Tema 6 (2014)

Apunte Español
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Bioquímica - 2º curso
Asignatura Cultius cel·lulars
Año del apunte 2014
Páginas 10
Fecha de subida 21/02/2015
Descargas 20
Subido por

Vista previa del texto

María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Cultius cel·lulars T6 Tema 6. Caracterització de línies cel·lular Una revista de prestigi va publicar una noticia a l’any 2011 en la qual es deia que una evidència suggereix que un terç de les línies tumorals establertes que s’estan utilitzant en investigació científica i mèdica estan afectades per contaminació creuades per cèl·lules de la pròpia espècie o unes altres i en conseqüència, moltes de les conclusions que s’obtenen són dubtoses i en molts casos invàlides.
Per tant, la caracterització, és a dir, la autentificació de les línies cel·lulars és un problema molt important. La línia cel·lular HeLa és una de les contaminants habituals. Si nosaltres tenim una línia establerta i està contaminada amb una altra que sigui molt difícil de diferenciar, necessitem de sistemes que ens permetin fer-ho ja que probablement estarem cultivant més d’una línia cel·lular i els resultats que obtindrem seran dubtosos.
APLICACIONS DE LA CARACTERITZACIÓ DE LÍNIES CEL·LULARS La caracterització de les línies cel·lulars és una cosa imprescindible i les companyies mencionades a l’apartat anterior tenen una gran quantitat de línies cel·lulars caracteritzades. Els laboratoris de recerca que demanen aquestes línies per poder treballar poden fer la seva pròpia caracterització tot i que si els recursos són limitats poden no fer-ho. De forma general, quan nosaltres comprem una línia cel·lular no la caracteritzem sinó que ens fiem de la informació de la companyia. La caracterització de línies cel·lulars permet:  Determinar si hi ha contaminació creuada amb altres línies cel·lulars. Quan utilitzem el mateix medi per cultivar diferents línies, per exemple. En aquest cas passaríem a cultivar 2 línies que són molt difícils d’identificar (un fibroblast d’un hàmster i un humà són morfològicament molt semblants). És la principal funció de la caracterització.
 Identificar si la línia presenta inestabilitat genètica. La caracterització ens permet veure si una línia cel·lular creix de la mateixa manera al llarg del temps ja que s’ha pogut produir una contaminació creuada o bé que hi hagi inestabilitat genètica, és a dir, un canvi en els cromosomes.
 Amb la caracterització podem veure també si els canvis que es produeixen provoquen que la línia expressi propietats associades a la transformació; a nivell de cultius pot ser que la inhibició per contacte deixi d’existir i per tant, que les cèl·lules creixin les unes sobre les altres  Validar línies per a l’obtenció de vacunes . Quan agafem una determinada línia cel·lular i la utilitzem per produir una determinada proteïna, el que ens interessa és que la línia sigui el màxim d’estable possible i per això moltes vegades s’exigeix que la línia cel·lular comprada i la productora (la modificada per produir la proteïna) no variï en el nombre de cromosomes en més d’un 5 %. Això ens garanteix que els canvis cromosòmics siguin gairebé inexistents i en conseqüència que la línia cel·lular i la producció siguin estables.
 En alguns casos es pot conèixer quin és el teixit d’origen però això és molt difícil.
 Confirmar l’espècie d’origen de les cèl·lules si les variacions cromosòmiques són limitades.
1 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Cultius cel·lulars T6 Cèl·lules del teixit hematopoètic i marcadors Com ja havíem dit, en l’espècie humana el teixit hematopoètic és el que esta millor caracteritzat ja que podem seguir el llinatge cel·lular des de les cèl·lules mares del moll de l’os fins les cèl·lules de la sang.
Hi ha uns marcadors a les cèl·lules mare i alguns d’ells, a mesura que avança el desenvolupament, van canviant. De les cèl·lules mare obtenim dues línies progenitores que ja estan enfocades cap a les dues línies principals: mieloide i limfoide.
A partir d’aquí apareixen diverses línies. Cada vegada que anem avançant en la diferenciació cel·lular, fins arribar a la cèl·lula madura hi ha una sèrie de marcadors que van canviant. En aquest teixit coneixem tots aquests marcadors i per tant podríem saber en quin estadi de diferenciació estan les cèl·lules que estem cultivant. Cal tenir present que normalment no es té tanta informació.
Diferenciació cel·lular En tots els nostres teixits hi ha cèl·lules mare que tenen com a funció exclusiva reproduir-se i de tant en tant, algunes es diferencien per tal de regenerar les dels teixits que es van morint. En cèl·lules en cultiu, com que no estan en el seu ambient original, el procés de diferenciació queda blocat. Les cèl·lules per diferenciar-se interaccionen amb les cèl·lules del teixit i amés, amb la matriu extracel·lular, altres cèl·lules i fins i tot molècules que es troben a l’organisme i és tot aquest conjunt el que comporta la diferenciació. Un exemple són els limfòcits B que requereixen tot una sèrie de canvis per arribar a ser funcionals.
Per tant, quan posem les cèl·lules en cultiu es pot alterar el procés de diferenciació i en comptes d’arribar a l’estat diferenciat quedaran bloquejades en algun dels punts de diferenciació i es deixaran de comportar com les cèl·lules del teixit original. Aquest fet l’hem de tenir present ja que es poden expressar marcadors que originalment no s’expressaven.
2 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Cultius cel·lulars T6 MÈTODES DE CARACTERITZACIÓ CEL·LULAR Trobem diversos mètodes de caracterització cel·lular i els veurem de més senzills a més complexos.
Caracterització morfològica La caracterització morfològica s’elabora a nivell de microscopi i si tenim dos tipus cel·lulars que creixen de forma diferent els podem diferenciar morfològicament.
Si tenim cèl·lules en suspensió, normalment, no podrem diferenciar els tipus cel·lulars si no tenim algun tipus de marcatge o un anàlisi amb un altre mètode. Cal tenir present que les cèl·lules que creixen en suspensió poden créixer formant grumolls o bé de aïllades i en aquest cas sí que les podríem diferenciar mitjançant una caracterització morfològica.
En les cèl·lules adherides, la morfologia pot variar amb el cultiu en funció de la densitat. Quan sembrem poques cèl·lules aquestes presenten fibroblasts (en cultiu aquests fibroblasts van migrant). Quan aquests fibroblasts arriben a la monocapa confluent i ja no es poden moure la seva morfologia pot variar.
Les cèl·lules en cultiu poden variar la seva morfologia en funció de si nosaltres afegim en el cultiu determinades molècules que provoquin un cert grau de diferenciació. En cèl·lules glials es pot induir aquesta diferenciació mitjançant un factor de creixement (són les mateixes cèl·lules però es posa un factor diferent en el cultiu).
Si treballem amb línies cel·lulars iguals però de diferent procedència no les podrem diferenciar des del punt de vista morfològic sinó que necessitem eines més potents.
Caracterització immunocitoquímica o per immunofluorescència Aquestes caracteritzacions es basen en utilitzar anticossos específics. Concretament, la immunocitoquímica es basa en la utilització d’enzims per obtenir marcatges que ens permetin diferenciar les línies cel·lulars i la immunofluorescència en diferenciar les línies cel·lulars gràcies a fluorocroms que hem unit a proteïnes de manera específica.
Per exemple, amb la tècnica d’immunofluorescència es pot marcar la queratina amb un anticòs unit a un fluorocrom que emet en color verd i la vimentina amb un anticòs que emet fluorescència en vermell.
Quan un cultiu de queratinòcits i vimentinòcits està junt es poden veure dos colors en cultiu.
3 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Cultius cel·lulars T6 Aquest tipus de marcatge és útil quan volem establir cultius primari de queratinòcits perquè com que els fibroblasts ens creixen molt, després d’un cert temps de seleccionar els queratinòcits, si tenim sospites que tenim fibroblasts, podem fer aquest assaig. Amb aquesta tècnica podem marcar proteïnes específiques de membrana que només presentin un tipus cel·lular o també podem determinar cadherines.
També es pot elaborar l’experimentació per determinar molècules: a la imatge veiem com s’ha marcat el GABA que trobem a les neurones de color marró i al voltant trobem les cèl·lules de la glia únicament tenyides amb Giemsa.
Si no tinguéssim microscopis fluorescents podríem utilitzar la tècnica d’immunocitoquímica. Veiem l’exemple d’un anticòs unit a una peroxidasa. Sabem que en presència de peròxid d’hidrogen s’elabora una reacció que dóna color marró. Per tant, si fem el marcatge, rentat i afegim al medi peròxid d’hidrogen, únicament veurem color marró allà on s’ha unit el anticòs, és a dir, on trobem la proteïna que busquem.
Cultivar cèl·lules pot modificar l’expressió d’algunes molècules Un dels problemes que pot haver-hi és que hi ha proteïnes que mentre que originalment les cèl·lules les poden expressar, quan estan en cultiu no es produeixen a causa de la desdiferenciació, de manera que el marcatge ens pot sortir negatiu i podem pensar que aquestes proteïnes no hi són. A la taula següent podem veure com varia: 4 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Cultius cel·lulars T6 Caracterització per activitat enzimàtica Un glioma és un tumor i dins d’aquests trobem cèl·lules més o menys diferenciades. Cal tenir present que la indiferencició en les cèl·lules transformades és normal. En aquest cas observem com les cèl·lules del glioma indiferenciades són capaces de produir una proteïna en gran quantitat, a diferència de les cèl·lules normals que tenen una producció més baixa.
Per tant, pot ser que puguem caracteritzar línies cel·lulars per l’activitat d’algun enzim.
Fenotipatge isoenzimàtic Observem una experimentació en la qual s’elaboren electroforesis de diferents proteïnes i diferents animals: dues persones, dos micos, dos hàmsters, una rata i un ratolí. Veiem que tenen mobilitat electroforètica diferent i per tant, si tenim una bateria d’enzims podem caracteritzar les cèl·lules per cadascun d’aquests isoenzims.
Caracterització citogenètica Trobem diferents mètodes per tal de caracteritzar línies cel·lulars citogenèticament.
Anàlisi cromosòmic amb tinció uniforme Per tal de caracteritzar una línia cel·lular podem comptar quants cromosomes té i veure si es correspon amb el número de cromosomes de la línia d’origen, per tant ens permet determinar quin és el cariotip modal d’una línia. Aquest anàlisi també ens permetrà veure si s’ha produït aberracions cromosòmics.
Per fer l’anàlisi cromosòmic s’afegeix un inhibidor mitòtic com la colquicina fent que quan les cèl·lules arriben a la mitosi, el nucli desapareix i els cromosomes en comptes d’agrupar-se a la placa equatorial es dispersen. Així doncs, si fem un tractament hipotònic i hem afegit colquicina, quan fixem les cèl·lules, els cromosomes estaran separats i es podran elaborar recomptes més o menys viables.
En línies cel·lulars que s’han desestabilitzat o bé provinents de tumors hi haurà variacions en el número de cromosomes però tot i això les podrem caracteritzar.
Bandeig cromosòmic Si tenim interès en determinar si hi ha cromosomes anòmals podem aplicar aquesta tècnica que ens dóna el patró de bandes específic de cada cromosomes. Per tant, podrem identificar cada cromosoma per separat la qual cosa ens dóna una fiabilitat superior al mètode anterior.
5 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Cultius cel·lulars T6 Hibridació in situ fluorescent (FISH) FISH ens permet caracteritzar línies cel·lulars si aquestes tenen una anomalia coneguda. Es tracta de sondes de DNA marcades amb un fluorocrom que hibriden amb cromosomes, ja sigui parcialment o totalment.
A la imatge de l’esquerre veiem que s’han utilitzat sondes que engloben 3 parells cromosòmics i també els centròmers. A la imatge de la dreta veiem cromosomes que tenen un tros blau i l’altre rosa de manera que s’ha produït una reorganització cromosòmica i FISH ens pot servir per caracteritzar-la ja que és molt estrany que h hagués una altra línia amb la mateixa anomalia.
mFISH mFISH fa servir sondes que marquen diferencialment tots els cromosomes humans, és a dir, les sondes que hibriden amb el cromosoma 1 són diferents pel que fa a la emissió de fluorescència de les que hibriden amb el cromosoma 2. Per tant, podem arribar a identificar cada cromosoma per separat i reconstruir una imatge virtual ja que hem de tenir presents que els colors d’aquesta imatge no són reals sinó que són una representació.
Ens permet identificar alteracions cromosòmiques si es repeteixen i són clonals en una línia, i això ens permeten tenir-la caracteritzada.
6 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Cultius cel·lulars T6 Caracterització per DNA fingerprint Dins de la caracterització per DNA fingerprint hi ha un ventall enorme de possibilitats. L’ATCC utilitza aquesta tècnica per tal de caracteritzar les seves línies.
Hi ha molts tipus de sondes repetitives que presenten polimorfismes i aquest fet s’ha aprofitat molt en medicina forense i en la caracterització de línies cel·lulars.
Per exemple, podríem determinar si un fill ha heretat els al·lels del possible pare o no i per tant, gràcies al patró de polimorfismes podem saber qui és el pare.
Dins de les soques de HeLa es poden produir modificacions al llarg del temps ja que fa més de 50 anys que corren pel món. En alguns casos, la pròpia inestabilitat provoca un canvi. Veiem a la imatge que en la soca HeLa Ohio hi ha una banda que no existeix als altres i per tant ens permet diferenciar aquesta línia cel·lular.
Tenim un exemple d’11 polimorfismes de longitud (loci) i tenim 5 soques de HeLa. Pel que fa a aquests polimorfismes, que es detecten gràcies al tall dels enzims de restricció, podem diferenciar unes línies d’altres.
Veiem un altre exemple de línies cel·lulars, en aquest cas de cèl·lules immortalitzades. El DNA està tallat amb dos enzims de restricció. MDAH és una línia cel·lular d’una persona que té un Síndrome i les altres són la mateixa línia immortalitzada. S’han immortalitzat amb concentracions diferents d’hepatoxina (LCS-AF) i amb raigs X (LCS-4x2) i la LCS – ST de forma espontània. Observem que aquest procés d’immortalització provoca canvis genètics. L’aplicació d’aquesta metodologia ens permet diferenciar la línia que s’ha diferenciat de manera espontània de la resta.
7 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Cultius cel·lulars T6 Anàlisi per STR (Short Tandem Repeats) La metodologia del DNA en els últims 10 anys ha evolucionant de forma molt ràpida, sobretot gràcies a projectes com el del genoma humà. Avui en dia, les grans cases comercials que venen línies cel·lulars utilitza l’anàlisi de repeticions en tàndem petites de diverses zones polimòrfiques que es coneixem com STR. A més, aquest anàlisi es bastant ràpid.
Veiem un exemple d’una mostra de DNA d’un organisme cel·lular on si surt 1 pic es tracta d’un homozigot i si surten dos pics és un heterozigot. Això és degut que la longitud de les dues unitats repetides en el cromosoma matern i patern no són idèntiques en el cas d’heterozigot. La amelogenina s’utilitza també per determinar si és mascle o femella: un pic femella i dos pics mascle.
També es pot fer servir aquest anàlisi per línies cel·lulars. Veiem dues línies cel·lulars d’origen diferent que mostren diferents patrons per 9 regions polimòrfiques (una d’elles l’amelogenina). Per tant, gràcies a això podem diferenciar les línies cel·lulars.
Al següent esquema veiem dues línies cel·lulars relacionades i per tant, tot i que una provingui de l’artèria aorta i l’altre de l’artèria femoral, el patró és el mateix pel que fa a tots els loci.
8 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Cultius cel·lulars T6 A la següent imatge veiem una caracterització de línies cel·lulars en la qual tenim la línia original que s’obté del donant, les línies amb les que nosaltres fem les expressions i la de distribució. En teoria, la línia de distribució ha de ser idèntica a la del donant. Això ens assegura que entre la línia original i la de distribució no hi ha canvis, per tant, que la línia és estable.
STR també ens pot servir per veure si tenim contaminació creuada. Si tenim una línia cel·lular i sospitem que aquesta està contaminada, hem de reproduir el patró per veure si coincideix amb l’original. A la imatge veiem que a part del patró que hi havia a la línia original trobem un altre patró, és a dir, que a part de cultivar la nostra línia estem cultivant una altra.
Malgrat que la potència de les STR és molt gran, no sempre podem arribar a explicar-ho tot. BC-1-Ep és una línia de keratinòcits i NIKS és la mateixa immortalitzada. Si fem anàlisis, veiem que tenen patrons idèntics en els 12 loci que s’ha mirat. No som capaços de discernir inicialment les dues línies ja que no les hem sotmès a forces químiques o físiques. Si s’analitzen citogenèticament, hi ha una línia que presenta un cromosoma de més. Per saber quin era van fer metodologia de bandes. Era un isocromosoma 18.
9 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Cultius cel·lulars T6 El que seria bo és que tot el laboratori sigui capaç d’aplicar almenys dos tipus de sistema de caracterització de les línies per estar segurs de que realment treballem amb les línies que volem. A vegades, una sola metodologia, per molt potent que sigui no és capaç de donar-nos tota la informació. De totes les metodologies, l’ús de polimorfismes del DNA i el seu anàlisi sol ésser molt bona, sol ésser la més potent, però, de vegades, hi ha coses que no detecta i hem de recórrer a altres metodologies.
La caracterització de les línies en laboratoris no és gaire habitual. Ho fan les cases que les tenen dipositades i les han d’enviar.
10 ...