van realitzar per desenvolupar-ho.
35 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T6 QUÍMICA COMBINATÒRIA La química combinatòria pretén fer síntesi de molècules i que totes elles siguin semblants entre sí però amb alguna diferència. Això és molt útil per exemple, per buscar fàrmacs. Quan es volen provar molècules amb una grandària semblant però grups reactius diferents, es pot fer una síntesi combinatòria i aleshores determines quina és la que et convé.
Oligonucleòtids de seqüència aleatòria La química combinatòria és molt útil i en el cas que ens ocupa es pot fer servir per sintetitzar oligonucleòtids de seqüència aleatòria. Amb això podem trobar oligos que s’uneixen a coses molt rares que no tenen perquè unir-se de natural. Un exemple és el cas de l’ATP on un oligo s’unia específicament a ell.
Els aptàmers s’uneixen amb una gran especificitat i competeixen com si fossin anticossos i és per aquest motiu que els aptàmers poden substituir-los fent que aquesta eina sigui molt potent BIOLOGIA SINTÈTICA En els últims anys està apareixent un nou terme, una nova aproximació que s’anomena biologia sintètica. Aquesta es pot entendre de diferents maneres i cal que es posin d’acord per tal de trobar una accepció que englobi tot.
Fa poc va sortir publicat que havien aconseguit fer un cromosoma artificial de llevat, de 0,3 Mb, on van sintetitzar tota la seqüència a trossos i després la van u unir mitjançant sintetitzadors i això va esdevenir en el cromosoma 3. Els trossos de la seqüència original del cromosoma 3 que eren aparentment inútils van ser eliminats i van obtenir un llevat que funcionava molt bé.
Un temps abans, al 2008, en els laboratoris de Venter es va obtenir tot el genoma de Mycoplasma que té aproximadament 0,6 Mb. Aquí la cosa és més complicada ja que els organismes complexes tenen modificacions químiques com la metilació de bases. Van haver de passar el DNA per organismes equivalents que introduïssin modificacions epigenètiques equivalents.
Des d’un punt de vista estrictament químic, això és síntesi i moltes vegades les seves aplicacions són industrials. Des del punt de vista de la biologia sintètica química, la gent que hi treballa s’ha posat a estudiar el DNA amb ulls de químic i és per aquest motiu que s’han començat a qüestionar moltes coses com ara:  Perquè el DNA ha de tenir riboses en comptes d’un altre sucre.
 Si el DNA pot tenir bases nitrogenades diferents. No només modifiquen la ribosa sinó que també posen bases nitrogenades diferents a les típiques. Això és complicat ja que l’objectiu seria tenir l’organisme amb bases diferents en el DNA de manera que visquessin al costat nostre però d’una manera controlada, sense perill que es traspassin d’uns a altres. Els organismes que tinguin aquestes bases estranyes han d’aconseguir una replicació, transcripció i síntesi de proteïnes, la qual cosa és molt difícil.
36 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T6 Una altra cosa útil i conceptualment important és que de tant agafar el DNA com una estructura química de la qual s’han intentat modificar químicament coses, s’arriba a una idea abstracte i genèrica del que és el DNA: dues cadenes amb bases diferents que tenen una línia de nucleòtids (una al costat de l’altra) i que són complementàries.
En les proteïnes, si canvies la seqüència, l’estructura que obtens és molt diferent. En canvi, en el DNA tens un gen amb una determinada seqüència i si canvies la seqüència tindràs un altre gen però l’estructura bàsica de dues cadenes complementàries és la mateixa. Així doncs, en el DNA el substrat material no canvia sigui quin sigui el missatge.
Als anys 40, quan es deia que el DNA tenia la informació genètica no es creia ja que en principi, les proteïnes amb 20 aminoàcids tenien molta més variabilitat. Això avui dia sabem que no té lògica ja que imaginem que nosaltres enviem un missatge i depenent de com posem el paper canvia la forma del substrat material que conté el missatge. Això faria que el missatge no fos clar ja que varia segons les condicions.
37 ...