Tema 9 - Mètodes de genotipat múltiples (2016)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Genética - 3º curso
Asignatura Diagnòstic Genètic Molecular
Año del apunte 2016
Páginas 14
Fecha de subida 16/04/2016
Descargas 23
Subido por

Vista previa del texto

Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Tema 9 - Mètodes de genotipat múltiple SISTEMES DE GENOTIPAT – Generalitats Hi ha més de 100 mètodes diferents de genotipat. Les característiques generals de tots ells són: - Alta capacitat de genotipat (nº genotips/dia).
Capacitat de multiplexing (genotipat múltiple).
Baixa tassa d’error.
Sistema automàtic d’assignació dels al·lels.
Preus assequibles.
Els protocols generals que se segueixen són: 1. Amplificació del fragment diana. Per fer això hi ha un gran nombre de mètodes i tècniques disponibles. No hi ha un mètode en concret que sigui l’ideal. El producte a analitzar s’obté per amplificació amb PCR.
2. Discriminació dels dos al·lels. Per discriminar les formes al·lèliques se solen utilitzar 4 estratègies. Normalment es dissenyen per SNPs bial·lèlics.
a. Ús de tècniques enzimàtiques.
i. Extensió específica de l’al·lel de l’encebador.
ii. Lligació d’oligonucleòtids (un d’ells específic d’al·lel).
iii. Talls enzimàtics específics d’al·lel.
b. Ús d’oligos com a sondes (Taqman assay, microarray).
i. Hibridacions específiques d’al·lel (ASOH).
3. Identificació del producte específic d’al·lel. Per fer això els mètodes més usuals per a la detecció són: a. Espectrometria de masses.
b. Fluorescència.
c. FRET.
d. Luminiscència.
El format de l’assaig pot ser: a. Sòlid.
i.
Ús d’un suport sòlid.
b. Homogeni.
i.
Tots els reactius junts.
c. Semi – homogeni.
i.
Els reactius s’afegeixen seqüencialment.
203 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Es combinen diferents estratègies amb diferents combinacions; hem d’escollir una estratègia de discriminació, un mètode de identificació i un format de l’assaig. Veiem un exemple de les múltiples combinacions d’estratègies: Veurem les tres primeres.
ESTRATÈGIA DE DISCRIMINACIÓ EXTENSIÓ ESPECÍFICA D’AL·LEL DE L’ENCEBADOR És la primera tècnica que es va utilitzar. En funció de si l’extrem 3’ del primer és complementari amb la nostra seqüència a analitzar, hi haurà o no amplificació.
204 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Miniseqüenciació La tècnica més típica és la miniseqüenciació (mini perquè seqüencia de 1 a 3 nucleòtids). La base d’aquesta tècnica és la incorporació d’un didesoxirribonucleòtid específic a l’extrem 3’ d’un encebador. D’aquesta manera, quan s’uneixen els desoxiribonucleòtids es para la síntesi.
Així doncs, dissenyarem un encebador que quedi adjacent a la mutació que volem detectar per l’extrem 3’. La polimerasa, en funció del DNA motlle que tinguem (amb o sense la mutació), hi incorporarà un nucleòtid o un altre. Quan aquest s’incorpora, la síntesi s’atura. El nucleòtid que s’incorpora depèn del DNA motlle.
La detecció del nucleòtid dependrà del mètode de discriminació que triem: SNaPshot Aquest mètode utilitza la detecció fluorimètrica + electroforesi capil·lar.
S’incorporen 4 desoxiribonucleòtids marcats cada un amb fluorocroms diferents. En funció del nucleòtid que s’introdueixi, en l’electroforesi capil·lar es llegirà en una longitud d’ona o en una altra. Jugant amb la grandària i composició de bases, podem estudiar i detectar múltiples polimorfismes (cadascun estarà en una posició diferent) tot variant la llargada de l’encebador de seqüenciació. En funció de la posició del pic sabrem en quina posició està el polimorfisme, i en funció de la longitud d’ona, quin nucleòtid hi ha.
205 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 En cas d’heterozigot, tindrem dos pics corresponents als dos nucleòtids que hi ha per cada al·lel.
Mass EXTEND Aquest sistema és semblant a l’anterior, també usarem un espectròmetre de masses que mesuri la massa de l’encebador. La diferència és que aquest mètode utilitza només un desoxiribonucleòtid marcat, mentre que els altres no estan marcats, són normals. Llavors es diferenciaran les masses dels productes obtinguts.
En l’exemple, en l’al·lel 1, tenim TTA. Quan es detecti la primera T, s’incorporarà desoxiadenina i es pararà la síntesi. En canvi en l’al·lel 2,tenim CTA. Quan es troba la C incorpora guanina i no es pararà la síntesi perquè el nucleòtid és normal. Llavors, s’introduieix un segon nucleòtid i ja sí que es para la síntesi perquè és una T.
Per tant en cadascun dels al·lels amplificats, hi haurà un nombre diferent de nucleòtids (23 o 24). D’aquesta manera, en l’espectrofotòmetre, com que els fragments són de diferent longitud, el pic estarà en posicions diferents (l’espectrofotòmetre pot discriminar diferències en un nucleòtid).
En els gràfics tenim els pics que ens apareixen per homozigots per l’al·lel 1, pel 2 i pels heterozigots.
206 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 A més, els pics dels encebadors que no han allargat també ens poden aparèixer.
En un anàlisi de múltiples SNPs alhora, obtindríem un gràfic com el següent: 207 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 LLIGACIÓ D’OLIGONUCLEÒTIDS Un altre mètode de discriminació és el de lligament d’oligonucleòtids basat en l’especificitat d’algunes lligases com la del bacteriòfag T4, que necessita una complementarietat dels extrems 3’ i 5’ perfecte. Si un dels dos oligos que hibriden adjacents està desestabilitzat no lligarà, ja que és una complementarietat molt precisa.
L’extrem 3’ dels oligos el fem coincidir amb el nucleòtid polimòrfic.
En l’exemple, tenim un SNP C/T. Dissenyem 3 encebadors: dos d’ells seran específics i en l’extrem tindran la seqüència complementària (un al·lel portarà la G i un altre la A).
L’especificitat doncs està en l’extrem 3’, que és el que coincideix amb el punt de la mutació. El tercer encebador és comú a les dues mutacions, i s’uneix a les seqüències dels dos al·lels.
Llavors, un cop hibrida un dels dos i la complementarietat en aquesta regió és perfecta, lliga també la part comuna que tenen els dos oligos, la part taronja. Així doncs, si hi ha lligació, l’oligo queda més gran.
Per discriminar el producte el que fem és o bé usar oligos específics d’al·lel de diferent grandària (en l’exemple un té un tros vermell de més) o bé els marquem amb fluorocroms diferents (en l’exemple un blau i un verd). Així discriminem quin dels dos és el que ha lligat.
SNPlex SNPlex és una plataforma pel genotipat de SNPs de la casa comercia Applied Biosystems (ABI). SNPlex utilitza la detecció indirecta a través d’oligos específics; per discriminar quin dels dos oligos ha lligat i amplificat, introdueix abans de l’encebador unes seqüències especíiques pròpies de la casa comercial, les quals estan codificades. A més, en l’extrem de cada un hi trobem seqüències que complementen amb els encebadors universals, de manera que quan amplifiqui només ho facin els oligos que hagin lligat.
L’encebador que correspon a l’extrem de l’oligo en comú està conjugat amb biotina.
D’aquesta manera, el producte amplificat es pot fixar en uns micropouets que la superfície dels quals esta recoberta amb estreptoavidina.
208 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Un cop amplifica, tenim el producte amb una superfície coberta d’aquest compost que retindrà els productes amplificats que en l’extrem tinguin biotina.
Desnaturalitzem, fem rentats i ens quedaran els oligos que hagin lligat.
En l’electroforesi capil·lar, podrem diferenciar els SNPs perquè tenen un recorregut electroforètic diferent. Si ens surt un pic correspondrà a un homozigot, si ens en surten dos, a un heterozigot.
També podem fer un anàlisi múltiple. Per cada parell d’oligos obtindrem un pic diferent en l’electroforesi capil·lar. En aquest cas tenim dues maneres diferents de detectar de quin SNP es tracta; detecció del fluorocrom o detecció de la grandària del producte. En ambdós casos, en funció d’on caigui el pic sabrem a quin SNP correspon.
209 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 A més també poden saber la mobilitat de cada un d’ells.
HIBRIDACIONS ESPECÍFIQUES D’AL·LEL Microarrays d’àcids nucleics Els suports porosos no permeten gran densitat de spots per centímetre quadrat i precisen de l’ús de grans quantitats de material a analitzar; absorbeixen gran quantitat de líquid, i per això necessitem molta quantitat de sonda i ens trobem amb la limitació de la densitat de sonda per superfície. El vidre permet major densitat i menor quantitat de material a analitzar.
L’ús d’un sistema d’anàlisi per fluorescència i de les tècniques fotolitogràfiques usades en la indústria dels semiconductors permeten una anàlisi molt sensible d’un nombre elevat d’informació.
Un microarray no és més que un dot blot revers, ja que es basa en fixar la sonda sobre la superfície.
Un array d’àcids nucleic consisteix en un conjunt de sondes de seqüència coneguda disposades en unes posicions fixes sobre un suport sòlid.
Podem usar microarrays de DNA/cDNA (van bé per l’expressió del DNA) i de nucleòtids (van bé pel genotipat). Els primers són més econòmics.
210 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Microarrays d’oligonucleòtids Les tècniques cromatogràfiques poden sintetitzar in situ les diferents sondes, i així podem repartir diferents oligosondes en diferents posicions.
211 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Aplicacions de la tecnologia dels microarrays En la següent taula tenim exemples de les aplicacions actuals de la tecnologia esmentada. Hi ha diferents tipus, per diferents propòsits, amb diferents aplicacions... etc.
Els micorarray per l’anàlisi d’SNPs no estan pensats per detectar noves variants; són SNPs determinats i coneguts, serveix per determinar quin haplotip té un individu. També serveixen per detectar LOH en un tumor, però sempre que es tracti d’un SNP en concret (va directament a buscar aquest SNP).
També trobem micorarrays de hibridació genòmica comparada.
Microarrays de reseqüenciació Imaginem que volem la seqüència remarcada en blau. Farem 4 blocs d’oligonucleòtids però canviant en cada un el nucleòtid central. Generem doncs 4 blocs de sondes idèntiques excepte pel nucleòtid que ocupa la posició central que, si recordem, és el que genera la màxima inestabilitat).
Si la posició es correspon, hi haurà hibridació. El primer nucleòtid és una A, per tant hibridarà amb la sonda que contingui una T.
Ara correm una posició i pel següent nucleòtid fem el mateix; generem de nou 4 blocs d’oligos que variïn en el nucleòtid de la posició central. En la posició que ja hibridat ara els blocs tindran una T. I així successivament.
212 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 En el blot de sondes obtenim un senyal que indica cada parell de nucleòtids que han aparellat per cada posició.
213 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Nosaltres dissenyarem unes sondes específiques de la seqüència a analitzar complementàries per una i altra variant al·lèlica, variant la posició del SNP. Si tenim la variant 1, les hibridacions seran molt més fortes per un dels 4 blots, el que complementi a la perfecció. Els altres seran inestables, tindran una hibridació molt més dèbil.
Tots els que donen senyal en la part remarcada en blau del blot és perquè la hibridació és perfecta. Tots els que donen senyal en la part remarcada en lila del blot és perquè la hibridació no és perfecte en un punt. Per tant la unió és més dèbil en la part lila.
Els blots homozigots per G/G donaran un patró de senyals que correspondrà al patró de senyals d’homozigots per T/T invertit verticalment.
214 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Quan l’aparellament és imperfecte, els extrems ens serveixen de control. En l’heterozigot, les files superior i inferior no hibridaran perfectament.
Aquesta tècnica ens permet analitzar múltiples loci.
CGH microarrays En els CGH, detectem guanys o pèrdues cromosòmiques.
Podem detectar duplicacions o delecions en funció de si el senyal és verd o vermell. Ho detectem sobre cromosomes metafàsics.
Obtindrem variacions d’intensitat d’un o altre fluorocrom.
215 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 També podem analitzar cromosoma per cromosoma, obtenint bandes en verd/vermell que indicaran pèrdues/guanys.
El nivell de resolució d’aquesta tècnica és bastant baix perquè depèn de l’estructura cromosòmica. La resolució és de l’ordre d’ 1 Mb.
216 ...

Comprar Previsualizar