Tema 4. Plegament i dinàmica de proteïnes (2015)

Apunte Catalán
Universidad Universidad de Barcelona (UB)
Grado Ciencias Biomédicas - 3º curso
Asignatura PMOS I
Año del apunte 2015
Páginas 9
Fecha de subida 08/10/2017
Descargas 0
Subido por

Vista previa del texto

PMOS I Tema 4. Plegament i dinàmica de proteïnes Plegament (folding) Estructura funcional, o procés d’adquisició de l’estructura funcional (nativa). És el procés oposat a la desnaturalització.
La seqüència d’aa acaba tenint una estructura que fa que les proteïnes siguin funcionals. Sabem que algunes seqüències estan relacionades amb malplegaments però no sabem les estructures 3D.
Aquest és el dogma en que es basa la biologia des de fa 20 anys.
Experiment d’Anfinsen El plegament depèn de les condicions del medi: - Factors físics: temperatura (augment de temperatura -> desnaturalització), pressió - Factors químics: pH (si baixem el pH es desnaturalitza les proteïnes de llet i obtenim el formatge p.e), dissolvents orgànics, caòtrops que indueix el desordre, desestructura les proteïnes (urea, clorur de guanidini-> s’utilitza per purificar el DNA) És reversible i cooperatiu.
Basat en el dogma anterior explicat. Quan la proteïna està desnaturalitzada no funciona i quan es renaturalitza si. És reversible perquè passem de desnaturalitzat a renaturalitzat i és cooperatiu perquè quan s’enganxen les proteïnes fa que s’enganxin les altres.
La seqüència està relacionada amb la funció.
20 PMOS I Proteïna: desnaturalitzada - nativa Estructura de cabdell estadístic (desnaturalitzada): - Irregular, variable, oberta - Molts residus hidrofòbics exposats al solvent que normalment és aquós: efecte hidrofòbic, contribució entròpica al Pocs enllaços intramoleculars plegament Els clatratos és el que forma l’aigua quan envolta els residus hidrofòbics.
Estructura regular (compacta, naturalitzada): - Es forma quan extraiem l’aigua, l’aigua abans estava ordenada en la desnaturalitzada però ara en el plegament s’ha desordenat. S’ordena la proteïna i es desordena el dissolvent.
- Abundants estructura secundària - Residus hidrofòbics poc exposats Molts enllaços intramoleculars: ponts d’hidrogen , enllaços iònics, interaccions Van der Waals Termodinàmica del plegament G: energia lliure de Gibbs, ha de ser negativa perquè passi la reacció H: entalpia 21 PMOS I S: entropia Segons l’entalpia si es negativa es una reacció exotèrmica. Perquè passin les reaccions químiques ha d’augmentar el desordre que ve motivat per dos variables que són l’ordre de la proteïna i l’ordre del dissolvent. En la renaturalització es trenquen els clatratos.
L’energia lliure de Gibbs són valors petits, negatius per tant promouen que el plegament es produeixi. L’entropia es dependent de la temperatura. Per tant quan tenim febre i augmenta la temperatura, la T fa que baixi la energia lliure de Gibbs i es desnaturalitzen les proteïnes. Canvis molt petits en la temperatura provoca un canvi gran.
Termodinàmica i predicció estructural - És difícil trobar l’estructura de mínima energia: Variació de G de plegament, valor petit; contribució de múltiples factors, no sempre reconeguts, no sempre precisos.
El plegament no es dóna a l’atzar.
- Paradoja de Levinthal: en la pràctica, no és possible mostrejar l’astronòmic número (10^143) de conformacions possibles.
- Solució a la paradoja de Levinthal: mecanismes de plegament (paisatge / entorn d’energia conformacional). *El plegament és un problema cinètic, de moviment en el temps.
El plegament és un problema cinètic.
Rutes de plegament Paradoja de Levinthal: les proteïnes no poden explorar a l’atzar totes les possibles conformacions buscant l’estat de mínima energia.
Una proteïna de 100 residus amb diverses limitacions conformacionals (residus amb 2 estats) tardaria > 40 milions d’anys en plegar-se. Això és una paradoja ja que això no pot ser possible.
22 PMOS I La conclusió és que les proteïnes s’han de plegar per alguna ruta ordenada, cada vegada tenen menys opcions per plegar-se i per això tarden menys. Les etapes incials del plegament proteic tenen una escala temporal de submilisegons mentre que el plegament complet tarda mseg o seg.
Esquema d’un paisatge/entorn energètic pel plegament proteic “Energy landscapes” són esquemes 3D del nombre de conformacions (entropia, pla horitzontal) i la seva energia lliure relativa (vertical). És un embut.
La cerca de l’espai conformacional no es aleatòria (embut “funnel” d’energia conformacional). El nombre de possibilitats de plegaments es va reduint en el temps.
Cada proteïna es plega en un entorn conformacional diferent.
F: energia lliure (variació de G) // C: nombre de contactes entre residus que es troben a la forma definitiva // Q0: nombre de contactes que es corresponen en l’estat natiu (estable) Simulació del plegament d’una proteïna de 27 residus.
Teoria de plegament per “landscapes” - Primer tenim la teoria més simple que involucra intermediaris ben definits (poques proteïnes). Des d’una cadena d’aa desplegada, no té intermediaris i forma una forma plegada. Seria un embut com el A. Això és una especulació teorica ja que no s’ha trobat cap proteïna amb aquestes característiques.
- Tenim pocs intermediaris ben definits que fan que de la forma desplegada, formen una amb residus hidrofòbics i finalment es plega i s’acaba d’ajustar. Seria l’embut B. S’ha de passar per una serie de conformacions per arribar a l’estructura nativa de la lisozima.
- És la més freqüent. És el globus fos o glòbulo fundido. Té diferents pics l’embut i formen els globuls fosos que són especies de plegament intermedi estables pero encara no funcionals ja que no tenen una estructura definida. Un 23 PMOS I cop es fan ajustes pot evolucionar a l’estat definitiu. Es redueix l’energia lliure i l’entropia fins que arriben al seu estat natiu.
Hi ha molts camins que donen lloc a l’estat plegat.
Entorn energètic pel plegament de la lisozima HI ha dues rutes , una groga que és rapida i la roja que es lenta. En un moment dtemrinat la sequencia de la lisozima pot adoptar la forma roja on hi ha un intermediari que es el domini alfa on es estable i per arribar a la forma nativa necessita un aport d’energia per evolucionar a l’intermediari on hi ha alfa i beta i finalment a l’estat natiu.
La ruta groga fa que arribi a l’intermediari alfa i beta més ràpid.
Mecanismes de plegament El B es queda parat al F i després pot continuar. El C arriba a un intermediari més estable amb una G petita fins que no te mñes energia per poder avançar, la proteïna no pot funcionar bé perquè s’ha estabilitzat en un intermediari no funcional. Això passa en algunes malalties com la fibrosi quística.
24 PMOS I Estats de transició i energia d’activació Com més profund sigui la enrgia lliure, necessitarem més energies d’activació perquè surti de les estructures estables però que no són natives.
Les xaperones donen un entorn on la proteïna té l’opció de surtir d’un nucli fos (intermediari estable) per arribar a la proteïna nativa.
Com resolen el problema les cèl·lules? Plegament acoblat a la síntesi de proteïnes: - plegament de proteïnes neixents - control mitjançant xaperones moleculars prevenció i correcció d’errors de plegament en condicions d’estrès (Hsp) Enzims que ajuden al plegament: - proteïna-disulfur isomerases peptidil-prolil isomerases Tipus de moviments i escales de temps Tot està en moviment.
25 PMOS I Variabilitat conformacional de les proteïnes L’estructura nativa generalment no és única. A l’estat natiu és l’estat de mínima energia, al fons de l’embut. Al voltant hi ha altres estats semblants que són les conformacions alternatives. NO són globus fosos, no són estats intermedis.
Els canvis conformacionals són una necessitat funcional: - ajustament induït per altres proteïnes: l’estructura d’un monòmer s’uneix a una estructura més elevada com el tetràmer es formen canvis perquè el tetràmer s’estabilitzi.
- regulació al·lostèrica - adaptació al medi (pH, I) activació per canvis d’entorn (inserció en membranes) Els entorns energètics poden ser remodelats i alterar la dinàmica de la proteïna Proteïnes que canvien la conformació perquè arriba una senyal. Tenim dos conformacions funcionals diferents. A l’interaccionar amb la senyal es modifica el perfil fent que una forma conformacional sigui més abundant que una altra.
Tenim un reequilibri de les formes o que només apareixi una o una altra forma.
Amb la fosforilació (senyal) la proteïna està inactiva però continua sent funcional. També podem tenir potencials d’acció (senyals elèctriques) que fan que s’obrin canals o es tanquin.
26 PMOS I Proteïnes intrínsecament desordenades Es poden ordenar amb interaccions amb altres proteïnes però no tenen una estructura (plegament) determinat sino que en poden tenir molt.
Proteïnes amb una estructura poc definida, en tot o en part: - Completament desordenades: 10% de les proteïnes, segons prediccions - Amb segments desordenats llargs: 40% de les proteïnes eucariotes Estructura ordenada depèn de: - Translocació a un altre medi - Modificacions post-traducció Interaccions amb altres proteïnes: mecanisme de regulació, promisqüitat estructural, adaptació a diversos substrats.
Tècniques per analtizar el plegament de les proteïnes (rapid mixing) Com observar esdeveniments molt ràpids (sub-milisegons)? - Aparells de Stopped-flow: barrejar dos solucions, parar i monitoritzar esdeveniments més temprans. Utilitzar concentracions de pH (àcid i base injectats simultaniament) o desnaturalitzant que desnaturalitza proteïnes i ràpidament diluir la mescla per iniciar el procés de plegament. Es va injectant desnaturalitzant però cada vegada injectem més naturalitzant.
- Proteïnes desnaturalitzades per fred: es posa en la cambra una sollució congelada, es fa un puls amb el làser que escalfa i pot passar de -40º a 10-30ºC en 0.1 mseg. Podem controlar que passa amb el puls del làser. Això s’utiltiza en proteïnes sensibles al fred. El plegament s’inicia per un salt de temperatura.
27 PMOS I Mètodes d’estudi de la dinàmica molecular Experimentals: - Fluorescència - Espectrometria de masses RMN Dicroïsme circular Computacionals: - Simulació molecular Dinàmica per espectrometria de masses Tenim una situació desnaturalitzant on podem utilitzra l’hidrogen que es troba a la proteïna i incorporar deuteri en el medi que s’intercanvi amb l’hidorgen on hi hagi flexibilitat. Es fa durant un temps i es torna a desnaturalitzar per parar l’intercanvi. La ordenem amb HPLC i la sotmetema a una espectrometria de masses i veiem que hi ha alteracions.
Simulacions de Dinàmica Molecular Evolució temporal d’una estructura a l’aplicar una funció d’energia potencial.
Hi ha limitacions com el temps (pocs microsegons), mida (centenes de mils d’atòms), tecnològiques (capacitat de càlcul, teoria, camps de forces).
Software simulació dinàmica proteïnes Un dels que més s’ha utilitzat és el folding@home.
Alfa-sinucleïna: proteïna camaleó És més complex que l’alfabet estructural de les proteïnes ordeandes. Són totes les formes que pot fer l’alfa-sinucleïna.
28 ...

Comprar Previsualizar