TEMA 7 - RNA (2014)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Biología - 2º curso
Asignatura genètica molecular
Año del apunte 2014
Páginas 4
Fecha de subida 28/12/2014
Descargas 45
Subido por

Vista previa del texto

TEMA 7→ TIPUS DE RNA I PROCESSAMENT • Tipus de RNA [explicat tema 6] ORGANITZACIÓ DELS GENS • • • • • bacteris -col·linealitat→entre gens i proteïnes, és a dir, hi ha una correspondència directa entre la seqüència de nucleòtids del DNA i la seqüència d’AA d’una proteïna. Suggereix que el n1 de nucleòtids d’un gen hauria de ser proporcional al nº d’AA. Es dóna en bacteris i virus.
• eucariotes -no col·linealitat→cells eucariotes tenen molt més DNA que el necessari per codificar proteïnes i a més a més, tots els RNAs recent transcrits pateixen modificacions.
-experiment: DNA i RNA barrejats s’escalfen, les cadenes es separen quan es refreda la barreja el DNA es pot reassociar amb la seva cadena complementària o es pot hibridar amb RNA →al ser més llarg que aquests es formen bucles (es el que van observar a ME). Aquestes regions contenien nucleòtids en el DNA que no es trobaven a l’mRNA.
• introns→regions no codificant o intervinents. (hi ha excepcions) -comuns en eucariotes(la majoria dels gens estan interromputs per introns llargs), rars en bacteris -introns>exons (normalment) -en eucariotes , les dimensions i el nº d’introns és proporcional a la complexitat de l’organsime. ↑( evolucionat=↑introns).
→ex. gen ovoalbúmina té 8 exons i 7 introns; el gen del citocrom b té 5 exons i 4 introns. Inicialment, tots els introns i exons es transcriuen a RNA, però després de la transcripció els introns s’eliminen per splicing*(=empalmar o unir), i els exons s’uneixen per donar l’mRNA madur.
-4 grups d’introns. Grup I→ en rRNa, s’autotallen i empalmen, grup II→codifiquen proteïnes en els mitocondris i cloroplasts, grup nuclear pre-mRNA→codifiquen per proteïnes en el nucli (per splicing), necessiten els snRNA i varies proteïnes i el grup dels tRNA que codifiquen per gens del tRNA i es tallen i s’empalmen enzimàticament.
*splicing→procés post-transcripcional de maduració de l’RNA on s’eliminen certs fragments seqüencials. S’eliminen els introns del transcrit primari i posteriorment s’uneixen els exons; encara que hi ha altres tipus d’ajustaments on s’eliminen els exons i es retenen els introns (=splicing alternatiu) • característiques de les seqüències exó-intró -l’orde dels exons és = en DNA i mRNA -en eucariotes, existeixen introns en pre-mRNA, pre-rRNA i pre-tRNA -l’estructura exó-intró es manté en tots els teixits -gens evolutivament conservats tenen la mateixa estructura exó-intró.
-en gens emparentats, els exons tenen seqüències semblants però els seus introns →es conserva no la funció dels exons durant l’ →(aplicacions experimentals en l’aïllament de gens i caracterització de gens (zoo blot, exon trapping..) evolució Pre-mRNA i mRNA • estructura -funciona com a motlle per la síntesi proteica; transporta la informació genètica des del DNA fins a un ribosoma, ajuda a col·locar els AA en l’ordre correcte. En bacteris, l’mRNA es transcriu directament però eucariotes necessitem un pre-mRNA (o transcrit primari) que s’ha de processar per tenir la seva forma madura.
-en l’mRNA, cada AA d’una proteïna està especificat per un conjunt de tres nucleòtids(=codó). Tant els mRNA procariotes com eucariotes tenen tres regions primàries.
1. regió 5’ no traduïda (=5UTR o líder)→seqüència de nucleòtids de l’extrem 5’ de l’mRNA, que no codifica la seqüència d’AA d’una proteïna.
[2. Shine-Dalgarno (procariotes)→serveix com a lloc d’unió dels ribosomes durant la traducció, es troba a prop de la regió 5’UTR.] 2. regió que codifica proteïnes→comprèn els codons que especifiquen la seqüència d’AA de la proteïna. Aquesta regió comença amb un codó d’iniciació i acaba amb un codó de terminació.
3. regió 3’ no traduïda (=3’UTR o remolc)→una seqüència de nucleòtids a l’extrem 3’ de l’mRNA que no es tradueix a proteïna. Afecta l’estabilitat de l’mRNA i la traducció de la seqüència de mRNA que codifica la proteïna.
• Processament del pre-mRNA -en cells bacterianes la transcripció i la traducció es donen de manera simultània; mentre s’està transcrivint l’extrem 3’ d’un mRNA, els ribosomes s’uneixen a la seqüència de Shine-Dalgarno a prop de l’extrem 5’ i s’inicia la traducció. Com que la transcripció i la traducció estan acoblades, hi ha poques oportunitats per què l’mRNA es modifiqui abans d ela síntesi proteica.
-en cells eucariotes, la transcripció i la traducció estan separades de manera temporal i espacial. La transcripció es dóna al nucli mentre que la traducció es dóna al citoplasma; aquesta separació proporciona oportunitats perquè l’mRNA es modifiqui abans de ser traduït. De fet, s’altera molt. Es donen canvis a l’extrem 5’ el 3’ i a la secció que codifica proteïnes de la molècula d’RNA.
• modificació a l’extrem 5’ -a la regió 5’ s’afegeix una estructura anomenada casquet 5’, s’afegeix un nucleòtid a l’extrem 5’ de l’mRNA i la metilació (per l’adició d’un grup metil (CH3)- de la base del nucleòtid recent afegit, i l’adició d’un grup 2’-OH, al sucre de un o més nucleòtids presents a l’extrem 5’. El procés d’adició del casquet 5’ es dóna ràpidament després de la iniciació de la transcripció i es important per la traducció ja que les proteïnes que s’uneixen al casquet 5’ el reconeixen i s’adhereixen a ell; després un ribosoma s’uneix a aquestes proteïnes i es mou en direcció 3’ al llarg de l’mRNA fins arribar al codó d’iniciació i comença la traducció. La presència del casquet↑estabilitat de l’mRNA i influeix en l’eliminació dels introns.
A l’extrem 5’ de totes les molècules de l’RNA hi ha 3 fosfats, perquè aquests grups no es separen del primer ribonucleòsid trifosfat en la reacció de transcripció. L’extrem 5’ del pre-mRNA pot representar-se com 5’pppNpNpN..., en la quan la lletra N representa un ribonucleotid i la p un fosfat. Poc després de la iniciació de la transcripció un d’aquests fosfats s’elimina i s’afegeix un nucleòtid guanina. Aquest s’uneix al pre-mRNA per un enllaç 5’-5’ únic, que és diferent a l’enllaç fosfodiester 5’-3’ habitual, que uneix a tots els altres nucleòtids de l’RNA: essencialment, el nucleòtid, el nucleòtid de guanina es fixa al reves en l’extrem 5’ del pre-RNA. Després s’afegeixen un o més grups metil l’extrem 5’; el primer d’aquests grups s’afegeix a la posició 7 de la base del nucleòtid guanina terminal, i es transforma en una 7-metilguanina.
-l’addició del casquet necessita la participació de varis enzims diferents. EL pas incial el dóna a terme un enzim que s’associa amb la RNA polimerasa II. Com que la polimerasa I i III no tenen asociat aquest enzim no produeixen aquest casquet 5’ (rRna, tRNA i snRNA).
• modificació a l’extrem 3’→addició de la cua de poli A -s’afegeixen entre 50 i 250 nucleòtids d’adenina a l’extrem 3’ formant una cua poliA. Aquest nucleòtids no estan codificats pel DNA, sinó que s’afegeixen després de la transcripció en un procés conegut com a poliadenilació.
-el processament de l’extrem 3’ del pre-mRNA necessita seqüències tant en direcció 5’ com 3, respecte el lloc del tall i determina el punt en què aquest es donarà. La seqüència consens AAUAAA es troba entre 11 i 30 nucleòtids en la direcció 5’ respecte el lloc del tall i determina el punt en que passarà aquest. Una seqüència rica en uracils (o nucleòtids guanina i uracil) sempre es troba en direcció 3’ respecte el tall.
-un gran nombre de proteïnes participen en trobar el lloc de tall i eliminar l’extrem 3’.
Després de completar-se el tall, els nucleòtids d’adenina son addicionats al nou extrem 3’, i es crea la cua poliA.
-la cua poliA confereix ↑estabilitat a la majoria dels mRNA, el que augmenta el temps durant aquesta molècula resta intacta i disponible pel procés de traducció, abans de ser degradada per enzims cel·lulars.
L’estabilitat de la cua depèn de les proteïnes que s’uneixen a aquesta.
-la cua també facilita la unió del ribosoma a l’mRNA ←1. El pre-mRNA es talla a una posició entre 11 i 30 nucleòtids cap a l’extrem 3’ d’una seqüència consens AAUAAA, a la regió 3’ no traduïda. 2. L’adició dels nucleòtids adenina (poliadenilació) passa a l’extrem 3’ del pre-mRNA i genera la cua de poliA. Per tant, en el processament del pre-mRNA s’afegeix una cua de poliA a través d’un tall i de la poliadenilació.
• splicing -és una altra de les modificacions que es produeix al pre-mRNA. És la eliminació dels introns, es tallen i s’empalmen els exons.
tenen seqüències consens curtes. La majoria dels introns del pre-mRNA comencen amb -lloc de splicing 5’ GU i acaben amb AG, el que suggereix que aquestes seqüències tenen un paper central -lloc de splicing 3’ en el tall i empalma, de fet el canvi d’un nucleòtid únic evita que es doni l’splicing.
-punt de ramificació→és un nucleòtid d’adenina que es troba entre els nucleòtids 18 a 40 en direcció 5’ respecte el lloc d’splicing. La seqüència que envolta al punt de ramificació no te consens.
-la deleció o mutació del nucleòtid d’adenina en el punt de ramificació evita l’splicing -splicing passa dins d’una estructura, l’empalmosoma, un dels complexos moleculars més grans. Consisteix en 5 molècules de RNA i gairebé 300 proteïnes. Els RNA corresponents són RNA moleculars petits la longitud dels quals oscil·la de 107 a 210 nucleòtids; aquests snRNA s’associen amb proteïnes per formar partícules ribonucleoproteiques petites (snRNP o “snurps”). Casa snRNP conté una única molècula de snRNA i múltiples proteïnes. L’empalmosoma està format per 5 snRNP que reben el seu nom dels snRNA que contenen (U1, U2, U4, U5 i U6) i algunes proteïnes no associades a un snRNA.
• El procés d’splicing -abans que es produeixi l’splicing, un exó que està en direcció 5’ (exó 1) i un exó que està en direcció 3’ (exó 2), es troben separats per un intró. El pre-mRNA es talla i s’empalma amb dos passos diferents.
1. el pre-mRNA es talla en el lloc de splicing 5’. Aquest tall allibera a l’exó1 de l’intró, i l’extrem 5’ de l’intró s’uneix al punt de ramificació; això implica que l’intró es replegui sobre d’ell mateix per fonar una estructura anomenada llaç.
El nucleòtid de guanina de la seqüència consens que es troba en el lloc d’splicing 5’ es lliga amb el nucleòtid d’adenina que es troba en el punt de ramificació; aquest enllaç es du a terme a través d’una reacció de transesterificació. El resultat és que el grup fosfat 5’ del nucleòtid de guanina està unit al grup OH de l’àtom de carboni 2’ del nucleòtid d’adenina del punt de ramificació.
2. es fa un tall en la zona d’splicing 3’, i de manera simultània a l’extrem 3’ de l’exó 1 s’uneix de manera covalent a l’extrem 5’ de l’exó 2. L’intró s’allibera en el punt de ramificació i es degrada ràpidament per enzims nuclears.
L’mRNA madur, format pels exons que s’han tallat i empalmat les uns amb els altres, surt al citoplasma, on es tradueix.
Aquestes reaccions d’splicing passen dins de l’empalmosoma, que s’ensambla sobre el pre-mRNA i pas a pas dóna aquestes dues reaccions.
-a l’empalmosoma→interaccions entre l’mRNA i els snRNA, i entre diferents snRNA. Aquestes interaccions depenen de l’aparellament en forma complementària entre les diferents molècules de RNA, i porta als components essencials del premRNA transcrit i de l’empalmosoma en una proximitat molt íntima, el que fa possible l’splicing.
-els passos catalítics claus durant el procés d’splicing es donen gràcies als snRNA que constitueixen l’empalmosoma.
-la major part dels mRNA es produeixen a partir d’una sola molècula de pre-mRNA, no obstant, en alguns organismes, els mRNA poden ser produïts per la unió de exons de dos o més pre-mRNA→splicing trans • Introns que s’autotallen i s’autouneixen (=selfsplicing) -alguns introns s’autotallen i s’autouneixen, tenen la capacitat d’autoeliminar-se d’una molècula de RNA. Aquests introns es classifiquen en dues categories principals.
1. grup I→es troben en diversos gens, entre els que s’inclouen alguns gens de rRNa en protistes, alguns gens del mitocondris dels fongs i en bacteriòfags. Tots ells es pleguen en una estructura secundaria comú amb nou talls que formen bucles, necessaris pel procés d’splicing.
2. grup II→es troben en alguns gens dels mitocondris. Es pleguen en estructures secundaries. L’splicing dels introns del grup II es du a terme a través d’un mecanisme que conté certes similituds amb l’splicing de gens nuclears mediats per l’empalmosoma; l’splicing genera una estructura en forma de llaç. Ens introns del grup II i els introns del pre-mRNA nuclear, estarien relacionats evolutivament.
VIES PROCESSAMENT ALTERNATIU una DE única molècula de pre-mRNA es processa de diferent forma per produir diferents proteïnes a partir d’una mateixa seqüència de DNA.
• splicing alternatiu→la mateixa molècula de pre-mRNA pot tallar-se i empalmar-se de més d’una manera per donar com a resultat múltiples mRNA que es tradueixen a proteïnes amb diferents seqüències d’AA.
• múltiples llocs de tall 3’→al pre-mRNA es troben dos o més llocs potencials pel tall i la poliadenilació. Exemple de la foto, el tall en el primer lloc produeix un mRNA relativament curt comparat amb els mRNa produïts a través del tall en el segon lloc. L’ús d’un lloc de splicing alternatiu pot produir una proteïna diferent o no produir-la, segons is el lloc es localitza abans del codó de terminació o després d’ell.
-tant l’splicing alternatiu com els múltiples llocs de tall 3’ poden coexisitir en el mateix transcrit de pre-mRNA.
EDICIÓ DE L’RNA múltiples llocs de tall 3’ -la seqüència codificant d’una molècula d’mRNA s’altera després de la transcripció de manera que la proteïna té una seqüència d’AA diferent de la codificada pel gen.
-si la seqüència modificada en molècules d’RNA editades no provenen d’un motlle de DNA, com estan especificades? Hi ha diversos mecanismes que poden dur a terme canvis en les seqüències de RNA.
• RNA guies(=gRNA)→solen tenir un paper central en l’edició dels RNA.
Tenen seqüències que son parcialment complementaries a segments de l’RNA preeditat, i les dues molècules aparellen les bases d’aquesta sequencia. Després de que l’mRNA s’hagi ancorat al gRNA, l’mRNA pateix talls i s’hi afegeixen nucleòtids, es deleccionen o bé s’alteren, d’acord amb el motlle previst per el gRNA. Finalment els extrems de l’mRNA s’uneixen.
• Conversió de bases→amb enzims. Ex. en humans un gen es transcriu a un mRNA que codifica per un polipèptid transportador de lípids conegut com a apoliproteïna-B100 (4563AA) i es sintetitza als hepatòcits. Una forma truncada de la proteïna, l’apoliproteïna-B-48 (2153AA), es sintetitza a les cells intestinals a partir d’una versió editada del mateix mRNA que codifica per la apoliporteïnaB100.
Durant el procés d’edició, un enzim desamina una citosina i la converteix a uracil. Aquesta conversió canvia un codó que específica l’AA glutamina a un codó de terminació, que acaba de manera prematura la traducció, i ens dóna com a resultat una proteïna escurçada.
(resum) • promotor→avarca uns 100 nucleòtids en direcció 5’ respecte al lloc d’iniciació de la transcripció, resulta necessari perquè es produeixi la transcripció, però habitualment no es transcriu quan es transcriuen els gens codificants per proteïnes per acció de la RNA polimerasa II. Més allunyats, en direcció 5’ o 3’ hi poden haver intensificadors (=enhancers) que regulen la transcripció.
-en el procés de transcripció tots els nucleòtids entre el lloc d’iniciació i el lloc de terminació de al transcripció es transcriuen a pre-mRNA, entre ells exons, introns i l’extrem 3’ llarg que més endavant es talla. (A l’extrem 5’ hi ha la 5’UTR i a 3’ el 3’UTR).
-en pre-mRNA es processa per donar lloc a un mRNA madur. El primer pas del processament és l’adició de un asquet a l’extrem 5’ del pre-mRNA. Després, l’extrem 3’, es talla en un lloc downstream respecte la sequencia concens AAUAAA de l’últim exó.
Immediatament despres se li afegeix una cua poli(A) a l’extrem 3’.
-introns s’eliminen per donar com a resultat un mRNA madur. L’mRNA conté ara les regions 5’ i 3’ UTR, que no es tradueixen a AA, i els nucleòtids que porten les seqüències codificants de proteïnes.
TRNA • molècula que transporta els AA al ribosoma i interactua amb els codons de l’mRNA, col·locant els AA en l’ordre adequat durant la síntesi proteica. Serveix com a enllaç entre el codi genètic de l’mRNA i els AA que constitueixen una proteïna.
• cada tRNA només s’uneix a un AA específic i el porta fins al ribosoma on l’afegeix a la cadena polipeptídica creixent en la posició especificades per les instruccions presents en l’mRNA.
• tRNAAla=tRNA que s’uniex i l’AA Alanina.
• estructura -bases modificades→tots els RNA tenen 4 bases estàndard (A,G,C i U), els tRNA tenen bases addicionals que inclouen ribotimina, seudouridina, etc. Aquestes bases les adquireixen per enzims modificadors del tRNA.
-l’estructura dels tRNA són similars, tenen entre 74 i 95 nucleòtids, complementaris entre si i formen ponts d’hidrogen intramoleculars, com a resultat, cada tRNA té una configuració de trèvol.
1. braç acceptor 2. braç TΨC→Ψ=seudouracil. 3 nucleòtids d’aquest braç formen l’anticodó, que s’aparella amb el codó corresponent de l’mRNA per assegurar que els AA s’enganxin en l’ordre correcte.
3. braç anticodó 4. braç DHU→conté la dihidrouridina (base modificada) Cada molècula de tRNA es plega en forma de fulla de trèvol degut a l’aparellament de les bases completaries, les fulles de trèvol no és l’estructura tridimensional (terciària) dels tRNA que es troben en les cells. Estudis amb cristal·lografia de raigs X han demostrat que la fulla de trèvol es plega sobre si mateixa adoptant forma de L.
• processament dels gens del tRNA→igual en eucariotes i procariotes.
-els gens que produeixen els tRNA poden estar dispersos o agrupats en el genoma i poden estar presents en una sola còpia o en vàries. Però totes les molècules de tRNA patiran un processament posterior a la transcripció, diferent per cada cas de tRNA, no hi ha un processament genèric.
-eucariotes: Hi ha dos tipus de gens de rRNA: un de gran que codifica per rRNA 18S, 28S i 5,8S ; i un de petit que codifica per l’rRNA 5S.
-procariotes: rRNA 23S, 16S i 5S, codificats per un únic tipus de gen.
→(foto). En E.coli, el producte immediat de la transcripció és un precursor de rRNA 30S. Aquest es metilat en varis llocs i després es escindit i tallat per produir rRNA 16S, 23S i 5s, juntament amb un o més tRNAs.
-els rRNA eucariòtics pateixen un processament semblant. Els RNA nucleolars petits (snoRNA) ajuden a tallat i modificar els rRNA i els col·loquen en ribosomes madurs. Els snoRNA s’associen amb les proteïnes per formar snoRNP (semblant al cas de l’splicing).
-el processament del’rRNA i la seva col·locació al ribosoma passa dins del nuclèol.
1.els grups metil s’afegeixen a les bases especifiques i a l’àtom de C2 d’algunes riboses. 2. L’RNA es talla, formant varis intermediaris. 3. I es talla 4. El resultat són les molècules madures de rRNA *estructura del ribosoma→orgànul molt abundant, tenen el 80% de l’RNA total de totes les cèl·lules. Són complexos i estan formats per més de 50 proteïnes diferents i molècules de RNA (quadre→).
Un ribosoma funcional consta de dues parts: 1. subunitat ribosòmica gran formades per una o més parts de RNA i varies proteïnes 2. subunitat ribosomica petita -les dimensions dels ribosomes i els sues RNA corresponents es mesuren amb Svedberg (S) (=mesura de quant ràpid sedimenta un objecte en un camp centrífug).
...