Tema 6 CRECIMIENTO BACTERIANO (2017)

Apunte Español
Universidad Universidad Rovira y Virgili (URV)
Grado Biotecnología - 2º curso
Asignatura Microbiología
Profesor C.
Año del apunte 2017
Páginas 10
Fecha de subida 13/11/2017
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Gabriel Gestido Hervés GRADO EN BIOTECNOLOGÍA URV TEMA 6 CRECIMIENTO MICROBIANO El crecimiento microbiano no se puede considerar un incremento de los compuestos de reserva de los microorganismos. La molécula de reserva de las bacterias es el polibetahidroxibuterato.
Cuando hablamos de crecimiento en organismos superiores nos referimos al crecimiento en cuanto al indivíduo, joven, adulto, viejo… En el caso de las bacterias hablaremos a nivel de conjunto de microorganismos, de la población de microorganismos. Lo definimos como:  Incremento ordenado de todos los constituyentes químicos celulares.
 Incremento del número de células, no de su tamaño.
 Una célula viable (ufc) es capaz de generar una colonia (población de millones de células). Ufc: unidad formadora de colonias. En los virus microbianos encontramos las Ufp (unidades formadoras de placas).
Ej práctico: en una muestra de alimento tenemos que determinar el nº de virus que hay. Se hace una siembra en superficie que abarque toda la superficie de la placa, en ``forma de césped´´, las colonias crecen tan juntas que no se diferencian.
Tienes una placa de medio de cultivo, que puede ser E. Coli y quieres determinar cuántos bacteriófagos de E. Coli hay: siembras la suspensión de bacterias y lo empiezas a frotar por la superficie de la placa. Una vez tienes eso, ¿cómo evalúas la presencia de bacteriófagos? Extendemos el agua por toda la superficie, donde caiga el bacteriófago infectará a E. Coli, comenzando un ciclo lítico y al cabo de un tiempo se lisará, infectando otras E. Coli. Donde había un bacteriófago habrá muchos más, quedarán `placas´o `calvas´. Habrá una concentración de 50 ufm/ml sembrando 0,1 ml (Si te salen 5 calvas en 1 ml hay 10 veces más).
Los bacteriófagos son especie-específicos pero dentro puede haber más de un tipo de bacteriófago, aun así todos tienen en común que tienen como huésped E. Coli.
Importante a nivel de biorreactores, industria farmacéutica y alimentos, o para controlar infecciones. ¿Cuáles son los factores que pueden afectar a la curva de crecimiento? Veremos todo esto, o como determinar el crecimiento más adecuado al nivel del tipo de microbiología con la que estamos trabajando. Por ejemplo, en vinos blancos interesa un crecimiento acelerado pero no demasiado rápido porque quieren que se mantenga el aroma, ya que son muy volátiles y si no este se iría.
Los factores que regulan el crecimiento son muy variados, como los nutrientes, las condiciones ambientales, temperatura, pH, actividad de agua o el potencial REDOX al que está sometido.
También afecta el tiempo de generación.
- Tiempo de generación: tiempo necesario para que una célula en condiciones estándar/óptimas se divida y que en consecuencia la población se doble. El rango para las bacterias es de 1-3h. Viene condicionado por el hecho de que los microorganismos se dividen por división binaria o fisión, el microorganismo va creciendo y cuando llega a 1 Gabriel Gestido Hervés GRADO EN BIOTECNOLOGÍA URV una masa crítica, se divide en dos células hijas, también llamado bipartición. Tiene un valor determinado para cada especie microbiana (es óptimo a diferentes valores dependiendo de la especie).
T de generación de E.coli = 20 min (20 generaciones en 7 horas, 1 célula genera 1 millón de células) Existen otros métodos de división alternativos: la gemación (mayoritariamente levaduras), conidiosporas (hongos y bacterias filamentosas) o fragmentación (bacterias y hongos).
- La gemación puede ser • Multipolar: se da en cualquier lugar de la célula madre.
• Unipolar: se da solo en una parte de la célula madre.
• Bipolar: se da en dos partes de la célula madre. En el punto donde se produce se crea una cicatriz de gemación, y en esta posición no vuelve a haber una gemación. Las levaduras la realizan (hongos unicelulares), o también los mohos u hongos filamentosos, que pueden producir esporas asexuales, ponidios o esporas sexuales.
EL tiempo de generación es un parámetro propio de cada especie, el de las bacterias es más corto que el de las levaduras, pero este es más corto que el de los hongos miceliares.
EJ: Que bacteria tendrá un tiempo de generación más corto, ¿una con una T óptima de 37ºC o una con una Tª óptima de 12ºC?. La de 37º, ya que las enzimas tienen temperaturas óptimas genéticas a partir de 28º.
CURVA DE CRECIMIENTO Nosotros no medimos al indivíduo, hablamos de poblaciones. Para medir el crecimiento microbiano lo expresamos mediante la curva de crecimiento. En esta podemos diferenciar cuatro fases:  FASE DE LATENCIA: Durante la fase de latencia, la población de microorganismos se adapta al medio, la maquinaria celular se está preparando para la fase exponencial. No hay crecimiento real, ni se incrementa el nº de microorganismos. Tiene una duración variable dependiendo del tamaño del cultivo inicial y del estado metabólico previo (células dañadas, fase de la curva del inóculo y la procedencia de la población inicial, ya que pueden provenir de un medio de cultivo completamente distinto al que se encuentra). No hay crecimiento real. La duración varía dependiendo del tamaño del inóculo y del estado metabólico previo (fase de la curva del inóculo, células dañadas y medio de cultivo de procedencia del inóculo)  FASE LOGARÍTIMICA, de crecimiento exponencial: el crecimiento sigue una exponencial positiva, se duplica el nº de indvíduos de la población, podremos determinar su tiempo de generación si las condiciones son óptimas para la especie, si no no se puede establecer. Esta fase será una fase adecuada para la producción de compuestos resultantes del metabolismo y de biomasa. Es muy sensible a drogas, productos tóxicos y radiaciones. Durante esta fase es cuándo podremos saber el nº de indvíduos siempre y cuando conozcamos unos determinados parámetros como: 2 Gabriel Gestido Hervés GRADO EN BIOTECNOLOGÍA URV (No= 1,5 x103 ufc/ml; t de g= 20’; t= 4h, N? N= No x 2t/tg ; G= 𝒕𝒕 𝒕𝒕𝒕𝒕 ; N= 1.5 x 103 x 212 = 3 x 1015.
Puede ser que una población de microorganismos se ponga a incubar pero que no todo sea periodo exponencial, o que esté en fase exponencial y se pare porque las condiciones del medio no son las adecuadas. Cuando vuelve a estar en condiciones adecuadas pasa previamente por un período de latencia.
 FASE ESTACIONARIA: se produce un agotamiento de nutrientes y una sobrepoblación bacteriana que produce un incremento en la cantidad de excreciones que emiten al exterior (metabolitos secundarios excretados). Hay bacterias que sobreviven, y pasan a sintetizar metabolitos secundarios antimicrobianos. Tasa de división = tasa de mortalidad. Es una fase deseable para la producción de compuestos resultantes del metabolismo secundario. Se puede observar turbidez en el medio.
 FASE DE MUERTE : se sigue una exponencial negativa pero con una pendiente más suave que la de la fase exponencial. La población es muy elevada y deja de haber nutrientes, la tasa de división es inferior a la tasa de mortalidad. También hay un incremento en la concentración de metabolitos secundarios.
MÉTODOS DE MEDIDA DEL CRECIMIENTO MICROBIANO: métodos que evalúan la biomasa o/y el número de indivíduos.
 BIOMASA: tenemos dos poblaciones en el mismo medio de cultivo. Las medidas de peso seco no sirven. Podríamos hacer una estimación de biomasa: Cuantas más bacterias haya en la población del erlenmeyer 1, más turbia será. Lo haremos mediante técnicas fotométricas, que miden la absorbancia de una suspensión. Cuanto más alta sea más grande será el nº de part que haya en la disolución. La turbulencia no sirve para determinar la peligrosidad de una población de microorganismos. Necesitamos métodos que pongan en evidencia la población de indivíduos vivos y muertos.
 Nº DE PARTÍCULAS: si tenemos dos poblaciones en dos erlenmeyers, haremos una preparación que miraremos al microscopio y veremos cuál es la más concentrada. Es un sistema que permite hacer una estimación de cual es más elevada, pero no es objetivo. Este método es el de las cámaras de recuento, que también se utilizan a 3 Gabriel Gestido Hervés GRADO EN BIOTECNOLOGÍA URV nivel de hematología. Se busca hacer una estimación de la [ ] de microorganismos, en un campo visual, una superficie.
¿Qué pasa si sobre la superficie colocamos un cubre? Que no está en contacto directo con la superficie del cubre, evaluando así partículas por unidad de volumen, al tratarse de un cubo. Tiene limitaciones: las células son cabronas, si tienes chinolandia tendrás tropecientasmil partículas (se soluciona diluyendo).
Las partículas han de ser de un tamaño suficientemente grande como para que puedan ser observadas, y por último, no sabemos si estamos observando bacterias vivas o muertas.
¿Cuál es el número de cuadrados que has de contabilizar? 5, en función del número de partículas que haya por cuadrado, y también que la distribución del número de partículas por la cámara de recuento sea homogénea. En el caso de las levaduras, tenemos la capacidad de poder discriminar entre los vivos y los muertos mediante tinción vital, que se utiliza con azul de metileno. Las levaduras que están vivas son capaces de expulsarlo al exterior, quedando teñidas de azul ténue, en cambio las muertas no son capaces de hacerlo quedando teñidas de azul intenso. Con las bacterias se utiliza naranja de acridina, aunque es muy cancerígeno y se necesita un microscopio de fluorescencia. Si el color es verde está vivo, si es roja está muerta.
 COULTER: cátodo y ánodo, se crea un campo eléctrico que tiene una conductividad determinada. Cada vez que pasa una partícula se produce una modificación de la conductividad del campo eléctrico, que se puede digitalizar mediante un contador. Si conoces el número de veces que el campo eléctrico se modifica sabrás el número de partículas que lo atraviesan, conociendo el número de partículas por unidad de volumen. No permite distinguir si los indivíduos están muertos o vivos, ya que campo eléctrico no se ve modificado por este factor. El polvo también supone un problema.
 RECUENTO DE VIABLES: se pone un volumen igual o inferior a 0,1 ml y lo depositamos en la placa. Pondremos en evidencia si una bacteria está viva o muerta según su capacidad de reproducirse, crear colonias. En fución del nº de colonias que aparezcan sabré el número de indvíduos viables que hay.
Si crecen 150 colonias, la cantidad de ufc viables es de 1,5x103 ufc/ml.
No= 1,2 x105 ufc/ml ; tg= 20’ ; tlat= 60’ ; t= 10h ; N=?. El volumen tiene q ser en uno menos de 0,1 ml y en el otro más.
Tmáx= 9h  27 generaciones N= 1,2 x 105 x 227= 1,61 x 1013 ufc/ml N= 1,6 x1013 ufc/ml.
4 Gabriel Gestido Hervés GRADO EN BIOTECNOLOGÍA URV Si ponemos 0,1 ml en 10 ml es los mismo que 1/100 de dilución. 1,61 x1011 ufc/ml.
Tenemos que hacer 4 diluciones más de 0,1 ml consecutivas va disminuyendo el exponente hasta 10-3, con la última de 1 ml nos quedamos con 9 ml de concentración 10-4 de la cual coges 0,1 ml y te quedas con 161 µL. La concentración se mantiene pero el volumen no.
¿Por qué es importante el crecimiento microbiano? Si vas a trabajar con fermentadores, biorreactores en un momento dado necesitarás obtener mucha biomasa o de un compuesto que ese organismo es capaz de sintetizar en el caso de los enólogos.
¿Qué es un fermentador/ biorreactor? Es un depósito donde crece una población de microorganismos en la cual puedes mantener una determinada fase dentro de la curva de crecimiento, por ejemplo la fase exponencial. Para esto tenemos que minimizar los factores que determinan que una determinada población pase de fase exponencial a estacionaria, como la eliminación de metabolitos secundarios (un buen sistema de drenaje) o la falta de nutrientes, y eliminar la sobrepoblación, sacando indivíduos del sistema.
Cultivo contínuo: aquel en el cual la población de microorganismos se mantiene en la fase que te interesa.
 QUIMIOSTATO: Tiene una población de microrganismos en un caldo. Tenemos una entrada de aire externo, esta población respecto a la respiración es aeróbica (aporte continuo de O2). Tiene dos llaves de paso, por una entran los nutrientes de forma continuada, y en la otra (rebosadero), a partir del momento en que la población es suficientemente elevada va eliminado restos, microorganismos… ¿Qué nos falta? Tenemos que procurar q el efecto de la gravedad sea lo más minimo posible, y que el sistema sea los más homogéneo posible para que no sedimente. La misma entrada de aire nos puede servir para provocar turbulencias. Tenemos que regular la velocidad de entrada que a su vez regulará el volumen de salida. En resumen regular la velocidad de flujo de los nutrientes que aportas, que dependerá del crecimiento de las bacterias (tiempo de generación, cuanto más corto, más nutrientes, ya que la renovación de la población será más rápida). El objetivo es la optimización máxima del sistema para saber cuál es la dinámica poblacional en función de los nutrientes aportados. Tenemos que conseguir la máxima población con nutrientes lo más barato posibles.
5 Gabriel Gestido Hervés GRADO EN BIOTECNOLOGÍA URV  TURBIDOSTATO: evaluamos cuál es la densidad óptica (DO) inicial del sistema y determinamos una DO x que dispare el sistema, que significa abrir la llave de paso de la derecha para que salga todo lo que haya de población y que entre nueva. El sistema se disparará cada vez que se llegue a la densidad óptica marcada.
Se diferencian en el sistema de control.
Ej: Tenemos una población de microorganismos en fase exponencial y estamos trabajando en el departamento de imagen de una empresa que se dedica a productos naturales a nivel de compuestos microbianos. Tenemos 4 o 5 conjuntos a testar.
El crecimiento exponencial se ve en la gráfica como una diagonal: En el final hay un punto, en el cual añades producto A (población E.coli), y resulta que sigue subiendo. Por lo tanto el producto A no hace nada. Tenemos también otra población de Sacharomyces cerevisiae. Uno es bacteria y la otra levadura. Cuando añadimos el A provoca en Sacc. Cerevisiae una línea recta, la hace entrar en fase estacionaria. Es inocuo respecto a las bacterias pero provoca fase estacionaria en hongos, es fungiestático.
Cuando probamos el producto B, se intercambian los papeles, la bacteria entra en fase estacionaria pero es inócuo para las levaduras (S cerevisiae), es bacteriestático.
Con el producto C, da fungiestático y mata a E. Coli, es un bactericida.
El producto D mata ambas, es fungicida y bactericida.
Si en vez de ufc hubieramos puesto Log de densidad óptica, las pendientes serían ligeramente más suaves con el producto C debido debido a que tendríamos que evaluar tanto las poblaciones que nacen como las que mueren y sumarles los cadáveres que continuan estando pero que no lisaron. Tendríamos dos planos.
Con un producto E ambas tienen la misma pendiente que en el D, está matando y haciendo desaparecer los cadáveres, los lisa, es bacteriolítico y fungilítico.
6 Gabriel Gestido Hervés GRADO EN BIOTECNOLOGÍA URV PÁRAMETROS QUE AFECTAN AL DESENVOLVIMIENTO DE LA POB DE MICROORGANISMOS Hay que procurar que el desenvolvimiento sea óptimo. Se hace un estudio del efecto de un determinado parámetro sobre una población, y la curva que suele seguir.
 FACTOR Tª: La pendiente es suave al comienzo y cuanto más aumentemos la Tª, más se incrementa la tasa de crecimiento hasta que llega a un máximo que es el óptimo para el factor: Esta es la Tª ÓPTIMA de crecimiento para dicho microorganismo. En un momento dado hay una bajada de la población microbiana, debido a la desnaturalización de proteínas, por ejemplo.
Normalmente estudiaremos los diferentes factores que hay para establecer los óptimos para cada especie microbiana.
Tendremos diferentes tipos de microorganismos: -SICRÓFILOS: Tª optimas situadas entre los 10 y 15ºC. Sus metabolismos son lentos.
Los tendremos en hábitats donde el ambiente es frío.
-MESÓFILOS: entre 25 y 37ºC. La mayoría de enterobacterias. Respecto a los mesófilos los hongos son sincrófilos y las bacterias mayoritariamente mesófilas.
-TERMÓFILOS: Microorganismos que se desenvuelven a Tª elevada. En los géishers por ejemplo. Sale agua caliente a 70-80 grados, alrededor se establece un gradiente de Tª.
Tendremos especies hiper/medio/ligeramente termófilas según la zona.
Thermus aquaticus: bacteria, a partir de la cual se obtuvo Taq-pol: enzima adaptada a elevadas Tª por lo que a nivel estructural su conf le permite no desnaturalizarse a la cual el ADN se desnaturaliza. Trabaja a 72ºC.
La pol humana trabaja a 37ºC, a 100º se desnaturaliza irreversiblemente.
 FACTOR ECOLÓGICO: • ESPECIE ESPECIALISTA: también denominada estenoica. En condiciones óptimas no tiene rival.
• ESPECIE GENERALISTA: también denominada euroica.
7 Gabriel Gestido Hervés GRADO EN BIOTECNOLOGÍA URV  FACTOR PH -pH ÓPTIMO ÁCIDO: los pH ácidos son óptimos para hongos, levaduras…. Excepción bacterias: las bacterias acéticas (Lactobacillus lacidophillus) y bacterias ácido-lácticas.
Estas son difíciles de cultivar en medios de cultivos artificiales, hay que clavar su pH.
-pH ÓPTIMO BÁSICO: los básicos son los óptimos para las bacterias, en general.
 FACTOR ACTVIDAD DE AGUA La actividad de agua es la cantidad de agua metabólicamente libre. Es aquella que está disponible para ser usada en el metabolismo o fisiológicamente por el microorganismo.
Esta contrapuesta por el agua ligada. Por ejemplo mediante adición de solutos, al reaccionar con estos se aumenta la cantidad de agua ligada (en un pantano hay más agua libre que en el mar).
Se puede ligar el agua congelándola, de esta forma no está disponible para el microorganismo.
Ha de haber algún sistema para tener alimentos disponibles cuando no los hay, desecando alimentos, ahumándolos porque tienen compuestos conservantes o salándolos, ya que de todas las formas baja la actividad del agua. Las mermeladas se conservan mediante bajadas de actividad de agua. La miel es un alimento muy estable porque el contenido de azúcares es muy elevado y por lo tanto es muy difícil de atacar. Los microorganismos más vulnerables a la actividad de agua (necesitan que el sustrato tenga una actividad de agua muy alta): BACTERIAS (Por orden de tolerancia a la actividad de agua del que más al que menos necesita): Bacilos gram(-), (Staphilococcus aureus se cultiva en Mn porque es un medio selectivo en el que hay una concentración elevada de NaCl, la actividad de agua baja de tal manera que pasa a ser de 0.97, que impide el crecimiento de bacilos gram(-), esta bacteria específicamente tiene una actividad de agua de 0.98, si la pasamos a 0.96 esta pierde el 50% del agua contenida en su citoplasma, por lo que se colapsa), después gram(+), cocos gram(-), gram(+), levaduras, hongos micelianos. Los hongos tienen la capacidad de crecer en entornos de actividad de agua bajas.
Ej: ¿Por qué los enólogos cuando hacen vino no necesitan implementar medidas de control de enterobacterias?. Porque el mosto de uva tiene una actividad de agua MUY BAJA, debido a 8 Gabriel Gestido Hervés GRADO EN BIOTECNOLOGÍA URV su alta concentración de azúcar, además el mosto de uva es muy acido (2-3). Es un medio muy adverso para el desarrollo de microorganismos.
La excepción son las bacterias halófilas: son aquellas bacterias o microorganismos halófilos que necesitan medios donde haya sustrato con bajas concentraciones de agua debido a altas concentraciones de NaCl. Las bacterias halófilas de color rojo se protegen mediante carotenos, en el desierto de atacama en las salinas.
Diferenciación entre halófilos y halotolerantes: el ultimo es capaz de vivir en entornos con baja actividad de agua y el primero lo necesita.
Ej: la actividad máxima de agua es 1. Los bacilos gram(-) tienen actividades de agua optimas de 0,99.
 POTENCIAL REDOX: Se relaciona con la capacidad de utilizar el oxígeno.
• AEROBIO: necesita oxígeno para utilizarlo en la vía respiratoria, es el aceptor final de e- que da lugar a CO2 y agua. Es la más eficiente: a partir 1 glucosa se obtienen 38 ATP.
-Ej: -Si tenemos un supuesto cultivo en un tubo y toda la población se dispone arriba (Tubo A), necesitan oxígeno, aerobios estrictos.
- Los del tubo B lo opuesto, pueden hacer fermentaciones o respiraciones anaeróbicas, son anaerobios estrictos, el O les es toxico.
-Los del tubo C son anaerobios facultativos, pueden sacar más rendimiento con oxígeno pero pueden vivir en condiciones anaerobias, son capaces de realizar respiración aeróbica y si no fermentan.
-Los del tubo D son microaerófilos, se caracterizan por necesitar presiones parciales de O bajas, necesitan un poco pero tampoco demasiado.
Los del tubo E serían aerotolerantes, el O no les afecta.
La respiración puede ser de diferente forma debido a diferentes aceptores finales de e-: el rendimiento depende de la cantidad de saltos en la cadena, cuantos más saltos son realizados más ATP se forma.
¿Qué pasa al querer cultivar microaerófilos?: Se necesitan presiones parciales de O bajas, y de CO2 altas. Estas condiciones se crean mediante jarras anaeróbicas o jarras gaspac (gas-paquete). Es una jarra del tamaño de un 9 Gabriel Gestido Hervés GRADO EN BIOTECNOLOGÍA URV recipiente como una botella y dentro se ponen las placas sembradas con un paquete dentro, que puede generar condiciones anaeróbicas. Se le añaden 10mld e agua. El contacto del polvo del paquete con el agua reacciona con el O y no queda nada de O, condiciones anaerobias, óptimas para hacer crecer bacterias microaerófilas como las lácticas.
Inicialmente los de los años 40 metían una vela para cultivar bacterias lácticas, se consume O y se incrementa CO2.
¿Como podemos saber que un microorganismo es capaz de utilizar el O de forma aerobica? Poniendo en evidencia la presencia de la catalasa, que solo está presente si es necesario. Interviene en el desdoblamiento del peróxido de hidrogeno, que se forma erróneamente. Este compuesto es tóxico para el organismo por lo que se tiene que degradar mediante una reacción en la cual interviene la catalasa. Lo transforma en agua y medio de O que es lo que se detecta al añadir agua oxigenada en una colonia catalasa+.
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