Tema 7 (2016)

Apunte Español
Universidad Universidad de Valencia (UV)
Grado Biotecnología - 2º curso
Asignatura Genética
Profesor S.H.S.
Año del apunte 2016
Páginas 13
Fecha de subida 10/11/2017
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1º Cuatrimestre

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Noelia Joya, 2º Biotecnología Genética TEMA 7 1.
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6.
El genoma bacteriano Técnicas de estudio de bacterias Transferencia genética en bacterias Los genomas víricos Transducción Recombinación genética de virus 6 31 .
14 Las bacterias son organismos procariontes (¹eucariontes) y se dividen en dos grandes grupos: eubacterias y arqueobacterias.
La diferencia genética fundamental entre los procariontes y los eucariontes es que, en los primeros, el material genético está poco asociado a proteínas y no está separado del resto de la célula por una membrana nuclear.
La inmensa mayoría de las bacterias poseen un único cromosoma circular que contiene una sola molécula de DNA. Además del cromosoma, la mayoría de las bacterias poseen plásmidos, que son pequeñas moléculas circulares de DNA.
Los plásmidos pueden estar presentes en un alto número de copias o en bajo número (una o dos). Cuando de un plásmido puedes encontrar miles de copias en una bacteria, hablamos de un plásmido de múltiple copia.
Suelen llevar genes no esenciales para la bacteria, pero que le confieren algunas ventajas sobre las que no los llevan. Los plásmidos son ampliamente utilizados en ingeniería genética para el aislamiento y transferencia de genes.
Ejemplos de genes llevados por plásmidos: • Resistencia a antibióticos • Productores de antibióticos • Productores de proteínas insecticidas • Estimulación del apareamiento • Control de su propia replicación • Integración en el cromosoma Los episomas son plásmidos capaces de integrarse en el cromosoma bacteriano. El factor F (de fertilidad) es un tipo de episoma.
El ciclo de vida de las bacterias puede ser asexual (el más común) o sexual (cuando implica intercambio de material genético entre individuos): Por lo general se reproduce por fisión binaria simple, en la cual el cromosoma único de una bacteria se multiplica y migra a los extremos opuestos de la célula, seguido por la división celular, lo que da lugar a dos células hijas idénticas. El apareamiento entre las bacterias, denominado conjugación, es controlado por genes de fertilidad localizados en el plásmido F. En la conjugación una bacteria dona material genético a otra bacteria, seguido por recombinación genética que integra alelos nuevos en el cromosoma bacteriano. El material genético también puede intercambiarse entre cepas de E. coli a través de la transformación y la transducción Tema 7: Sistemas genéticos bacterianos y virales 49 Noelia Joya, 2º Biotecnología 4 11 Genética 4 1.
14 Las bacterias del tipo salvaje (protótrofas) pueden crecer en un medio mínimo que contiene una fuente de C, N, P, y algunas vitaminas y sales inorgánicas. Se denomina medio mínimo al que contiene solo los nutrientes requeridos por las bacterias protótrofas.
Pueden crecer en un medio líquido o en un medio sólido con agar. Este último permite individualizar colonias y observar fenotipos distintos.
Los fenotipos que se pueden observar son los morfológicos (color y forma de la colonia) y los bioquímicos.
Los cultivos bacterianos suelen crecer en tubos de ensayo, que contienen un medio líquido estéril. Al tubo se le agregan unas pocas bacterias, que crecen y se dividen hasta que se agotan los nutrientes o -con más frecuencia- hasta que la concentración de sus productos de desecho se torna tóxica.
Las bacterias también se cultivan en placas de Petri. El medio de crecimiento suspendido en el agar se vierte hasta en la mitad inferior de la placa de Petri, lo que proporciona una base sólida, similar a un gel, para el crecimiento de la bacteria. En un proceso denominado “plaqueo” se esparce una solución diluida de bacterias sobre la superficie de una placa de Petri con agar: cogemos una bacteria, la inoculamos y la introducimos en la placa de petri. A medida que las bacterias crecen y se dividen se va formando un grupo de bacterias genéticamente idénticas (una colonia). Las cepas genéticamente puras de la bacteria pueden aislarse mediante la recolección de bacterias provenientes de una colonia individual y transfiriéndolas a un tubo de ensayo o a una placa de Petri nuevos.
Los fenotipos bioquímicos son aquellos que su crecimiento requiere que se suplemente, al medio mínimo, algún metabolito en particular. A este tipo de bacterias se les llama mutantes auxótrofos.
Las cepas mulantes auxótrofas carecen de una o más de las enzimas necesarias para metabolizar los nutrientes o sintetizar las moléculas esenciales y solo crecen en un medio suplementado con uno o más nutrientes. Por ejemplo, las cepas auxótrofas que son incapaces de sintetizar el aminoácido leucina no crecen en un medio mínimo, pero sí lo hacen en un medio al que se le ha agregado leucina. Un medio completo es el que contiene todas las sustancias requeridas por las bacterias para crecer y reproducirse.
Para aislar mutantes auxótrofos se utiliza la técnica de la réplica en placa: Una superficie estéril de terciopelo sirve como cuño. Cojo mi placa petri con colonias y pongo en contacto el terciopelo con la superficie. Este terciopelo arrastrará una serie de bacterias, que puedo “copiar” en nuevas placas de petri.
En este ejemplo se quieren detectar auxótrofos incapaces de sintetizar leucina (mutantes leu-). Primero se siembran las bacterias en una placa de Petri que contiene un medio con leucina; sobre éste crecerán tanto los protótrofos que poseen el alelo leu+ como los auxótrofos que poseen los aleles leu-. A continuación, mediante la técnica de siembra en placa de réplica, se transfieren unas pocas células de cada una de las colonias de la placa original a dos nuevas placas de réplica; una que contiene un medio al cual se le agregó leucina y la otra, con un medio selectivo; es decir, un medio que carece de leucina. Las bacterias leu+ crecerán en ambos medios, pero las mutantes leu- solo se desarrollarán en el medio suplementado por leucina, ya que no pueden sintetizar su propia leucina. Toda colonia que se desarrolle en el medio que contiene leucina, pero no en el medio que carece de ella, estará formada por bacterias leu-. Los auxótrofos que crecen en un medio suplementado pueden entonces cultivarse para estudios adicionales.
50 Tema 7: Sistemas genéticos bacterianos y virales Noelia Joya, 2º Biotecnología 21 1 4 31 Genética 4 1 .
14 Las bacterias intercambian material genético mediante tres mecanismos distintos: conjugación, transformación y transducción.
Estos fenómenos se dan con frecuencias muy distintas en las distintas especies bacterianas. De hecho, para ser utilizados para mapear genes bacterianos, unos mecanismos son apropiados para unas especies y otros para otras.
En todos los casos se requiere que se produzca entrecruzamiento entre el DNA foráneo y el de la célula receptora. Si la información entra en la célula pero no se introduce en el genoma de la bacteria, no se considera conjugación, transformación ni transducción, ya que no se transmitirá.
• La conjugación tiene lugar cuando el material genético pasa en forma directa de una bacteria a otra.
En la conjugación dos bacterias se encuentran próximas y se forma una conexión entre ellas (mediante un pilum formado por la donadora). Un plásmido o una parte del cromosoma bacteriano pasa de una célula (donante) a otra célula (receptora) y se integra de manera estable. En la conjugación el DNA se transfiere solo de la célula donante a la receptora, sin intercambio recíproco de material genético.
• La transformación tiene lugar cuando una bacteria capta el DNA desde el medio en el cual desarrolla la bacteria. Después de la transformación es posible la recombinación entre los genes introducidos y los del cromosoma bacteriano.
Tema 7: Sistemas genéticos bacterianos y virales 51 Noelia Joya, 2º Biotecnología Genética • La transducción tiene lugar cuando virus bacterianos (bacteriófagos) transportan el DNA de una bacteria a la otra. Al ser liberados en el interior de la bacteria receptora, se integran en el cromosoma mediante entrecruzamiento.
5 3 4 El fenómeno de la conjugación fue descubierto en 1946 por Lederberg y Tatum estudiando Escherichia coli.
Ambos recibieron el premio Nobel en 1958.
¿Cuál era el mecanismo de la conjugación? Experimentos posteriores demostraron que la conjugación requería el contacto físico entre bacterias (descartaron otros tipos de transferencia).
La conjugación depende de la presencia del plásmido F y sólo se produce entre células F+ y células F-. El plásmido F promueve la formación de pili sexuales.
Bacterias F+: F está presente bacterias donantes.
Bacterias F-: F está ausente bacterias receptoras.
Después de la conjugación entre células F+ y células F-, si el factor F se transfiere completo, las F- se transforman en F+.
La transferencia del DNA es a partir de un fragmento de ADN, una cadena monocatenaria, que se introduce y se va replicando (a la vez que el del donador). En la mayoría de los casos los únicos genes que se transfieren entre las bacterias F+ y F- durante la conjugación son los que se encuentran en el factor F.
52 Tema 7: Sistemas genéticos bacterianos y virales Noelia Joya, 2º Biotecnología Genética Pero lo que observaron Ledenberg y Tatum fue la transmisión de genes cromosómicos, no los del factor F. Las células F+ pueden convertirse en Hfr (high frequency of recombination) si el factor F se integra en el cromosoma: La célula seguirá comportándose como si fuera F+, con la diferencia de que la conjugación promovida por el factor F transferirá genes cromosómicos.
Al final del proceso, la célula receptora sigue siendo F-. Sólo en rarísimas ocasiones se convierte en Hfr.
En la conjugación entre células Hfr y F-, el factor F integrado se rompe y el extremo de la cadena rota se mueve hacia la bacteria F-, como lo hace en la conjugación entre las células F+ y F-. En las células Hfr, el factor F se une al cromosoma bacteriano, de modo que el cromosoma lo sigue hasta la célula receptora.
La cantidad de cromosoma bacteriano que se transfiere depende del tiempo en el que ambas células permanecen en la conjugación.
Una vez dentro de la célula receptora, la cadena del DNA donante se replica y puede producirse un entrecruzamiento entre la cadena y el cromosoma original de la célula F-. Una vez producido el entrecruzamiento en la célula receptora, el cromosoma donado se degrada y el cromosoma receptor recombinante permanece para replicarse y pasar a las generaciones siguientes por fisión binaria.
En el apareamiento de Hfr x F- la célula F- casi nunca se convierte en F+ o Hfr porque el factor F se rompe en la mitad durante el comienzo de la transferencia de la cadena, dejando una parte de F al comienzo y otra parte al final de la cadena que va a transferirse. Para convertirse en F+ o Hfr la célula receptora debe recibir un factor F completo, que supone la transferencia completa del cromosoma bacteriano. Esto sucede rara vez, porque la mayoría de las bacterias que se conjugan se separan antes de que la transferencia del cromosoma se haya completado.
Por último, el factor F integrado en el cromosoma en una célula Hfr puede escindirse, con lo que la bacteria revierte a F+.
En el caso de que la escisión provoque que el plásmido F transporte genes del cromosoma bacteriano, la célula resultante se denomina F’.
La célula F’ seguirá comportándose como si fuera F+, con la diferencia de que la conjugación promovida por el factor F transferirá genes cromosómicos.
Tema 7: Sistemas genéticos bacterianos y virales 53 Noelia Joya, 2º Biotecnología Genética A este proceso de transferencia de genes cromosómicos por parte del factor F se le ha denominado sexducción, por homología con la transducción (en el que los genes bacterianos son transportados por un virus).
La conjugación se realiza desde una célula F’ y una F-.
La célula receptora se convierte en F’ y será un diploide parcial (o merocigoto), porque llevará dos copias de algunos genes, una en el cromosoma y la otra en el plásmido F.
Hay especies en las que se da la conjugación con facilidad y otras en las que no.
Tipo F+ FHrf F’ Características del Factor F Presente como ADN circular separado Ausente Presente, integrado en el cromosoma bacterial Presente como ADN circular separado, transportando algunos genes bacteriales Papel en la conjugación Conjugación Tipos de células después de la conjugación Donante F+ x F- Receptor Donador de alta frecuencia Dos células F+ (La célula Fse convierte en F+) Hrf x FF’ x F- Una célula Hrf y otra F- (sin cambios)* Dos células F’ (La célula F- se convierte en F’) *Raramente, las células F- se convierten en F+ si el cromosoma entero se transfiere durante la conjugación.
Donador Importancia práctica de la conjugación bacteriana: a. Mapeo de genes bacterianos mediante la conjugación interrumpida b. Comprensión del fenómeno de la resistencia a antibióticos c. Obtención de bacterias no recombinantes para usos biotecnológicos .
La transferencia de DNA que tiene lugar entre células Hfr y F- durante la conjugación permite trazar el mapa de los genes bacterianos. Durante la conjugación el cromosoma de la célula Hfr se transfiere a la célula F-. Si la conjugación se interrumpe antes de que se haya dado la transferencia completa del cromosoma del E. coli, solo una parte del cromosoma habrá pasado hacia la célula F- y tendrá la oportunidad de recombinarse con el cromosoma receptor. La transferencia del cromosoma siempre comienza dentro del factor F integrado y prosigue en una dirección continua; así, los genes se transfieren de acuerdo con su secuencia en el cromosoma. El tiempo requerido para que un gen sea transferido indica su posición relativa en el cromosoma. En la mayor parte de los mapas genéticos las distancias se expresan como porcentaje de recombinación, pero en los mapas bacterianos construidos con conjugación interrumpida la unidad básica de distancia es el minuto.
54 Tema 7: Sistemas genéticos bacterianos y virales Noelia Joya, 2º Biotecnología Genética El uso de diferentes cepas Hfr permitió mapear genes distribuidos por todo el cromosoma y aportar la primera prueba de que el cromosoma bacteriano era circular.
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La resistencia a antibióticos es un problema muy grave de salud pública, en explotaciones ganaderas y en piscifactorías. Los genes de resistencia son portados en plásmidos (plásmidos R) conjugables.
El problema surge al hacer un uso excesivo de antibióticos, lo cual selecciona las cepas resistentes. Esto, unido a la transferencia de los plásmidos R entre bacterias, hace que prolifere la resistencia.
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Para evitar las trabas legislativas sobre la liberación de OMG, se puede hacer uso de la conjugación (un fenómeno natural) para obtener bacterias que combinen plásmidos con características deseadas provenientes de distintas cepas (p.e., combinar distintas proteínas insecticidas de Bacillus thuringiensis en una misma cepa).
Bacillus thuringiensis Ø Las proteínas insecticidas (Cry1Aa, Cry1Ab, etc.) tienen diferentes espectros de acción.
Ø Las distintas cepas contienen distintos plásmidos.
Ø Los genes cry han sido transferidos a plantas, confiriéndoles resistencia a insectos (“cultivos Bt”).
Ejemplos: B. thuringiensis var. kurstaki HD-1 (cry1Aa, cry1Ab, cry1Ac, cry2Aa, y cry2Ab) B. thuringiensis var. israelensis (cry4Aa, cry4Ba, cry10Aa, cry11Aa, cyt1Aa, y cyt2Ba) Tema 7: Sistemas genéticos bacterianos y virales 55 Noelia Joya, 2º Biotecnología 21 1 4 31 Genética 4 1 .
14 2 4 El fenómeno de la transformación fue observado por primera vez en 1928 por Griffith, buscando la naturaleza del material hereditario, y en 1944 sirvió para establecer que éste era el DNA.
Para que se dé la transformación se requiere que las células que van a tomar el DNA del medio estén competentes (receptivas). Las células competentes poseen una proteína de superficie llamada “factor de competencia”, encargada de unir e introducir el DNA. La energía para este proceso lo provee la degradación de una de las cadenas del DNA.
La competencia se ve influida por el estadio de crecimiento en el que se encuentra la bacteria, por la composición del medio, y por el tamaño y concentración del DNA libre. Nota: El DNA captado no tiene porqué ser bacteriano; puede ser de cualquier especie.
Importancia práctica de la transformación: a. Mapeo de genes bacterianos b. Comprensión del fenómeno de la transferencia horizontal c. Obtención de bacterias recombinantes en el laboratorio El mapeo se basa en las frecuencias de cotransformación. Es decir, si dos loci se encuentran relativamente cerca entrarán (y se integrarán) juntos con mayor frecuencia que dos que se encuentren más alejados.
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A diferencia de la conjugación (y transducción), la transformación no posee barreras en cuanto al origen del DNA transformante. Éste puede provenir de especies distintas, géneros distintos, e incluso eucariontes.
La transferencia de material genético entre individuos que coexisten en el tiempo se denomina transferencia horizontal, en contraposición a la transferencia de padres a hijos llamada transferencia vertical.
56 Tema 7: Sistemas genéticos bacterianos y virales Noelia Joya, 2º Biotecnología Genética ..
La transferencia de genes (de cualquier origen) a bacterias mediante transformación (con plásmidos recombinantes) es el método estándar para estudiar los genes a nivel molecular.
Además, es el método más sencillo para obtener bacterias que incorporen genes de interés biotecnológico.
31 C4 Los virus son estructuras replicantes sencillas constituidas por un ácido nucleico rodeado por una cubierta de proteínas.
Son parásitos intracelulares ultramicroscópicos (entre 20 y 250nm) que evolucionaron a partir de sus huéspedes. El ácido nucleico puede ser DNA o RNA, y de cadena sencilla o doble.
Los virus se dividen en virus animales, vegetales y bacteriófagos (o simplemente fagos), dependiendo del tipo de huésped que infecten.
4 4: 61 2 464 1 4 El genoma de los virus puede estar incluso fragmentado (varias moléculas de ácido nucleico).
Algunos virus tienen su cápside recubierta por una membrana que adquieren de la célula huésped.
La mayoría de los virus vegetales son de RNA.
Tema 7: Sistemas genéticos bacterianos y virales 57 Noelia Joya, 2º Biotecnología 4 6 6C 4 4 6 64 Genética 3 4 Los bacteriófagos pueden tener dos tipos de ciclos para su replicación: el ciclo lítico y el lisogénico.
En el ciclo lítico un fago se adhiere a un receptor en la pared celular de la bacteria e inyecta su DNA a la bacteria. Una vez dentro de la bacteria el DNA del fago se replica, se transcribe y se traduce y produce más DNA y proteínas del fago. Las nuevas partículas del fago se ensamblan a partir de estos componentes.
Los fagos producen entonces una enzima que rompe y abre la célula y libera los nuevos fagos. Los fagos virulentos se reproducen estrictamente a través del ciclo lítico y siempre destruyen sus células huéspedes.
Los fagos atemperados pueden utilizar tanto el ciclo lítico como el ciclo lisogénico. El ciclo lisogénico comienza del mismo modo que el ciclo lítico pero, una vez dentro de la célula, el DNA del fago se integra al cromosoma bacteriano donde permanece como un profago inactivo. El profago se replica junto con el DNA bacteriano y pasa a la generación siguiente cuando la bacteria se divide. Ciertos estímulos determinan que el profago se disocie del cromosoma bacteriano y entre en el ciclo lítico, donde produce nuevas partículas de fagos y ocasiona la lisis de la célula.
4 La transducción es el fenómeno por el cual las bacterias intercambian información genética por medio de fagos. Fue descubierto por Lederberg y Zinder en 1952.
Hay dos tipos de transducción, con resultados y mecanismos totalmente distintos: • Transducción generalizada: cualquier gen puede ser transferido • Transducción especializada: sólo algunos genes son transferidos 4 31 1 64 Se produce en algunos fagos durante el ciclo lítico y cualquier gen puede ser tranferido.
Transferencia unidireccional: hay algo en el cultivo de la izquierda que es capaz de transferir los genes a las bacterias de la derecha.
58 Tema 7: Sistemas genéticos bacterianos y virales Noelia Joya, 2º Biotecnología Genética Requerimientos para que se produzca el fenómeno: a. Se degrade el cromosoma bacteriano en fragmentos de tamaño apropiado para caber en la partícula fágica.
b. El proceso de empaquetamiento de DNA en la cubierta del fago no sea específico para secuencias del DNA del fago.
c. El DNA transferido se integre en el cromosoma bacteriano de la célula receptora Se ha utilizado para mapear genes bacterianos utilizando como medida la frecuencia de cotransducción.
4 1 :1 4 64 Como la transducción generalizada, la transducción especializada requiere la transferencia de genes de una bacteria a otra por medio de fagos, pero aquí solo se transfieren los genes cercanos a determinados sitios del cromosoma bacteriano. Este fenómeno sólo se da en fagos temperados, ya que se requiere del ciclo lisogénico. Los profagos pueden escindirse del cromosoma bacteriano de manera imperfecta y transportar con ellos una porción pequeña del DNA bacteriano adyacente al sitio de la integración del profago. El fago que transporta este DNA lo inyectará luego en otra célula bacteriana en el ciclo siguiente de infección. Este proceso se parece a lo que sucede en las células F’, en las que el plásmido F transporta genes de una bacteria a otra.
Tema 7: Sistemas genéticos bacterianos y virales 59 Noelia Joya, 2º Biotecnología 1 .4 4 Genética 31 4 1 4 Los fenotipos más fáciles de observar en los fagos son aquellos que afectan el tipo de lisis (rápida o lenta) o el rango de hospedadores (el tipo de cepas bacterianas que pueden infectar). Por ejemplo, el fago T2 de genotipo h+ infecta células del tipo B de E. coli pero no las del tipo B/2, mientras que el de genotipo h- infecta tanto las del tipo B como las del tipo B/2.
La observación del crecimiento (y fenotipo) de los virus requiere su crecimiento sobre un “césped” de bacterias (de ambas cepas) en una paca Petri: Los virus de crecimiento rápido (r -) producirán “calvas” más grandes que los de crecimiento lento (r+).
Si el césped está formado por una mezcla de bacterias B y B/2, los virus h+ producirán calvas turbias mientras que los virus h- producirán calvas transparentes.
Este fenómeno (descubierto en 1947) se puede observar cuando dos partículas fágicas de distinto genotipo infectan una misma célula.
Se ha aplicado al mapeo genético de los virus.
En las décadas de 1950 y 1960 Seymour Benzer desarrolló una serie de experimentos destinados a examinar la estructura de un gen. Como en ese momento no se disponía de técnicas moleculares para examinar directamente las secuencias de los nucleótidos, este investigador se vio obligado a inferir la estructura génica a partir del análisis de las mutaciones y de sus efectos. Los resultados de estos estudios mostraron que se podía trazar el mapa de diferentes sitios mutacionales dentro de un único gen (mapeo intragénico) utilizando técnicas similares a las recién descritas. Los diferentes sitios dentro de un mismo gen están muy próximos entre sí; por eso la recombinación entre ellos se produce a una frecuencia muy baja. Dado que se requiere una progenie muy numerosa para detectar estos episodios de recombinación, Benzer utilizó el bacteriófago T4, que se reproduce con rapidez y produce una progenie numerosa.
60 Tema 7: Sistemas genéticos bacterianos y virales Noelia Joya, 2º Biotecnología Genética Los fagos T4 silvestres suelen producir placas pequeñas, normalmente con bordes rugosos cuando se los cultiva sobre un fondo (“césped”) de la bacteria E. coli. Ciertos mutantes, llamados r porque experimentan lisis rápidamente, producen grandes placas de bordes mal definidos. Benzer aisló fagos con diferentes números de mutaciones r y se concentró en un determinado subgrupo denominado mutantes rII.
Los fagos T4 silvestres producen placas características en las cepas B y K de E. coli. A la inversa, los mutantes rII producen placas r en la cepa B y no forman ninguna placa en la cepa K. Benzer reconoció los mutantes r por sus placas distintivas cuando crecieron en E. coli B. Después recolectó lisados de estas placas y los utilizó para infectar la cepa E. coli K. Los fagos que no produjeron placas sobre la cepa K de E.
coli se definieron como fagos de tipo rII.
Silvestres placas en B y K mutantes r crecen en E. Coli B infectamos placa K rII placas en B 1.
1 :61 1 crece Silvestre no crece rII 4 Prueba de complementación: coinfección de la cepa K de E. coli con dos mutantes rII.
Algunas de las mutaciones que él se pensaba que eran del mismo gen, resultaron ser de genes estrechamente ligados 1.
1 1 .4 4 Recombinación intragénica: coinfección de la cepa B de E.
coli con dos mutantes del mismo gen rII y crecimiento en la cepa K.
Gracias a la potencia del método pudo mapear hasta 2400 mutaciones dentro del gen rII. Demostró por primera vez la recombinación intragénica Hasta ese momento se creía que el gen era la unidad de función, mutación y recombinación (el gen como “una perla en un collar de perlas”). Después de sus trabajos sólo quedó en pie el que el gen es la unidad de función.
Benzer proporcionó la primera información sobre la estructura molecular de un gen: una secuencia de subunidades que pueden mutar y recombinar (hoy sabemos que corresponden a cada par de bases del DNA).
Tema 7: Sistemas genéticos bacterianos y virales 61 ...

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